土壤稀释涂布平板法
实验概要
分离、纯化及初步鉴定土壤中的拮抗植物病原菌的放线菌。
实验原理
土壤是微生物的“天然培养基”，也是最丰富的菌种资源库，我们可以从中分离出众多放线菌，尤其是可以从耕作土壤中筛选出拮抗植物病原菌的放线菌。
以耕作有武运粳和苏沪香粳的土壤为样品，应用稀释涂布平板法分离各种微生物。菌落计数后，通过菌落形态观察并挑取放线菌进行划线分离纯化，多次重复后得到单菌落。在进行放线菌形态等初步鉴定后，将纯化的菌株接入斜面传代保藏。最后，分离纯化的放线菌，初步鉴定其拮抗性。
拮抗植物病原菌的放线菌的分离纯化在农业增产、作物种植等方面都有着重要的意义。
主要试剂
1. 培养基：
高氏1号培养基、马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基
2. 其他试剂：
银染液A液B液（细菌鞭毛染色） 40%KOH 5%α-萘酚（V.P.实验）
主要设备
培养皿
试管
锥型瓶
接种环
移液管
震荡器
电炉
载玻片
超净工作台
恒温培养箱
高压蒸汽灭菌锅
显微镜等
实验材料
土样：
苏沪香粳1，2组
杨稻6号93113，4组
武运粳5，6组
实验步骤
1.稀释涂布平板法(Spread Plate Method)
稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养而进行微生物分离纯化的方法。
(1) 倒平板；
(2) 制备土壤稀释溶液连续不断稀释，得到不同稀释度的土壤溶液；
(3) 涂布分别吸取三种稀释度菌液，均匀涂于培养基表面；
(4) 培养；
(5) 划线分离，直到获得纯培养。
2. 平板菌落计数法
平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。
这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。
对每个平板上的菌落计数，计算每克或每毫升土壤样品中含有细菌、放线菌的数量。公式如下：
菌体数量cfu/g（mL）土样== 同一稀释度重复的菌落平均数×稀释倍数
3. 平板划线分离法（Streak Plate Method）
平板划线分离培养法对混有多种菌的平皿，用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料,在无板表面进行平行划线和培养，使原来混杂在一起的菌种沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。
(1) 倒平板；
(2) 划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线，从而将样品在平板上进行稀释，形成单个菌落；
(3) 挑菌落同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。
4. 插片显微观察法（放线菌）
插片培养法是实验室观察放线菌形态的一种基本方法，其步骤是：挑取青铜小单孢菌（Micromonospora chalcea）的少量孢子丝，将菌丝块接种于高氏一号培养基的中间，然后，用小镊子夹起一块无菌的盖玻片，以45度角的角度斜插入培养基中，不要插入培养基太深，让菌丝爬上盖玻片；于37℃下培养3～5天后，再用小镊子将盖玻片取出，显微镜下观察基内菌丝、气生菌丝和孢子丝的形状。
5. 斜面传代保藏法
斜面传代保藏法是指将菌种（细菌和酵母菌宜采用对数生长期细胞，放线菌和丝状真菌宜采用成熟的孢子）接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。
保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种1次。酵母菌2个月，移种1次。细菌最好每月移种1次。
此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。
6. 放线菌形态观察
(1) 放线菌菌落观察
放线菌的菌落质地致密，表面呈紧密的绒状，或坚实、干燥而多皱。由于基内菌丝长在培养基内，所以菌落与培养基结合较紧，不容易被挑起，或者被挑起后不容易破碎。当孢子丝形成大量孢子布满菌落表面时，使菌落呈絮状、粉末状或颗粒状，而与细菌菌落判然有别。此外，如用放大镜仔细观察，可以看见菌落周围有放射状菌丝。
(2) 放线菌主要通过形成无性孢子的方式进行繁殖。其孢子丝成熟时，分化形成许多孢子，称为分生孢子。分生孢子常具色素，呈白、灰、黄、橙黄、红、蓝、绿等颜色。
稀释涂布平板法计数公式
本文格式为Word 版，下载可任意编辑 第 1 页 共 1 页 稀释涂布平板法计数公式 “微生物数量测量”是2017年高考大纲中的新内容，也是教学中的重要难点。稀释涂板 法是计数微生物的常用方法，用于计数样品中活菌的数量。当样品的稀释度足够高时，在培 养基表面上生长的菌落来自样品稀释液中的活细菌。通过计算平板上的菌落数，我们可以猜 测样品中有多少种活细菌。 但是，菌落计数结果的处理常常成为学生容易出错的地方。典型示例：在从土壤中分离 产生脲酶的细菌的实验中，将10g 土壤样品溶液进行梯度稀释，并将0.1mL 稀释倍数为105 的土壤样品溶液接种在三个中板上。培养一段时间后，平板上的细菌菌落数分别为42、200 和256。1g 土壤样品中的细菌数为。 在PEP 高中生物学选修课“生物技术实践”中，有这样一条陈述：用稀释包被板法计数 菌落：为了确保结果的准确性，菌落数在30到30之间通常选择300和300进行计数。