jetPRIME 转染siRNA说明书
JetPRIME 转染试剂转染siRNA简易说明书
第0天：细胞接种
第一天：转染
在有血清存在的情况下转染，
使用JetPRIME缓冲液
以6孔板为例
●在1.5mL或0.5mL的EP管中加入200μL的JetPRIME 缓冲液，然后加入20μM(1.1μL)
的siRNA，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）；
●加入4μL的JetPRIME试剂，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）；
●室温孵育10min;
●将转染复合物加入到要转染的含血清的培养基中；
●必要时，转染后4h更换细胞培养基；
●孵育24-48h，检测转染效率。
不同规格培养皿的使用量
注：
siRNA enhancer的应用：
在转染复合物加入到所需转染的细胞中后，加入培养基体积的1/1000体积的siRNA enhancer,其他步骤与以前一致；
在6h或4h更换培养基时，也需要加入相应体积的siRNA enhancer（培养基体积的1/1000）。
siRNA细胞转染实验操作指南
siRNA细胞转染实验操作指南 siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。 下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。 1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。接种时尽量 保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。 注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。 2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物: （1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。（*siRNA的用量计算参照表1） （2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。注意孵育时间不能超过25min。 （3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。 表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表 3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。 注意：转染前无需更换新鲜培养基，直接将复合物加到原细胞培养基中即可。如有需要，也可根据情况更换培养基优化该步骤。 4.如果需要进行其他特殊处理，如加药等，可在此时进行。 5.将细胞培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24-72h。具体培养时间根据细胞生长特性、实验目的进行调整。 注意：加入siRNA-Lipofectamine 2000复合物后一般无需更换培养基，但若脂质体类转染试剂对细胞毒性较大，可根据细胞的状态，在转染4-6小时后更换培养基。 6.进行后续总RNA提取、蛋白提取、细胞活性分析等实验。
TAKARA 实验室常规试剂配制方法
031*-2./4,+ 5 8679giaifi [`eg]\_debe^h \ZgZbe^ edb`d]:mwwtYOOyyyNwioiuiNjsqNjr .1/{30,z +|2}-4*~ Q c gunvM_\p Jt_WNTL WNVL XNPK : I JRNS7GDO :H :8b~:;:8:M JRNS QK :H 4^R U ;8t 3L A99 POg /} T8Yclw\1yU <8[?`~t 3-C9ix ;AD gQG O U =8u 1E j 2P :HU >8m >m B,{qY 7>]dU SF Z I61E |0P7>q N ijQG O Y H 产品以冻干粉的形式，常温运输。收到产品后，请于-20 C?-80 'C保存，冻干粉可以稳定保存一年。 使用前请瞬时离心，用RNase-freeH 2O或者灭菌ddH20，配制成20gM储存液，分装保存，避免反复冻 融（尽量不超过5次）。 表120 gM储存液的配置参考 使用前须知 为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。 实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20 C~-80 C小心保存。 细胞实验方法 为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议： a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔； b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。 1. 转染浓度： siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时 间为24?72h。最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。 2. 转染步骤： 以Iipofectamine2000（简称Iipo2000）转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染 请参考表2。 1）转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞 密度能够达到30~50%（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验）。注意: 转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。 2）对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-Iipo2000混合液： a. 稀释siRNA :用50 g 不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释g I20 gM siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min ; b. 稀释Iipo2000 :用50 g不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释1 g Ilipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min ; c. 将a与b轻轻混匀，室温孵育20min（溶液可能会有浑浊，但不会影响转染）。 注意：稀释好的Iipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA 混合。另在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构， 甚至影响siRNA-lipo2000 混合物的形成。 3）将siRNA-Iipo2000混合液加入含有细胞的400 gl培养基（v2）的培养孔中，轻轻混匀； 4）（可选）培养4?6h后，将孔中含siRNA-Iipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基； 5）（可选）进行其他必要的特殊处理（如加药处理）； 各种转染试剂的中文转染方法 FuGENE6（Roche）转染步骤： 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。 