遗传学实验指导-氟烷基因检测
实验 PCR-RFLP方法检测特定基因SNP及基因分型
【实验背景】
SNP（Single Nucleotide Polymorpgism），单核苷酸多态性，指DNA发生了单个碱基的变异。这种变异可能会引起性状的改变或者导致疾病的发生。如猪的兰尼定受体(Rynodine receptor, RYR1) 基因CDS序列第1843位碱基“C”突变为“T”，使蛋白第615位精氨酸(Arg,CGC)变成了半胱氨酸(Cys, TGC)，引起蛋白结构和功能改变，这种改变能够引起猪的应激敏感综合征。猪在应激情况下，如长途运输、屠宰等，会对应激原刺激过度敏感，猪呼吸急促，心跳亢进，肌肉僵直，机体内水、电解质代谢紊乱，甚至突然死亡。对于商品猪而言，会导致猪肉质量严重下降，如肌肉苍白、质地疏松和有液体渗出等，大大降低了猪肉的经济价值。目前，TT基因型的阳性纯合子个体已经在大多数种猪育种场得到了净化，为合理制定育种规划、减少后代阳性频率提供科学依据。那么TT基因型个体是如何得到净化的？PCR-RFLP则目前检测猪氟烷基因变异及进行基因分型最常用的方法。
【实验原理】
SNP检测方法包括PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction，Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)，SSCP(Single-Strand Conformation Polymor-phism，SSCP)以及SNP芯片等。
RFLP，限制性片段长度多态性，指由限制性酶切位点间的插入﹑缺失﹑重排或点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。
PCR-RFLP是在PCR和DNA序列分析基础上产生的RFLP技术，也可以称为AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）。该方法是通过PCR扩增获得特定DNA片段，然后选择适当的限制性内切酶，对PCR产物进行消化，经过电泳后，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。
猪氟烷基因型的检测是通过PCR获得猪HAL基因包含CDS序列第1843位碱基突变点的DNA片段。当HAL基因未发生突变（CC型），即阴性纯合子，HhaI限制性内切酶（酶切DNA序列是：5’GCG↓C3’）可以识别GCGC序列，包含该酶切位点的DNA片段可以被该酶消化；当两条染色体的C碱基完全突变
为T 时，即阳性纯合子，酶切位点消失，变成5’GTGC3’，不能被HhalI 切割；当为杂合子时，HhalI 限制性内切酶仍可以将其中一条DNA 片段消化。
阴性纯合子示意图：
Ala Val Arg Ala Val Arg ♀♂
HhalI 位点（下划线）
Ser Asn GCC GT G CGC TCC AAC
CGG CA C GCG AGG TTG Ser Asn GCC GT G CGC TCC AAC
CGG CA C GCG AGG TTG
阳性纯合子示意图：
Ala Val Cys Ala Val Cys ♀♂
HhalI 位点发生突变（下划线）
Ser Asn GCC GT G TGC TCC AAC CGG CAC ACG AGG TTG Ser Asn
GCC GT G TGC TCC AAC CGG CAC ACG AGG TTG
杂合子示意图：
Ala Val Cys Ala Val Arg ♀♂
其中一条染色体HhalI 位点发生突变（下划线）
Ser Asn
GCC GT G TGC CGG CAC ACG AGG TTG
Ser Asn
GCC GT G CGC TCC AAC
CGG CAC GCG AGG TTG 495bp 165bp
【实验目的】
1、了解PCR-RFLP 技术原理及其在遗传学研究中的应用。
2、学习PCR-RFLP 技术操作步骤。
【实验仪器与耗材】
1、实验仪器
不同规格移液器，PCR仪，电泳仪，水平电泳槽，电子天平，药品勺，250 mL锥形瓶，称量纸，微波炉，凝胶成像系统，恒温水浴锅，不同规格离心机，等。
2、实验耗材
不同规格一次性Ep管，不同规格一次性Tip头，一次性PE手套，操作板等。
【实验材料与试剂】
1、实验材料
猪耳组织DNA。
2、试剂
（1）PCR反应相关试剂：含有镁离子的PCR缓冲液，特定的上下游引物，dNTP，Taq DNA聚合酶，灭菌双蒸馏水。
（2）凝胶电泳相关试剂：琼脂糖，100×TAE或者100×TBE缓冲液等，DNA 分子量标准，上样缓冲液（6×Loading buffer），溴化乙锭（EB）或者替代物。
（3）酶切相关试剂：HhalI限制性内切酶，酶切缓冲液，等。
【实验步骤】
1 猪基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测
2 猪HAL基因的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
3 猪HAL基因的突变检测（RFLP）（酶切-琼脂糖凝胶电泳）
上述是主要步骤，下面是具体的步骤
1、猪HAL基因的结构分析
登录GenBank或者EBI生物学网站，获得猪HAL基因序列，分析并设计引物，目的片段包括含有CDS序列第1843位碱基。
猪HAL基因序列GenBank登录号为：Sus scrofa breed mixed chromosome 6, Sscrofa10.2，NCBI Reference Sequence：NC_010448.3 (dna)，NM_001001534.1，mRNA。目前，两条特异引物已经广泛用于检测猪HAL基因，该对引物位于第16和18内含子上，PCR扩增范围包括了HAL基因的第17外显子，具体如下：上游引物：5’ TCCAGTTTCC CACAGGTCGT ACCA 3’(1)
下游引物：5’ ATTCACCGGA GTGGAGTCTC TGAG 3’
已有文献报道扩增产物为659 bp，根据登录的参考序列，扩增产物实际为660 bp。而且上游引物与GenBank登录序列存在两处SNP(下划线)：TCCAGTTTGC CACAGGTCCT ACCA (2)，下游引物则完全匹配。由于该对引物已经在多个群体中得到应用，表明存在的两处SNP为低频率突变，并不影响扩增效率。引物由生物公司合成。
2、引物的稀释
首先对合成的引物进行稀释。合成的引物一般是干粉状态，首先需要开启离心管盖前在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟，以防开盖时引物干粉散失。引物的质量一般标以OD值，指1 mL体积1cm光程标准比色皿中，260 nm波长下吸光度为1A260的Oligo溶液定义为1 OD260单位，根据此定义，1 OD260单位相当于33 μg的Oligo DNA。Oligo DNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5，则一条Oligo DNA的分子量=碱基数×324.5。
猪HAL基因上下游引物碱基数各为24，各合成2 OD，则：
每条引物总分子量为：24×324.5=7788；
=2×33=66 μg
=66/7788=0.00847 μmoL=8.47 nM
稀释最终液浓度为：8.47nM/ 847μL=0.01 nM/μL=10 nM/mL，即应加入847 μL 灭菌双蒸馏水进行稀释。
引物稀释液应保存在-20℃，使用时需等溶液完全溶解再使用。
3、PCR扩增猪HAL基因片段
3.1 PCR反应体系的配制
按照如下比例配制，反应体积为20 μL（也可以根据实际情况确定相应的体积）。各成分的初始浓度和用量如下（表1）：