但是， 如果我们理所当然地认为42、200和256个数据都在30?300范围内，那么直接对它们求平均 并乘以稀释倍数就可以得出错误的结果1.66×108。这也是许多学生犯错误的原因。 实际上，教材中的相关表述仅说明了可计数菌落数的适当范围。在一定稀释度下，三个 平板中的菌落数不能简单地直接平均，应注意稀释度的设定和计数结果的允许差异。 为了确保准确确定有效活菌计数，必须设置三个稀释度并进行分级，并且每个梯度应设 置三个重复。为了确定土壤中细菌的数量，通常使用104、105和106倍的稀释剂进行平板培 养。为了确定放线菌的数量，通常使用103、104和105倍的稀释度。为了确定真菌的数量， 通常使用102、103和104倍的稀释度。 如果平板中的菌落数太少，必然会导致计数误差太大；相反，如果培养皿中的菌落太多， 将导致计数困难。因此，世界上菌落计数的基本原理是对稀释的平板进行计数，其中平板上 有30?300个菌落。同时，相同稀释度重复3次的平板上菌落数的标准差应小于允许的差。也 就是说，在平板计数试验中，如果在相同稀释度下三个重复菌落的数量在30?300之间，但是 数据相差很大，则需要将其丢弃。 如果在平板上重复3次的平均菌落数少，则容许误差也小。相反，如果平均菌落数较大， 则允许误差将较大。如果选择了适当的稀释计数，则三个重复的标准差应小于规定的允许差。 如果三个重复的标准差大于指定的允许差，则无法正确计算它们，必须重新测量。
土壤稀释涂布平板法实验报告
土壤稀释涂布平板法实验报告 一、实验目的 本实验旨在通过土壤稀释涂布平板法，了解土壤中细菌总数及不同细菌群落的数量和 结构，以分析不同土壤样本中微生物多样性。 二、实验原理 土壤稀释涂布平板法是一种常见的微生物计数方法。通过将土壤样品在一系列不同浓 度的液体稀释后，将其均匀涂布在含有富营养培养基的平板上，使微生物在培养基上生长。在培养时间后，通过对平板上不同生长的菌落形态、颜色进行观察和编号，计算出不同土 壤样品中微生物的总数和不同菌群落的丰度和多样性指数。 三、实验过程 1.准备土壤样品：从不同地点收集5份土壤样品，并混合均匀，制备出一份混合土壤 样品。 2.制备稀释液：取10ml的稀释液管，加入9ml的无菌蒸馏水，再加入1ml的土壤样品，轻轻震动均匀。 3.制备平板：取富含营养的琼脂，于100℃高压灭菌后，冷却至50℃左右，倒入培养 皿中，放置平板机中。 4.涂布：在培养皿表面均匀涂布1ml的上述稀释液，旋转培养皿，使其充分涂布。 5.反复稀释：将起初的土壤样品经反复稀释后，制备出稀释液100、1000、10000等多个浓度的稀释液，分别涂布至琼脂平板上，进行培养。 6.培养：将制作好的平板在恒温培养箱中，以30℃恒温培养48h。 7.观察：观察不同菌落形态、色泽，并执行数量统计和分析。 四、实验结果 1.菌落计数和统计：通过实验，我们制备了稀释液100、1000、10000等多个浓度的稀释液，并分别涂布至琼脂平板上，进行培养。培养后，我们对不同菌落形态、色泽进行观察，并进行数量统计和分析。根据实验数据，我们得出了以下结果： （1）在稀释液100下，我们共计算出了50个菌落，其中以白色为主，数量较多；
实验四、土壤中放线菌的分离
实验四、土壤中放线菌的分离 一、实验目的 1、从土壤中分离、纯化放线菌；初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。 2、了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。 二、实验内容 筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。迄今为止，已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。土壤中放线菌最丰富，品种齐全。通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。 对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。 土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。 注：从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。 三、实验原理、方法和手段 原理一：稀释涂布平板法；如图1。 原理二：对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量； 原理三：向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长，但不影响放线菌的生长。 图1 稀释涂平板法示意图
土壤稀释涂布平板法
实验概要 分离、纯化及初步鉴定土壤中的拮抗植物病原菌的放线菌。 实验原理 土壤是微生物的“天然培养基”，也是最丰富的菌种资源库，我们可以从中分离出众多放线菌，尤其是可以从耕作土壤中筛选出拮抗植物病原菌的放线菌。 以耕作有武运粳和苏沪香粳的土壤为样品，应用稀释涂布平板法分离各种微生物。菌落计数后，通过菌落形态观察并挑取放线菌进行划线分离纯化，多次重复后得到单菌落。在进行放线菌形态等初步鉴定后，将纯化的菌株接入斜面传代保藏。最后，分离纯化的放线菌，初步鉴定其拮抗性。 拮抗植物病原菌的放线菌的分离纯化在农业增产、作物种植等方面都有着重要的意义。 主要试剂 1. 培养基： 高氏1号培养基、马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基 2. 其他试剂： 银染液A液B液（细菌鞭毛染色） 40%KOH 5%α-萘酚（V.P.实验） 主要设备 培养皿 试管 锥型瓶 接种环 移液管 震荡器 电炉 载玻片 超净工作台 恒温培养箱 高压蒸汽灭菌锅 显微镜等 实验材料