2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3. 加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。 4. 室温孵育20分钟。 5. 将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。 6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。 3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放置20分钟。 5. （optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入2 ml无血清配养基。 6. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。 中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。 7. 在37℃，5％CO 2 或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。 8. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。 贴壁细胞的稳定转染： 转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性培养基。 Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤（24孔板）： siRNA使用说明（2009-08） 名称： 常规化学合成siRNA。 产品简介： 常规化学合成siRNA为21-25nt，带有2nt的3'端悬垂的双链小RNA（3'端悬垂通常为dTdT或者UU，也可以选择其他的碱基作为3'端悬垂）。 产品剂量经过严格测算，以摩尔数标明。产品剂型为冻干粉，即用型的siRNA已经经过去保护、退火、纯化等处理，只要用灭菌的ddH2O或者RNase-free water溶解并配制成20μM液体即可直接用于细胞转染及其他实验。 保存和使用： 保存： 液体剂型，siRNA的贮存浓度一般为20μM，-20℃或-70℃保存半年以上； 冻干粉剂型，-20℃或-70℃保存一年以上。开盖前，请先稍稍离心，将粉末收集管底，再用灭菌的ddH2O或者RNase-free water，配制成20μM的液体剂型。 例如：20nmolsiRNA冻干粉，需要加入1ml水溶解（其他剂量可以按照比例计算加水量）。 注意：（1）液体剂型产品，应避免反复冻融（尽量不要超过5次），建议溶解后的产品分装保存。（2）如果近期不做实验，产品需要长期放置，最好以冻干粉形式保存。 使用： 产品使用时（转染过程），siRNA最好冰上放置，使用完毕，请于-20℃或-70℃小心保存; 整个实验过程，要求无RNA酶环境，枪头、EP管都要经DEPC处理； 特别提示：荧光标记siRNA要求避光。 使用方法： 1. siRNA的转染浓度：推荐的siRNA转染浓度是50nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围可以是10～150nM。 （siRNA及转染试剂的建议用量，请参照“实验指导”）。 2. 使用lipofectamine2000（Invitrogen）转染siRNA的步骤（仅供参考）： (1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到30～50％（不同细胞生长速度不一样， 因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验），请使用无抗生素的培养基。 注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，从而降低细胞的转染效率。而细胞密度过低则可能达不到生长的要求，也会因此影响转染效率。 (2)对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA- lipo2000混和液（试剂的用量和体积，请参照“实验指导”）： a. 稀释转染试剂lipofectamine2000（以下称lipo2000）：使用前，将lipo2000转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清 的优化培养基（Opti- MEMⅠ）稀释，轻轻混和，室温孵育5min； b. 稀释siRNA：用不含血清的Opti -MEMⅠ稀释siRNA，轻轻混和； c. 稀释好的lipo2000经过5min的孵育后，将之与上述（b）稀释好的siRNA轻轻混和，室温培养20min以形成siRNA-lipo2000 混和物，溶液可能会有浑浊，不过不会影响转染。 注意：稀释好的lipo2000，如果长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在30min之内与稀释好的siRNA混和。 (3) 将siRNA-lipo2000混和液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和； (4)将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中培养至检测时间（24～96h）。沉默效率的检测一般建议的时间为24～72h。 可选操作（并非必要的操作）：转染操作完成，经过37℃培养4～6h后，可以将孔里含有siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜的生长培养基，这样也不会影响转染的效率。 注意：如果转染时使用的是不含血清的培养基（即血清饥饿的条件下进行转染），4～6h后必须换成完全培养基（含血清、含抗生素），以确保细胞生长。 3. mRNA 水平的检测：siRNA的作用机理在于其引起靶mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA沉默效率的最直接指标。 一般在siRNA转染后24h即可以检测到靶mRNA水平的降低。检测方法一般采用RT-PCR（半定量）或Real-time PCR（定量）。 4. 蛋白水平的检测：蛋白水平的检测一般需要借助抗体（针对靶基因蛋白质的抗体或针对融合蛋白的抗体）或报告基因系统检 测，检测手段一般有Western-blot、免疫组化等。一般说来，检测时间受细胞内蛋白质表达量、蛋白质本身的半衰期等因素的影响，一般从48h开始检测，在36、48、72、96h，甚至更长时间之后多点采样。 罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书 (In situ cell death detection kit-POD法) 一、原理： TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等； 试剂：试剂盒含： 1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、 2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、 3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP； 自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、 RFect 小核酸转染试剂 货 号：11011: 0.5ml 11012: 1.0ml 储存条件：-20℃ 11013: 1.5ml 产品特点 应 用 产品介绍 RFect 小核酸转染试剂是国际知名科学家崔坤元博士领导我公司研发团队在美国西雅图实验室研发成功的一种新型的小核酸转染试剂。