表1 PCR反应体系（20 μL）
成分最初溶度或者含量体积(μL)
5×Buffer（含Mg2+）5× 4
dNTPs 1.6
Taq DNA聚合酶0.2
上游引物10 nM/mL 0.4
下游引物10 nM/mL 0.4
ddH2O 13
总体积20
在配制上述溶液时，一般将除了DNA模板外的所有成分混合，均匀分装到灭菌的用于PCR扩增的Ep管中（0.2 mL规格）。
在分装好的Ep管中加入DNA模板，盖紧盖子，瞬时离心，使各成分混合均匀。
3.2 PCR反应程序
设置如下PCR程序：
首先95 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s进行35个循环，最后72 ℃延伸5 min后冷却到4 ℃。
设置PCR反应程序时，主要是退火温度和延伸时间的设置，退火温度的设置是根据引物的性质进行，而延伸时间是根据扩增DNA片段长度设置，1 kb的延伸时间一般设定1 min。
4、PCR扩增片段的检测
4.1 2%琼脂糖凝胶的配制
用天平称取0.5 g琼脂糖，倒入250 mL的锥形瓶中，加入50 mL的1×TAE 溶液，均匀混合后，微波炉加热2 min，使琼脂糖充分溶解，小心取出（防止烫伤），等温度降至50-60 ℃时，加入1-2 μL的EB或者EB替代物，摇匀后轻轻倒入到专用槽中，防止气泡出现，并插上梳子，等凝胶充分凝固后，备电泳。
4.2 凝胶电泳
将凝胶取出，放在水平电泳槽中，倒入1×TBE溶液，将凝胶完全浸没。然后取3 μL PCR反应产物，并与3 μL上样缓冲液混匀，将其点入梳孔中；同时在其中一梳孔中加入DNA分子量标准，以备。接通电泳仪电源，80V电泳15min，最后关闭电源，紫外灯下或者凝胶成像系统下进行观察或拍照。
5、PCR产物的RFLP
经琼脂糖凝胶电泳检测后，PCR产物可以直接用于RFLP检测。
按HhaI内切酶说明书要求，取10 uL PCR产物，10× Buffer 2 uL，0.5 uL HhaI 内切酶(10U/uL)，加水至20 uL，37℃温育3 h，3％琼脂糖凝胶电泳检测，并拍照。【实验结果的分析】
实验结果的分析就是基因判型，每个个体的基因型判断与频率统计。
根据实验原理及各基因型示意图，三种基因型的电泳条带应该是如下情况：阴性纯合子：495 bp+165 bp （来自父方和母方的两条DNA片段均能够被HhaI内切酶切开）
阳性纯合子：660 bp （来自父方和母方的两条DNA片段均不能被HhaI内切酶切开）
杂合子：660 bp+495 bp+165 bp （其中一条DNA片段能够被HhaI内切酶切开，而另外一条则不能被切开）
最后，统计各个基因型频率，分析群体的HAL基因的净化程度。
【实验注意事项】
1、安全问题是首先需要注意的问题。在本实验中，EB是致癌物质，因此在进行凝胶制作过程中，要戴上口罩、一次性PE手套，并在专用的区域进行操作。使用紫外灯时要注意保护眼睛，不要长时间观看，并防止紫外线直接照射到身体的裸露部位。
2、进行凝胶电泳时，需注意由于DNA携带负电，电泳的方向应是从负极到正极。电泳液的使用不能时间太久，必要时须及时更换电泳液，避免出现不正确的结果。
3、酶切产物较小的片段容易与引物二聚体混淆，如本实验中165 bp DNA 片段，所以较高浓度琼脂糖凝胶可以将目的DNA片段与引物二聚体区分。
4、PCR反应时，要注意PCR仪盖子温度，不能低于变性温度，以保持PCR 反应液不会被蒸发到盖子上。
【思考题】
1、PCR反应体系中Mg2+的作用是什么？
2、SSCP也是鉴定SNP的一种方法，其原理是什么？
3、SNP芯片与传统的SNP鉴定方法区别是什么？
附部分溶液配制
6×Loading buffer:
30mM EDTA
36%(v/v) Glycerol甘油
0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF二甲苯青0.05%(w/v) Bromophenol Blue溴酚蓝
遗传学实验指导
遗传学实验指导 实验1 细胞有丝分裂与减数分裂 实验1.1 植物根尖细胞有丝分裂过程的制片与观察 目的要求 学习和掌握植物细胞有丝分裂制片技术；观察植物细胞有丝分裂过程中染色体的形态特征及染色体的动态行为变化。 实验原理 有丝分裂是植物体细胞进行的一种主要分裂方式。有丝分裂的目的是增加细胞的数量而使植物有机体不断生长。在有丝分裂过程中，细胞核内的遗传物质能准确地进行复制，然后能有规律地均匀地分配到两个子细胞中去。植物有丝分裂主要在根尖、节间、茎的生长点、芽及其它分生组织里进行。将生长旺盛的植物分生组织经取材、固定、解离、染色、压片等处理即可以观察到细胞内的有丝分裂图象。如若需要进行染色体计数，则需进行前处理，即取材之后采用物理的或化学的方法，阻止细胞分裂过程中纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期。这时，染色体不排到赤道板上，而是散在整个细胞质中。这十分便于对染色体的形态、数目进行观察。 试剂和器材 1材料 均可以大蒜(Allium sativum 染色体数目2n=16)、玉米(Zea mays 染色体数目2n=20)、洋葱(Allium cepa染色体数目2n=16)或蚕豆(V icla faba染色体数目2n=12) 等根尖为实验材料。 2试剂 95％乙醇、冰乙酸、石炭酸品红、l mol／L HCl。 3器材 恒温培养箱、显微镜、水浴锅、载玻片、盖玻片、单面刀片、镊子、培养皿、量筒、吸水纸。 操作方法 1生根 植物根尖是植物的分生组织，取材容易，操作方便。植物根尖细胞分裂旺盛，因此，它是细胞有丝分裂相制备与观察的理想选取部位。大蒜、洋葱易于在水培、沙培、土培条件下生根。采用水培时要注意在暗处培养，以满足根生长条件，使根系生长旺盛。玉米和蚕豆种子可先用温水浸泡1天之后，再转入铺有多层吸水纸或纱布的培养皿中，上面盖双层湿纱布置于24～26℃温箱中培养，每天换水二次。 2取材 待根长至l.5~2.0 cm时，将根取下。若实验只需观察细胞有丝分裂的过程和各时期的特征，可将根尖直接放入Carnoy固定液(95％乙醇：冰乙酸=3：1)中固定；如果要观察染色体形态和数目，则必须对根尖进行前处理后才能固定。取材和固定必须要在细胞分裂高峰期进行，即分裂细胞占细胞总数最大值时进行，这样分裂细胞比例大，便于选择和观察。 不同的植物在不同的环境条件，其细胞分裂高峰的时间是不同的。大蒜和洋葱的细胞分裂高峰期通常
遗传学实验
实验一果蝇遗传性状的观察 背景知识 果蝇是在世界各地常见的昆虫,属于昆虫纲,双翅目,果蝇科,果蝇属（Drosophila）。果蝇属有3000多种，我国发现800多种，遗传学研究中通常用的是黑腹果蝇(D.melanogaster)。作为遗传学研究的材料，果蝇具有非常突出的优点。它形体小，生长迅速，繁殖率高，饲养方便；世代周期短（约12天即可繁殖一带）；突变性状多；染色体数目少，基因组小；实验处理十分方便，容易重复实验，便于观察和分析。果蝇的遗传学研究广泛而深入，尤其在基因分离、连锁、互换等方面十分突出，为遗传学的发展做出了突出的贡献。目前果蝇仍然是遗传学、细胞生物学、分子生物学、发育生物学等研究中常用的模式生物。 一、实验目的 1.掌握果蝇的基本特征及鉴别雌、雄果蝇的方法,熟悉常见突变型。 2.了解果蝇生活周期特征及各阶段的形态变化。 二、实验材料 野生型和几种常见的突变型黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）。 三、仪器设备 双筒立体解剖镜，培养瓶（粗平底试管或牛奶瓶）及麻醉瓶（与培养瓶一致的空瓶），白瓷板，毛笔。 四、药品试剂 乙醚，玉米粉，酵母粉，蔗糖，丙酸。 五、实验内容和步骤 （一）生活周期的观察 果蝇是完全变态昆虫，其完整的生活周期可分为4个明显的时期，即卵、幼虫、蛹和成虫（图1-1）用放大镜从培养瓶外即可观察到这4个时期，也可取出用立体解剖镜仔细观察。 果蝇的生活周期长短与温度关系很密切，低温使生活周期延长，生活力减低，高于30℃使果蝇不育甚至死亡。果蝇培养的最适温度为20~25℃，25℃培养条件下果蝇从受精卵到成虫约10天，其中卵和幼虫期5天，蛹4天。成虫果蝇在25℃时约成活15天。 卵：受精卵白色，椭圆型，腹面稍扁平，长约0.5mm，在前端背面伸出一触丝，他能使卵附着在事物上。 幼虫：受精卵经24h就可孵化成幼虫，幼虫经2次蜕皮到第3龄期体长可达4~5mm。肉眼观察可见幼虫一端稍尖为头部，上有一黑色沟状口器。 蛹：幼虫4天左右即开始化蛹。化蛹前3龄幼虫停止摄食，爬到相对干燥的表面（如培养瓶壁），渐次形成一个菱形的蛹，起初颜色淡黄、柔软，以后逐渐硬化变成深褐色，此时即将羽化。 成虫：刚从蛹壳中羽化出来的果蝇，虫体较肥大，翅还未展开，体表也未完全几丁质化，所以成半透明的乳白色。透过腹部体壁还可以观察到消化道和性