土样： 苏沪香粳1，2组 杨稻6号93113，4组 武运粳5，6组 实验步骤 1.稀释涂布平板法(Spread Plate Method) 稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养而进行微生物分离纯化的方法。 (1) 倒平板； (2) 制备土壤稀释溶液连续不断稀释，得到不同稀释度的土壤溶液； (3) 涂布分别吸取三种稀释度菌液，均匀涂于培养基表面； (4) 培养； (5) 划线分离，直到获得纯培养。 2. 平板菌落计数法 平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。 这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。
稀释涂布平板法原理
稀释涂布平板法原理 稀释涂布平板法是以涂布平板（DPP）技术为基础，将蛋白质或碳水化合物稀释溶液均匀地涂布在一个平板上，再经过烘干以获得具有高灵敏度的蛋白质或碳水化合物样品的分析方法。稀释涂布平板法的最终目的是通过检测样品中的活性，得到样品的成分及含量，从而有效获取分析结果。 稀释涂布平板法工艺主要包括以下几个步骤：首先，将蛋白质或碳水化合物标本稀释成相同浓度的溶液；其次，将溶液均匀的涂布在涂布平板上；再次，将涂布后的涂布平板放入烘干箱，以自动烘干室温至所需；最后，将稀释后的样品放入检测仪器，进行成分及含量的测定。 稀释涂布平板法的优点主要有以下几个方面：首先，样品涂布均匀且节省人工；其次，操作简单，快速方便；再次，样品分析灵敏度高，反应时间短；最后，可以连续分析数个样品，反复实验，提高分析效率。 稀释涂布平板法在生物医药分析领域广泛应用，已成为医药检测领域中不可缺少的分析方法。在医学研究中，它可以用于检测血清中的抗体程度；在食品分析中，它可以用于检测食品中的污染物及添加剂；在医药制造中，它可以用于检测制剂中的有效成分含量。 稀释涂布平板法的应用不仅仅限于上述几个领域，还可以用于检测有机物，特别是有机污染物的检测。例如，它可以用于检测水体中的微量有机污染物，如挥发性有机化合物和氯代烃；也可以用于检测
空气中的有机污染物，如多氯联苯、六六六和其他高毒有机物。此外，它还可以用于检测土壤中的有机污染物，如多氯联苯、苯胺和其他有机物。 综上所述，稀释涂布平板法是一种快速、准确、可重复性高的检测方法，可有效地检测多种蛋白质或碳水化合物、有机污染物等物质，在生物医药领域得到广泛应用。
稀释涂布平板法操作步骤
稀释涂布平板法操作步骤 稀释涂布平板法是一种常用的微生物计数方法，适用于许多不同类型的样品，包括食品、饮料、水和环境样品。该方法的优点在于简单易行、成本低廉、适用范围广泛，因此被广泛应用于微生物质量控制和卫生监测等领域。本文将介绍稀释涂布平板法的操作步骤。 一、实验室准备工作 1.1 实验室环境应保持清洁、干燥、无尘、无霉菌。 1.2 实验室操作台、器皿、试剂应清洗干净，消毒处理。 1.3 实验室应备有必要的设备和器具，如移液器、量筒、加热器、平板计数器等。 1.4 实验人员应穿戴干净、无菌的实验服装和手套。 二、样品处理 2.1 样品应选择代表性、均匀的样品，并按照要求采集。 2.2 样品应在规定时间内送达实验室，尽快进行处理。 2.3 样品应在处理前进行预处理，如过滤、破碎、稀释等。 三、制备平板 3.1 准备平板培养基，根据需要加入适当的抗生素或选择性因子。 3.2 将平板培养基加热至沸腾，然后冷却至适宜的温度（通常为45-50℃）。 3.3 取出所需数量的平板，并在加热器中加热到适宜的温度（通常为50-55℃）。 3.4 将培养基均匀地倒入平板中，使其均匀分布在整个平板上。
3.5 等待培养基凝固，然后将平板盖上保鲜膜，标记样品信息和处理日期。 四、制备稀释液 4.1 根据需要选择适当的稀释液，如生理盐水、PBS等。 4.2 在移液器中取出一定量的稀释液，并将其分别加入试管中。 4.3 按照所需的稀释倍数，将样品加入试管中。 4.4 用移液器充分混合样品和稀释液，得到稀释液。 五、涂布操作 5.1 取出所需数量的平板，并在平板计数器中放置平板。 5.2 在平板上涂布稀释液，涂布方法可以选择倾斜涂布、十字涂布、螺旋涂布等。 5.3 涂布后将平板盖上保鲜膜，并在适宜的温度下培养。 5.4 培养时间和温度根据不同的微生物和样品而定，一般为 24-48小时。 六、计数和统计 6.1 在培养结束后，使用平板计数器进行计数，记录每个平板上的菌落总数。 6.2 根据涂布稀释倍数和菌落总数，计算出每毫升样品中的菌落形成单位（CFU）。 6.3 根据菌落总数和样品体积，计算出每毫升样品中的微生物数量。 6.4 统计微生物数量和质量，评估样品的卫生状况和质量。
土壤中放线菌的分离
土壤中放线菌的分离 实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。 2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。实验材 料： 药品：可溶性淀粉、KNO 3、NaCI = K 2HPO 4?3H 20、MgSO 4?7H 20、FeSO 4?7H 20、琼脂。 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、锈子、玻璃铅笔。 实验原理： 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO 3、NaCI ・ K