RFect 可用来转染siRNA 、antisense RNA 、microRNA 等200bp 以内的小分子RNA 和DNA ，转染细胞包括绝大多数贴壁生长的细胞，如一般细胞株、肿瘤细胞株等。目前，无论国外还是国内，转染试剂的主要成分均为脂质体或聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)，这两种成分都具有很大的细胞毒性，并且转染效果不好。RFect 采用新型的动物源性的纳米材料，毒性很低并且拥有非常卓越的转染性能。与其它品牌的小核酸转染试剂相比，RFect 的细胞转染阳性率一般在90%以上，Lamin A/C 基因抑制效率在95%以上，而其它品牌转染试剂的细胞转染阳性率一般不超过70%，Lamin A/C 基因抑制效率不超过75%。RFect 细胞毒性很低，转染细胞死亡率不到10%，而其它品牌试剂的转染细胞死亡率一般在30%以上。血清对转染效果没有影响，不必刻意添加或更换培养液。有关RFect 小核酸转染试剂的材料合成和试剂配制我们已申请了国际专利，并通过PCT 覆盖国际上多个国家和地区。 操作步骤：本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。 A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。 B. siRNA-RFect 混合物准备： 1. 6pmol siRNA 用50μl 无血清培养基稀释。 2. 2μl RFect 用50μl 无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min 。注意：确保在25 min 内执行第三步操作，不要过于延迟。 3. 孵育5min 后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl ）。轻轻混匀，室温孵育20 min 。 C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）： 1. 将100μl 混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml 培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。 2. 37°C 培养18-72h ，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h 时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、 所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。 转染实验要点： ● 转染过程不可添加抗生素，否则会导致细胞死亡； ● 首次实验siRNA 的用量可稍大（一般10 nM ） ，后续实验根据实验结果修改。 RFect Transfection Reagent Formats for Various Cell Culture Vessels Culture vessel Surface area/well (cm 2) Vol. of growth medium (μl) Vol. of dilution medium (μl) siRNA Amount (pmol) RFect (μl) 96-well 0.3 100 2 x 10 1.2 0.4 48-well 0.8 250 2 x 25 3 1 24-well 2 500 2 x 50 6 2 12-well 4 1000 2 x 100 12 4 ◎卓越的细胞转染性能：细胞转染阳性率高达90%以上，基因敲除效果明显，A549细胞Lamin A/C 基因敲除效率在95%以上 ◎极低的细胞毒性：转染细胞死亡率不到10%，大大降低了因细胞毒性对实验结果的影响 ◎转染细胞范围广，绝大多数贴壁细胞株都能获得比较理想的转染结果 ◎siRNA 转染 ◎antisense RNA 转染 ◎200bp 内的小分子DNA 转染 THE RNAi COMPANY RNAi 产品使用手册 上海吉玛制药技术有限公司 Shanghai GenePharma Co.,Ltd. Ⅰ. RNAi 简介 1 A. RNAi 实验原理 B. RNAi 实验流程 C. RNAi 实验所需试剂 D. 上海吉玛 RNAi 相关产品 Ⅱ. siRNA设计7 A. 哺乳动物siRNA设计 B. 上海吉玛 siRNA 产品特性 C. siRNA oligo 技术数据 Ⅲ. siRNA 对照9 A. 普通阴性对照 B. 荧光标记的阴性对照 C. siRNA阳性对照 D. 转染试剂对照 E. 避免off-target对照 Ⅳ. siRNA 转染10 A.siRNA 转染的方法 B.Lipofectamin2000 转染试剂 C.Lipofectamin2000适用的细胞类型 D.转染前细胞培养 E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例 F.贴壁细胞转染程序 G.悬浮细胞siRNA转染程序 H.DNA和siRNA共转染细胞程序 I. 体内siRNA导入方法 J. siRNA转染常见问题与建议 Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15 A. siRNA细胞转染条件优化 B. Real-Time PCR RNAi 效果检测 C. Real-Time PCR 结果分析 Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20 A. western-blot原理 B.western-blot操作步骤 w C.estern-blot上样液的制备 D.western-blot常用试剂的配制 Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22 Ⅰ. RNAi 简介 A. RNAi实验原理 RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。 Code No.：DRR019A RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 （100次量） 目录 内 容 页 码 ●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 2 ●RNA PCR原理 2 ●试剂盒特点 3 ●RNA样品制备 4 ●使用注意 4 ●引物选择 5 ●实验操作 5 ●Q&A9 ●参考文献 9 ●制品说明 PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA 后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。 TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0是使用AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由来的反转录酶将RNA合成cDNA，然后在同一反应管中使用Hot Start PCR用TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶扩增此cDNA的RT-PCR试剂盒。本试剂盒含有从RNA到cDNA，然后使用PCR法扩增此cDNA所需的全部试剂。 