遗传学实验指导
《遗传学实验》简介 课程名称：遗传学实验 课程性质：随课实验 课程属性：基础课 学时学分：学时16学分1 面向专业： 一、课程的任务和基本要求 遗传学实验是生物学所有专业的一门专业基础课程，是一门独立的实验课程，同时也是为了配合遗传学的教学而开设的一门实验课程,本课程由基础操作性、综合性和设计性等多层次实验内容构成，目的在于巩固和加深学生对遗传学知识的理解、验证遗传学理论、并初步掌握遗传学研究所必需的基本实验技术。在此基础上，进行一定比例的综合性、设计性实验，将实验理论和实验技能融为一体，从而培养学生的基本实验思想、实验方法、实验技能和综合应用能力。本课程的任务是从个体、细胞水平揭示遗传学的基本现象与规律，培养学生牢固掌握经典遗传学研究方法与技术，并初步掌握现代遗传学实验操作技能，熟悉遗传学分析方法，同时要求学生初步具备进行遗传学创新性研究的基本能力与素质。 二、实验项目 植物染色体核型分析 果蝇的培养及生活史和形态观察 小鼠骨髓染色体的制片及观察 人群中基因频率的调查 人类巴氏小体观察 三、有关说明 1、与其它课程和教学环节的联系 先修课程：动物学、植物学、生物化学、微生物学 后续课程：分子生物学、基因工程、人类遗传学 平行开设课程：细胞生物学 2、教材和主要参考书目 （1）教材：刘祖洞江绍慧遗传学实验高等教育出版社1987年第二版 （2）主要参考书目 ①张文霞等编遗传学实验指导高等教育出版社2005 年版 ②张贵友等编普通遗传学实验指导清华大学出版社2003 年 实验一1、洋葱根尖有丝分裂染色体标本制备及观察（３学时） 一、教学基本要求： 1. 掌握植物染色体压片法。 2. 掌握有丝分裂各时期的特征。 3. 掌握用秋水仙素诱发多倍体的一般方法 二、教学内容： 1、洋葱根尖有丝分裂染色体标本制备及观察 〖目的和要求〗 本次实验通过对植物根尖的制片和观察, 要求学生初步学会对植物组织、细胞的固定、离析和压片方法，了解有丝分裂的全过程及其染色体的动态变化情况,掌握有丝分裂各时期的特征。〖实验原理〗 有丝分裂是细胞均等增殖的过程, 是体细胞分裂的主要方式.在有丝分裂过程中.细胞内每条染色体都能复制一份, 然后分配到子细胞中,因此两个子细胞与母细胞所含的染色体在数目,形态和性质上均是相同的，在各种生长旺盛的植物组织中均存在着有丝分裂。分生组织→固定→解离→染色→压片→观察（间期、早期、中期、后期、末期） 〖材料和方法〗 洋葱或大蒜或种子根尖 水浴锅、显微镜 卡诺氏固定液、石炭酸品红（或醋酸洋红）染色液，1N盐酸（或0.5%果胶酶+纤维素酶）,秋水仙素（0.1%）1、取材：大蒜、洋葱根尖，恒温箱
中国近交系猪的氟烷基因型研究
?异体及异种移植?中国近交系猪的氟烷基因型研究 步 宏1 刘 戟1 李胜富1 程惊秋1 李幼平1 曾养志2 冯书堂3 袁 峰2 【摘 要】 目的 选育猪到人异种移植的供器官猪种和医药实验研究大动物用猪种,首先应筛查其是否易 患猪应激综合征(PSS)。方法 采用聚合酶链反应结合限制性内切酶技术(PCR2RFLP)研究版纳小耳猪近交系(BMI)和近交培育之中的五指山猪(WZSP)的氟烷基因型,筛查其是否有易患猪应激综合征的可能。结果 50头版 纳小耳猪近交系和15头五指山猪氟烷基因型均为阴性纯合子。结论 这两种猪种可望成为猪到人异种移植和医 药实验研究的理想动物。 【关键词】 近交系猪 氟烷基因型 聚合酶链反应结合限制性内切酶技术 异种移植 THE RYR1GENOTYPE OF CHINESE INBRED PIGS BU Hong,LIU Ji,Li Sheng2fu,et https://www.360docs.net/doc/a88828769.html,b.of Transplantation and Immunology,the First University Hospital,West China University of Medical Sciences, Chengdu Sichuan,P.R.China610041 【Abstract】 Objective Porcine stress syndrome(PSS)is one kind of molecular genetics defect diseases of pig which will cause malignant hyperthermia syndrome(MHS)and is the first index should be excluded in screening of a pig species for xenotransplantation.It was reported that mutation of pig rynodine receptor(RYR1)gene is the main reason for PSS.In this study,RYR1genotypes of the Chinese Banna mini pig inbred line and inbreeding closed colony Wuzhishan pig were investigated with polymerase chain reaction2restriction endonuclease fragment length polymophism(PCR2RFLP)technique.Methods Antevenocaval whole blood samples were collected from 50Banna mini2pig inbred2line(BMI),15inbreeding Wuzhishan pig(WZSP)and25Neijiang pigs(NJP)as negative control,the primer were designed and synthesized,PCR reaction was conducted following the sequence of94℃(1 min),58℃(1min)and72℃(1min)for30cycles.The PCR products were digested with restriction endonuclease HhaI and then electrophoresis check.Results A659bp DNA fragment was amplified with these two primers,the HAL NN sample fragment was cut into fragments as493bp and166bp individually after the digestion,indicates no point mutation