2HPO 4?3H 20、MgSO 4?7H 20作为无机盐，FeSO 4?7H 20作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120C热处理 1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 实验步骤： 1 •咼氏一号合成培养基的制备 高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用） 可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g, K2HPO4?3H2O0.5g MgSO4?7H2O0.5g，FeSO4?7H2O 0・01g,琼脂20g,水1000ml, pH7.2〜7.4。 配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml ° 112C灭菌20分钟。 2 •土壤中放线菌的分离
微生物的分离和纯化
实验十四微生物的分离和纯化 一、目的要求 掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术。 二、基本原理 在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。 三、器材 高氏1号琼脂培养基，肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10％酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。 四、操作步骤 1．稀释涂布平板法 （1）倒平板将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至55—60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10％酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每毫升培养基中含链霉素30μg。然后分别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板，如图Ⅶ-1所示。最好是将平板放室温2—3天，或 37℃培养24小时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。 （2）制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从
稀释涂布平板法计数公式
稀释涂布平板法计数公式 1问题的提出 “微生物数量的测定”是2017年高考考纲中新增加的内容，同时也是教学的重难点。稀释涂布平板法是对微生物计数的常用方法，用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌。 但对菌落计数的结果处理往往成为学生的易错点。 经典例题：在从土壤中分离产脲酶细菌的实验中，将10g土壤样液梯度稀释，在3个培养基平板上均接种稀释倍数为105的土壤样液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为42、200、256。则1g土壤样品中的细菌数量为▲个。 很多学生得出的答案为：1.66×108。同时，学生对于42这个数据如何处理存在疑问：是否需要舍弃？ 如果需要舍弃，标准是什么？ 2菌落计数的基本原则 2.1教材中的相关表述 在人教版高中生物学选修1《生物技术实践》中，对于稀释涂布平板法计数菌落有如此的表述：为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。但是，若想当然地认为42、200、256三个数据均处于30~300范围之内，然后直接求平均值，再乘以稀释倍数，就会得出1.66×108的错误结果。这也是很多学生产生错误的原因。 事实上，教材中的相关表述只是在说明可计数的菌落数量的适宜范围。某一稀释度下的3个平板中菌落数并不能简单地直接求平均值，还应该关注稀释度的设置以及计数结果的允许差。 2.2稀释度的设置及计数原则 为了确保有效活菌数的准确测定，在采用平板计数检测中，必须设3个稀释度且成梯度，每个梯度设3个重复。测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释；测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释。 如果平板中菌落的数量太少，必然会导致计数误差太大；反之，如果平板中菌落数量过多，会造成计数上的困难。因此，国际上通用的菌落计数的基本原则，是以平板上出现30~300个菌落数的稀释平板为计数标准。同时要求，同一个稀释度重复3次的平板上菌落数标准差值应小于允许差值。也就是说，在平板计数检测中，如果同一稀释度下的3次重复菌落数虽然均处于30~300个范围之内，但数据相差较大，就需要舍弃。 2.3同一稀释度下3个重复的允许差值 标准差的计算公式如下：