本试剂盒中的Oligo dT-Adaptor Primer的独特设计，大大地提高了Poly(A )+ RNA 3′端区域的cDNA合成效率。Hot Start PCR用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS的应用，大大地增加了本试剂盒的扩增性能。 ●制品内容（100次量） 1. AMV Reverse Transcriptase XL（5 U/μl） 50 μl （Avian Myeloblastosis Virus来源） 2. RNase Inhibitor（40 U/μl） 25 μl 3. Random 9 mers（50 pmol/μl） 50 μl 4. Oligo dT-Adaptor Primer（2.5 pmol/μl） 50 μl 5. RNase Free dH2O 1 ml 6. TaKaRa Ex Taq?HS（5 U/μl） 40 μl 7. M13 Primer M4（20 pmol/μl） 50 μl 8. 10×RT Buffer 1 ml [100 mM Tris-HCl（pH8.3），500 mM KCl] 9. 5×PCR Buffer 1 ml 10. dNTP Mixture（各10 mM） 150 μl 11. MgCl2（25 mM） 1 ml 12. Control R-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA下游引物） 13. Control F-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA上游引物） 14. Positive Control RNA（2×105 copies/μl） 25 μl （Transcribed poly(A)+ RNA of pSPTet3 plasmid） 【各种引物序列】 引物名称 各引物序列 Random 9 mers 5′-（P）NNNNNNNNN-3′ Oligo dT-Adaptor Primer 包含dT区域及M13 Primer M4序列。 Control F-1 Primer 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ Control R-1 Primer 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ M13 Primer M4 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ -1- FuGENE6（Roche）转染步骤: 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总 体积到100ul。 2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。 4.室温孵育20分钟。 5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液 洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。 6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。 细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释 4.0ugDNA，轻轻混匀。 3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如 OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。 Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。 NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放 置20分钟。 5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入 2ml无血清配养基。 6.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。 Polyplus-transfection S.A. - Bioparc - 850 Bd S. Brant - 67400 Illkirch - France - Phone: +33 3 90 40 61 80 - Fax: +33 3 90 40 61 81 Polyplus-transfection Inc. - 1251 Ave of the Americas - 34th fl. - New-York - NY 10020 - USA https://www.360docs.net/doc/d2551066.html, jetPRIME? in vitro DNA & siRNA transfection reagent PROTOCOL DESCRIPTION jetPRIME? is a novel powerful molecule based on a polymer formulation manufactured at Polyplus-transfection?. jetPRIME? ensures effective and reproducible DNA and siRNA transfection into mammalian cells. jetPRIME? is extremely efficient on a wide variety of cell lines. This powerful reagent only requires low amounts of nucleic acid per transfection, hence resulting in very low cytotoxicity . 1 Transient DNA transfection protocol (2) 1.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 2 1.2 DNA transfection protocol ................................................................................................................... 2 1.3 Virus production in adherent cells ....................................................................................................... 5 1.4 Optimization guidelines (5) 2 siRNA transfection protocol (6) 2.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 6 2.2 siRNA transfection protocol .. (7) 3 DNA & siRNA cotransfection protocol (7) 3.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 7 3.2 DNA & siRNA cotransfection protocol . (8) 4 Transfection of CRISPR/Cas9 ..................................................................................... 