at site1843in RYR1gene in all tested BMI pig and https://www.360docs.net/doc/a88828769.html,ly,the RYR1genotype of50 cases of BMI and15cases of WZSP were HAL NN,therefore their phenotype is PSS negative.Conclusion It indicates that the genotype of Banna mini pig inbred line and inbreeding Wuzhishan pig are HAL NN therefore PSS absolutely negative,the group penetrance is0.This is consistent with experimental observation.It suggestes that Banna mini pig inbred line and inbreeding Wuzhishan pig may be the alternative donor for xenotransplantation. 【Key words】 Inbred2line pig Rynodine receptor genotype Polymerase chain reaction2restriction endonuclease fragment length polymophism Xenotransplantation Foundation item:National Natural Science Foundation of China(39993430) 猪被认为是异种移植最理想的供器官动物之一,同时也是一种医药研究理想的实验大动物。但某些易患猪应激综合征(porcine stress syndrome, PSS)的猪种不宜选用。PSS是一种猪的分子遗传缺陷疾病,指猪在应激和药物诱导下发生恶性高热综合征(malignant hyperthermia syndrome,MHS),表现为呼吸急促,心跳亢进,肌肉僵直,机体内水、电解质代谢紊乱,甚至突然死亡。传统的方法是采用氟烷吸入的方法来判断猪的应激敏感性,经氟烷吸入 基金项目:国家自然科学基金重大项目资助(39993430) 作者单位:1华西医科大学附属第一医院移植免疫室(成都, 610041);2云南农业大学;3中国农业科学院能诱发MHS者为氟烷阳性猪,反之则为氟烷阴性。已有研究证明,导致猪PSS发生的主要原因可能是猪骨骼肌Ca2+释放通道(calcium release channel, CRC)基因的突变[1]。骨骼肌CRC基因又称兰尼定受体(rynodine receptor,RYR1)基因或氟烷基因(halothane,HAL),氟烷基因是一种使猪对氟烷麻醉剂敏感的基因,该基因定位在猪染色体6p112q21上。目前认为,氟烷基因序列的点突变是PSS的分子遗传学基础,通过对氟烷基因cDNA序列分析,发现其序列中第1843位碱基“C”突变为“T”,使受体蛋白第615位精氨酸变成了半胱氨酸,引起蛋白结构和功能改变[1～3]。采用聚合酶链反应结合限制
遗传学实验课程教学大纲
遗传学实验课程教学大纲 课程名称：遗传学实验Experiment of genetics 课程编号：1313013224 课程类别：专业课 总学时数：33 实验时数：33 学分：1 开课单位：生命科学学院生物综合教研室 适用专业：生物科学 适用对象：本科（四年） 一、课程的性质、类型、目的和任务 遗传学实验课是为加深学生对所学的遗传理论课内容的理解开设的专业必修课，目的是使学生系统学习和掌握现代遗传学实验理论和实验技术，巩固和验证课堂教学内容，培养学生严肃、认真、客观的态度，提高学生的动手能力、综合分析问题、解决问题的能力和理论联系实际的能力，为培养21世纪教学和科研人员奠定基础。 二、本课程与其它课程的联系与分工 本课程与生物化学、微生物学、植物生理学，以及动、植物学，细胞生物学课程均有联系，所以在上述课开出后有利于该课的顺利开出。 三、课程内容及教学基本要求 [1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”； 实验一、大蒜根尖的有丝分裂 有丝分裂各时期动态变化[1]；细胞的固定、解离、压片方法[3]； 实验二、细胞的减数分裂 植物花粉形成中的减数分裂过程[1]；染色体的动态变化[2]；制备减数分裂玻片标本的方法和技术[3]； 实验三、染色体核型分析 染色体核型分析的基本方法[3]；显微摄影技术[1]； 实验四、果蝇生活史及形态观察 果蝇的生活史[1]；果蝇几个突变型的形态特征[3]； 实验五、小白鼠骨髓染色体制片技术 小白鼠骨髓细胞制作染色体标片[3]；空气干燥法基本技术[1]； 实验六、果蝇唾腺染色体的观察 剖取果蝇唾腺技术[3]；制作唾腺染色体标本的方法[3]；多线染色体的特征[2]； 实验七、果蝇的单、双因子杂交、伴性遗传、三点测交实验 果蝇的杂交技术[3]；统计处理方法[3]；伴性遗传和非伴性遗传区别[1]；绘制遗传学图的原理和方法[3]； 实验八、人工诱发多倍体植物
遗传学实验-英文
Genetic Experiment Course code：81070100 Course Title：Genetic experiment Credit: 1.5 Semester classes:5 Teaching object: Profession of all undergraduate students in biology Pre-course: Biochemistry Microbiology Cell Biology Course Director: Zhang Jianmin . Title: Professor. Course Description： The object chiefly include experiments testing basic theory (the meiosis, three basic laws of the Genetics) and branching object (basic experiments of the inheritance of microorganism, the inheritance of quantitative character, the inheritance of population, the inheritance of human, the molecular inheritance and so on). As the students do the genetic experiments and study basic theory so that their ability to analyse and to solve a problem can heighten. Courses assessment: Course final results= Usually results multiplied by 70% + Examination results at the end multiplied by 30%. Designated teaching: Liu Zudong Jiang Shaohui. “Genetic Experiment” 1992. Beijing. Higher Education Press. A list of reference books: Yang Daxiang. “Genetic Experiment”.2004, Beijing. Science Press.
基因工程》课程实验指导书
《基因工程》课程实验指导书 生物技术专业 黄淑坚黄良宗编写 佛山科学技术学院 2005年12月
目录 前言 (Ⅱ) 实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR） (1) 实验二DNA目的片段的回收与DNA的体外连接 (7) 实验三重组DNA的转化 (10) 实验四重组DNA的鉴定 (13) 实验五外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 (16) 实验六表达产物的检测与分析——SDS-PAGE (18) 附录 (22) 参考文献 (34)
前言 基因工程学是以生物化学、分子生物学和分子遗传学等学科为基础而发展起来的一门新兴技术学科，自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展，并广泛应用于医学、农业、工业、水产、环保等行业。本实验指导书在在方法上，力求可行性、实用性，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。 由于基因工程的发展异常迅速，加之编写人员水平有限，难免有疏漏与错误，敬请各位师生批评指正。 编者 2005年12月
实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR） 一、目的和要求 了解反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）基本原理和实验应用，掌握RT-PCR 反应的基本技术。 二、实验内容 RT-PCR扩增猪流感病毒M2基因部分片段。 三、仪器、设备和实验准备 1、仪器 恒温水浴槽、移液枪、EP管、PCR管、超净工作台、PCR仪、电泳仪。 2、试剂 反转录酶、RNA酶抑制剂（RNase Inhibitor）、流感病毒RNA、随机引物、流感病毒M2基因PCR引物、dNTP、Taq酶。 3、实验准备 用RNA抽提试剂盒抽提猪流感病毒RNA。 四、实验原理 RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。 反转录反应是在反转录酶作用下，以RNA为模板指导合成互补的DNA链的过程。反转录反应可以使用反转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成，由这三个基本步骤组成多轮循环。
遗传学实验指导
遗传学实验指导
实验须知 一、实验课的目的 1．培养锻炼科学的思维方法，实事求是的科学态度和严格的科学作风，提高分析问题解决问题的能力。 2．通过实验加深对理论知识的理解，学习掌握基本的实验技术和实验技能，为今后学习和研究打下一定的基础。。 3．培养学生爱好公物，爱护集体，团结互助的优良道德品质。 二、实验课要求 1．课前必须预习，了解基本原理和主要步骤及意义，写出预习报告。 2．上课必须穿白大褂，带实验讲义和实验报告纸。 3．遵守实验室制度，注意安全（水、电、暖、强酸、强碱、有毒物质等）。 4．实验中要正规操作，动手动脑主动进行实验；掌握关键，力求得出准确结果；仔细观察，认真思考，及时做好记录；综合分析得出正确的结果。 5．在实验过程中不诉大声喧哗，有问题及时请教老师或同学。 6．器材、药品等按规定使用，严禁乱用乱放。 7．爱护仪器，在实验过程中因个人未能安实验要求操作而导致的器材损坏，按规章制度进行赔偿。 8．实验结束后，相关器材要彻底清洗干净，放到指定原位。 9．废弃物按要求分类收集、处理。 10．值日生要打扫干净实验台、地面，并负责关好门窗、检查水、电等。 11．因故不能上实验者应有请假手续。
实验1 植物染色体压片技术 一、实验原理 植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。 二、实验目的 学习植物材料的固定方法和常规压片技术；观察染色体的动态变化。 三、实验材料 洋葱（Aillum cepa）根尖 四、实验器具和药品 1．用具：染色板，载玻片，盖玻片，指管，温度计，试剂瓶，滴瓶，镊子，解剖针，毛边纸。 2．药品：无水酒精，70%酒精，冰醋酸，对二氯苯或秋水仙素，醋酸钠，碱性品红，石炭酸，甲醛，山梨醇，二甲苯。 a卡诺固定液的配制：用3份无水酒精，加入1份冰醋酸（现配现用）。 b染色液的配制： 配方Ⅰ.石炭酸品红（Carbol.fuchsin），先配母液A和B。 母液A：称取3g碱性品红，溶解于100mL的70%酒精中（此液可长期保存）。 母液B：取母液A 10mL，加入90mL的5%石炭酸水溶液（2周内使用）。 石炭酸品红染色液：取母液B 45mL，加入6mL冰醋酸和6mL 37%的甲醛。此染色液含有较多的甲醛，在植物原生质体培养过程中，观察核分裂比较适宜，后来在此基础上，加以改良的配方Ⅱ，称改良石炭酸品红，可以普遍应用于植物染色体的压片技术。 配方Ⅱ：改良石炭酸品红。取配方Ⅰ石炭酸品红染色液2-10ml，加入 90-98ml45%的醋酸和1.8g山梨醇（sorbitol）。此染色液初配好时颜色较浅，放置二周后，染色能力显著增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。 1N Hcl ：浓HCl82.5ml→1000ml 五、实验说明 1．有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容易，操作和鉴定方便。根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，有些植物种子难以发芽，或仅有植株而无种子，也可以用茎尖作为材料； 2．植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响分裂周期，对于一个不太熟悉的实验材料，最好在特定温度下长根，掌握有丝分裂高峰期，以便得到更多的有丝分裂的细胞。 3．预处理是降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，让更多的细胞处于分裂中期。预处理的方法有低温预处理和药物预处理。(1)低温预处理将材料浸在蒸馏水中，放在1-4℃冰箱内离体处理24h。此法效果很好，对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀，简便易行，各种作物都适用。(2)药物预处理：①0.05-0.2%秋水仙素溶液与室温下处理2-4h，对抑制纺锤体活动效果明显，易获得较多的中期分裂相，且染色体收缩较直，有利于染色体结构的研究。②饱和对二氯苯溶液室温下处理3-5h，对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好，但对染色体小而多的植物来说不利于染色体的计数。③0.002-0.00mol/L8-羟基喹啉18℃条件下处理5-6h，可以引起细胞粘度的改变，导致纺锤体活动受阻，使中期染色体在赤道面上保持相应的排列位置。缢痕区也较为清晰。一般认为对中等或长染色体的植物较合适。④70ppm放线菌酮和250ppm8-羟基喹啉的混合液于25℃条件
遗传学实验指导-氟烷基因检测
实验 PCR-RFLP方法检测特定基因SNP及基因分型 【实验背景】 SNP（Single Nucleotide Polymorpgism），单核苷酸多态性，指DNA发生了单个碱基的变异。这种变异可能会引起性状的改变或者导致疾病的发生。如猪的兰尼定受体(Rynodine receptor, RYR1) 基因CDS序列第1843位碱基“C”突变为“T”，使蛋白第615位精氨酸(Arg,CGC)变成了半胱氨酸(Cys, TGC)，引起蛋白结构和功能改变，这种改变能够引起猪的应激敏感综合征。猪在应激情况下，如长途运输、屠宰等，会对应激原刺激过度敏感，猪呼吸急促，心跳亢进，肌肉僵直，机体内水、电解质代谢紊乱，甚至突然死亡。对于商品猪而言，会导致猪肉质量严重下降，如肌肉苍白、质地疏松和有液体渗出等，大大降低了猪肉的经济价值。目前，TT基因型的阳性纯合子个体已经在大多数种猪育种场得到了净化，为合理制定育种规划、减少后代阳性频率提供科学依据。那么TT基因型个体是如何得到净化的？PCR-RFLP则目前检测猪氟烷基因变异及进行基因分型最常用的方法。 【实验原理】 SNP检测方法包括PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction，Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)，SSCP(Single-Strand Conformation Polymor-phism，SSCP)以及SNP芯片等。 RFLP，限制性片段长度多态性，指由限制性酶切位点间的插入﹑缺失﹑重排或点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。 PCR-RFLP是在PCR和DNA序列分析基础上产生的RFLP技术，也可以称为AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）。该方法是通过PCR扩增获得特定DNA片段，然后选择适当的限制性内切酶，对PCR产物进行消化，经过电泳后，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。 猪氟烷基因型的检测是通过PCR获得猪HAL基因包含CDS序列第1843位碱基突变点的DNA片段。当HAL基因未发生突变（CC型），即阴性纯合子，HhaI限制性内切酶（酶切DNA序列是：5’GCG↓C3’）可以识别GCGC序列，包含该酶切位点的DNA片段可以被该酶消化；当两条染色体的C碱基完全突变
遗传学实验 减数分裂的制片与观察
实验二减数分裂的制片与观察 PB12210261 徐导 中国科学技术大学生命科学学院 【摘要】 本实验选取玉米雄花作为实验材料，首先将已固定好雄花的花药剥离出来，然后通过对花粉母细胞进行解离、染色、压片来观察细胞减数分裂的全过程。【关键词】 减数分裂细线期偶线期粗线期双线期终变期 【Abstract】 In this experiment, we chose Zea mays as the material. We got a lot of cells in meiosis. Then we disposed the cells in order to observe the whole processes of the meiosis. 【Key words】 Meiosis leptonema zygonema pachynema diplonema diakineses 【实验部分】 一、实验目的 1、了解植物生殖细胞的形成过程； 2、熟悉减数分裂各时期的特点，加深对减数分裂的认识； 3、掌握植物花粉母细胞的压片技术和方法。 二、基本原理 减数分裂（meiosis）,又称成熟分裂（maturation division）是在性母细胞成熟时，配子形成过程中所发生的一种特殊方式的有丝分裂。性母细胞（2n）连续进行两次核分裂（第一次分裂和第二次分裂），形成四个染色体数目减半的配子(n)。经过受精，雌雄配子（n）融合为合子，又恢复了体细胞染色体数目（2n）。确保了亲代与子代间染色体数目的恒定性，从而保证了物种相对的遗传稳定性。在适当的时候采集植物的花蕾制备染色体标本就可在显微镜下观察到植物细胞的减数分裂。整个减数分裂可分为下列各个时期： 第一次分裂 前期Ⅰ减数分裂的特点之一就是前期Ⅰ特别长，而且又较复杂。通常根据细胞核内结构变化特征又将这一期分成五个时期，即细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。 细线期（leptotene）：这是减数分裂的开始时期，染色质开始浓缩为细而长的丝状，首尾不分，且细线局部可见到念珠状颗粒，即染色粒。此时，虽然染色体已经复制为二个染色单体，但在显微镜下还看不出结构上的双重性。 偶线期(zygotene)：各同源染色体开始配对（pairing），出现联会现象。2n个染色体联会为n对染色体。染色体形态与细线期差别不大。在显微镜下不易与细线期分开，但可根据染色体分散状态及粗细变化判断其是靠近细线期还是趋于偶线期。 粗线期（pachytene）：二价体逐渐缩短变粗，同源染色体配对完毕，这种二价体包含了四条染色单体，又称四合体(tetrad)。此时，非姊妹染色单体间出现交换（crossing over）,造成遗传物质的重组。 双线期(diplotene)：配对的同源染色体进一步缩短变粗，由于同源染色体间发生过互换，开始分离而出现交叉（chiasmata）现象。此时染色体呈现扭花状。
《园艺植物遗传学》实验指导书
园艺植物遗传学实验指导书 2008年5月
《园艺植物遗传学》实验指导书 目录 实验室工作规程 (1) 实验一植物细胞有丝分裂的制片和观察 (5) 实验二植物细胞减数分裂的制片及观察 (9) 实验三染色体核型分析 (13) 实验四分离规律的验证 (15) 实验五独立分配规律的验证以及基因的互作观察 (18) 实验六连锁遗传现象的观察和交换值的测定 (20) 实验七遗传力的估算 (22) 实验八染色体结构变异以及多倍体的观察和鉴定 (24)
实验室工作规程 一、守则 为了获得准确的实验结果，避免在工作中发生差错和意外事故，实验者必须遵守下列规则。 (1) 实验前必须制订周密的工作计划，预习实习内容。进入实验室后要按照计划或指导教师的规定进行操作，并随时把实验中出现的情况和最后结果详细地记录下来。 (2) 遗传育种学实验中大多数是借助于光学显微镜，在细胞学水平上研究生物的遗传特性，所以实验室、工作台、各种仪器、用具、玻璃皿以及实验者的双手都必须保持洁净，做到无灰尘、无脏物，以免干扰镜下观察结果。 (3) 盛有化学药品、试剂、溶液的瓶上，必须贴有标签，注明名称、成分、配制日期，并分门别类，安放在一定位置上，排列整齐，便于取用。 (4) 挥发性药品、有毒药品、强酸、强碱等，使用时切勿靠近眼、鼻、口、衣服。酸类稀释时，只能将酸徐徐倒入水中，绝对不可将水倒入酸中。 (5) 取用液体药品时，所用各类量具必须分开，不可混用，用后必须马上冲洗干净；称量固体药品时，先在称盘上放清洁蜡光纸或白纸，调试平衡后再称，保护称具不受腐蚀和防止药品相混。 (6) 进行显微镜检查时，切勿使染料或药剂沾污镜头和镜台，如有沾污必须随时擦干净；并注意各种试剂不要洒在工作台上，以免腐蚀。 (7) 一切药品和化学试剂都必须按最低使用量配用，切勿浪费。用过的固体废物、酸类、碱类、染料等应倒入废缸内，不可直接倒入水槽中，废酒精、二甲苯、固定液等分别倒入一定的瓶中，以便回收再用。 (8) 实验中如有丢失、损失仪器设备及用具，应及时报告并填写报告单，凡不遵从教师指导违反操作规程以致造成不应有的损失者，按其情节轻重，态度好坏，给予处理，赔偿全部或一部分。 (9) 实验室必须保持安静整洁，不准高场喧闹、随地吐痰、乱扔纸屑和脏物。 (10) 离开实验室前，将所用过的仪器用具擦洗干净，并放回原处；关闭电源、水源，并指派人员打扫清洁。
园艺植物遗传学部分实验指导
植物基因组DNA的提取（CTAB法） 一、原理 植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。 二、实验材料、仪器及试剂 1、仪器 水浴锅；混匀器；高速冷冻离心机；移液器；754紫外分光光度计；液氮罐；水平电泳槽；电泳仪；一次性手套；吸头；1.5 mL离心管。 2、材料与药品 植物材料，以幼苗、嫩叶含DNA高。 液氮；氢氧化钠；CTAB；Tris；氯仿；乙醇；RNA酶；硼酸；溴酚蓝；异戊醇；β-巯基乙醇；盐酸；异丙醇；EDTA；GoldView核酸染料；琼脂糖；甘油；DNA分子量标记（DNA marker）。 三、操作方法 （1）按1 g样品3 ml DNA提取液的比例，取相应的园艺植物叶片，加入DNA提取液后，在研钵中充分磨碎；取3ml左右研磨后的液样于5 mL离心管中，65℃水浴35分钟以上，其间颠倒混匀一次。 （2）加等体积的氯仿：异戊醇（24：1）溶液，上下颠倒摇匀后，10000 rpm下离心10分钟，取吸上清液于一新的离心管中。 （3）再加两倍体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀后，10000 rpm下离心10分钟，弃上清。 （4）用3 mL 70%乙醇洗涤沉淀，重复一次，在室温下倒置晾干。 （5）沉淀用100 uL TE溶液溶解，用TE（pH8.0）作空白对照，于紫外分光光度计上测定260nm、280nm和230nm吸收值，计算A260/A230和A260/A280的比值，并换算出核酸的含量。 （6）琼脂糖凝胶板的制备 （7）加样：将样品与溴酚蓝按4：1的比例混合，用移液器缓慢加入凝胶样品孔中，点样量为每孔5 μgDNA。 （8）电泳：点样端接负极，电泳开始时，可用较高的电压，如100伏特，这样可使样品很快进入胶内，而减少样品扩散，待样品进入胶内即可保持每厘米5伏特左右的电压，DNA 在电泳中向正极移动。 当溴酚蓝的区带移至距凝胶底部1-2cm，停止电泳，当胶板为10-15cm的长度时，电泳时间一般为2小时左右。 （9）观察与鉴定
林木遗传学实验指导
林木遗传学实验指导 实验一植物细胞的有丝分裂 实验二植物细胞的减数分裂 实验三染色体组型分析 实验四基因分离
实验一植物细胞的有丝分裂 一、实验目的 观察树木、花卉细胞有丝分裂各时期染色体的变化和特征，掌握根尖压片技术。 二、实验原理 有丝分裂是植物细胞数目增加的主要方式，常见于根尖、茎尖分生区的细胞，细胞经有丝分裂正确地把染色体分配给子细胞，形成两个染色体数目、内容一致的子细胞。有丝分裂是一个连续过程，根据染色体的形态特征可人为地将分裂期分为前期、中期、后期、末期等四个时期。 三、实验材料 发芽的杉木种子根尖；洋葱的幼根。 四、实验用具及药品 显微镜、载玻片、盖玻片、解剖针、刀片、镊子、吸水纸、小烧杯、大培养皿、冰箱、恒温水浴锅、量筒、天平。 醋酸、铁矾、苏木精、8－羟基喹啉、秋水仙素、二甲苯、盐酸、叔丁醇、无水乙醇、95%乙醇。 五、实验步骤 1．取材 ⑴杉木种子根尖将杉木种子在自来水中浸泡24h，然后置培养皿中，在25℃下发芽，5～7天后胚根长达10～15㎜时将发芽种子取出。 ⑵洋葱根尖培养将洋葱的鳞茎放在盛清水的培养皿内，在室温（20～25℃）下培养使其发根，待根长约10～15㎜时将根取出备用。 2．预处理为了阻止纺缍体的活动，获得更多的中期分裂相，同时使染色体相对缩短，便于染色体分散和计数，可对根尖进行预处理。 可用于预处理的化学药物有生物碱、苷类、酚类及其他物质，常用药物的浓度及处理时间如下:
（1）秋水仙碱:浓度为0. 04%～0.2%，处理2～5 h; （2）a-溴代萘:饱和水溶液处理0.5～4 h; （3）对二氯苯:饱和水溶液处理2～4 h; （4）8-羟基喹啉:浓度为0. 002M，处理2～4 h; 上述各处理在室温下进行，若低温处理则用蒸馏水在1～4℃下处理24 h。 3．固定经过预处理的材料冲洗干净后，用卡诺氏固定液固定12～24 h，目的是将细胞迅速杀死，使染色体保持固定的形态。经固定的材料若不立即使用，可换到70%酒精中置于4℃下保存。 卡诺氏固定液的配制：冰醋酸：纯酒精=1：3(体积比)。 4．水解固定好的材料换入蒸馏水中洗净，然后放入1N盐酸溶液中，在60℃下解离5～20min，以便胞间层的果胶类物质解体，使细胞易于分散，便于压片，同时还可使染色体获得一个较为透明的背景。材料经解离后用蒸馏水洗涤数次，将材料中的酸洗净，以便染色。 1N盐酸溶液的配制：取8.25ml浓盐酸(比重1：19)，加蒸馏水至1000ml摇匀即可。 5.染色(铁矾—苏木精法) 苏木精是从墨西哥的一种木本豆科植物洋苏木的心材中提取的一种天然染料，是一种核染色剂，其本身对组织和细胞的亲和力不强，不能直接染色，而必须依靠硫酸铁铵和硫酸铝铵等盐类作媒染剂才能对细胞染色。由于苏木精适用范围广，染色效果好，且颜色的保存性也较好，故在植物制片技术中被广泛采用。 媒染剂的配制：将铁矾(硫酸铁铵)配成2～4%的水溶液，该溶液较易氧化变质，最好是现配现用；置冰箱中可延缓其氧化，能保存2个月。 染色剂的配制：一般用0.5%的苏木精水溶液，配制时先将苏木精结晶体溶于少量的95%酒精中，完全溶解后再加入蒸馏水，不加瓶塞，而用纱布包扎瓶口，使瓶内外空气能流通。将其静置一处使其缓慢氧化，室温下半个月至一个月可“成熟”，过滤后使用。采用下列方法之一可加速染色剂的“成熟”：(1)在100ml新配制的苏木精溶液中加入3～5ml过氧化氢；(2)用煮沸的蒸馏水配制；(3)将新配好的苏木精溶液倾入一个较大
生物技术遗传学实验指导
目录 验一人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备 实验二小鼠骨髓细胞染色体标本的制备 实验三人类染色体G显带技术 实验四人类染色体C显带技术 实验五核仁形成区银染技术 实验六人类染色体G显带核型分析 实验七X染色质标本的制备 实验八姐妹染色单体交换 实验九微核检测技术 实验十ABO血型的测定及其基因频率的计算 实验十一苯硫脲尝味试验及其基因频率的计算 实验十二人类皮纹分析 实验十三遗传咨询 实验十四人类基因组DNA的提取 实验十五聚合酶链式反应（PCR） 实验十六DNA的琼脂糖凝胶电泳 实验十七PCR-RFLP技术 《遗传学》实验须知 一、医学遗传学实验目的和要求 医学遗传学实验课是医学遗传学课程的重要内容。实验课有助于加深和巩固基础理论知识，并进一步了解和掌握本学科的基本实验内容和操作技能。在培养学生分析问题、综合问题和解决问题能力方面具有重要作用。为此，要求学生做到以下几点： 1、实验课前做好预习，明确实验目的、实验原理。
2、复习有关理论内容。 3、熟悉实验的主要步骤。 4、初步估计和判定实验的可能结果。 二、实验操作过程中的注意事项 1、认真操作，仔细观察和综合分析实验所出现的现象与结果并及时记录。 2、如果实验结果与理论结果不一致，须及时进行科学分析，判断结果的可靠性，寻找出现误差的原因。 3、各种实验试剂用后放回原处，瓶盖封严，轻拿轻放。 4、使用微量加样器时，一定调整好取用量，按使用要求操作。 5、实验室应保持肃静，注意清洁卫生，实验中用过的废弃物品要及时清理，避免堵塞下水管道。 三、实验后的注意事项 1、实验后，整理清洁所用仪器、设备，注意放回原位，以备下次使用。 2、如有仪器损坏，要及时填写破损报告，并报告老师。 3、离开实验室前，检查并关闭门、窗、水、电。 四、实验室的意外处理 实验室如遇着火、烫伤等意外事件发生，必须镇静做紧急处理，并立即报告老师。 1、着火：如遇酒精灯推倒或其它原因着火，首先将一切易燃品移至远处，然后用水扑灭或者切断电源。 2、火伤：皮肤被火灼伤，用烫伤软膏涂抹，如伤势较重，立即送医院治疗。 3、如有毒药品泼溅到皮肤上，如EB，同位素等，应用大量清水进行清洗，必要时，去医院处理。． 4、割伤出血：遇玻璃割伤出血，可用碘酒或红药水消毒后，用纱布包扎。如有玻璃留在伤口，处理前应先取出。 实验一人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备 【目的要求】 1、初步掌握人体外周血淋巴细胞短期培养的基本方法。 2、初步掌握人体外周血淋巴细胞染色体标本制备的技术方法 【实验原理】 人体外周血淋巴细胞培养(人体末梢血、微量全血短期培养)及其染色体标本制备是国内外研究显示染色体最常用和效果最好的方法。此方法取材方便，用血量少，操作简便，现已广泛应用于基础医学、临床医学的研究和染色体病的诊断等。 人体外周血中的小淋巴细胞，是已分化、处于G期的细胞，几乎不具有分裂增殖能力。0在离体血培养细胞中很难找到正在分裂的淋巴细胞，因此，需采用刺激细胞增殖的措施。人们发现从云豆(菜豆)中提取的植物血球凝集素(植物血凝素，PHA)可以刺激小淋巴细胞进行有丝分裂，即在PHA作用下，处在G期的小淋巴细胞可转化为淋巴母细胞。淋巴母细胞具0有分裂能力，重新进入增殖周期进行有丝分裂。在PHA作用下体外培养72小时左右，多数淋巴细胞已处于细胞周期的第二周期。此时，细胞分裂相较多，但都处于分裂的不同时期。一般来说，制作染色体标本主要是显示细胞分裂中期染色体，因中期染色体形态最为典型、最为清晰，最易辨认，是研究染色体的最好阶段。为了获得大量可供分析的中期染色体，需在终止细胞培养前数小时加入适当浓度