9 5 Stable DNA transfection ............................................................................................. 9 6 Troubleshooting ....................................................................................................... 10 7 Product information (11) Code No. RR047A 研究用 PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 说明书 目录 内容页码 ●制品说明1 ●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ●Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8 ●制品说明 为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA 合成的全过程。 使用本制品合成的cDNA适用于SYBR? Green分析法和TaqMan?探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR?Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）、Premix Ex Taq（Probe qPCR）等定量试剂组合使用。注意：Takara Bio使用SYBR? Green I作为研究试剂已得到Molecular Probes Inc.的许可。SYBR?为Molecular Probes Inc.的注册商标。 ●制品内容（20 μl反应×100次） 1. gDNA Eraser 100 μl 2. 5×gDNA Eraser Buffer*1200 μl 3. PrimeScript RT Enzyme Mix I*2100 μl 4. 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）*3400 μl 5. RT Primer Mix*4 400 μl 6. RNase Free dH2O 1 ml×2 7. EASY Dilution（for Real Time PCR）*5 1 ml *1：5×gDNA Eraser Buffer在反转录反应前使用，请务必进行基因组DNA的除去反应。 *2：含有RNase Inhibitor。 *3：含有dNTP Mixture。 *4：含有Oligo dT Primer和Random 6 mers。 *5：制作标准曲线时梯度稀释DNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或RNA如果用水或TE Buffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精 度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定 量的标准曲线。本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用。EASY Dilution 也可以单独购买（Code No.9160）。 注意：EASY Dilution请与本公司Real Time PCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。 ●试剂盒外必备材料 热循环仪（或37℃水浴，42℃水浴和85℃加热块） 反转录反应所用0.2 ml和1.5 ml的微量反应管 微量移液器和枪头（高压灭菌） ●保存：-20℃。 the MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB 11821598 322 100测试 主要用途 用免疫学方法定量测定人血清或血浆中肌酸 激酶同工酶MB含量。 电化学发光免疫测定试剂，适用于罗氏 Elecsys和cobas e免疫测定分析仪。 临床应用1、2、3 肌酸激酶（CK）是一种二聚体酶，它有四种不 同的形式：线粒体同工酶和胞浆同工酶CK-MM （肌型）、CK-BB（脑型）和CK-MB。 血清中CK-MB的测定值是诊断心肌缺血（例如 急性心肌梗塞、心肌炎等）的重要指标。CK-MB 在心脏症状出现3－8小时后即可检出并且可 持续较长时间，这取决于病情经过。 CK-MB还可出现在其它临床条件下，例如横纹 肌溶解症和中风。实验室诊断方面，测定总体 CK、肌钙蛋白T和/或肌红蛋百有助于鉴别这些 临床疾病。 CK-MB测定的灵敏度与取样时间有关。因此跟 踪测定非常有意义。 Elecsys Ck-MB测定法采用了两种不同的直接 对抗人CK-MB的单克隆抗体。 检测原理 双抗体夹心法，总检测时间：18分钟 ●第一次孵育：15μl标本、生物素化的抗 CK-MB单克隆抗体和钌（Ru）a标记的CK-MB 特异性单克隆抗体一起反应生成抗原抗 体夹心复合物。 ●第二次孵育：添加包被链霉亲和素的磁珠 微粒后，该复合物通过生物素和链霉素之 间的反应结合到微粒上。 ●将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将 磁珠吸附在电极表面。未与磁珠结合的物 质通过ProCell被去除。给电极加以一定 的电压，使复合体化学发光，并通过光电 倍增器测量发光强度。 ●仪器自动通过2点校正的定标曲线计算得 到检测结果。 a)Tris(2,2’-bipyridyl) ruthenium(II)- complex (Ru(bpy){ 2 3 }三联吡啶钌 试剂－工作溶液 M 包被链霉亲和素的磁珠微粒（透明瓶 盖），1瓶，6.5ml；包被链霉亲和素的 磁珠微粒，0.72mg/ml；防腐剂。 R1 生物素化的抗CK-MB抗体（灰盖），1瓶， 10mL：生物素化抗CK-MB单克隆抗体（小 鼠）1.2mg/L；磷酸盐缓冲液100mmol/L， pH值7.0；防腐剂。 R2 Ru(bpy)32+标记的抗CK-MB抗体（黑盖）， 1瓶，10mL；钌标记的抗CK-MB单抗 1.2mg/L；磷酸盐缓冲液100mmol/L，pH 值 7.0；防腐剂。 警告和注意事项 仅用于体外诊断。 在使用本试剂盒时必需遵循所有试验室试剂 操作的注意事项。 所有废弃物必需按照当地法规进行处置。 专业人员可要求获得安全数据报告。 避免试剂和样本（样本、定标液和质控品）产 生气泡。 试剂处理 试剂盒为即用型，不能分开使用。 试剂相关信息可以通过试剂条形码阅读获取。 储存及稳定性 存放于2－8℃。 请垂直摆放Elecsys CK-MB试剂盒，确保使用 前仪器通过自动搅拌能够完全混匀磁珠微粒。 样本的采集和准备 仅以下罗列的样本通过检测要求。 血清样本须用标准试管或有分离胶的真空管 收集。 肝素锂、肝素钠、K3-EDTA和枸橼酸钠抗凝的 血浆都适用。使用枸橼酸钠抗凝的血浆时，结 果必须按＋10％校正。 标准：回收率在血清值的90-110%以内或斜率 0.9-1.1＋截距<±2×分析灵敏度（LDL）＋相 关系数>0.95。 稳定性：18-23℃保存4小时，2-8℃保存8小时， -20℃保存3个月。 样本只能冰冻一次。 转染试剂使用注意事项 1.细胞密度：转染DNA（质粒）时，细胞密度为80-100%，转染RNA(siRNA 或miRNA)时，细胞密度为60-80%，具体细胞密度必须结合考虑核酸种类、转染试剂种类和细胞生长密度极限； 2.DNA用量：0.5-1ug/孔（以24孔板为例），具体用量根据转染效率检测实验 确定； 3.RNA用量：10-30 pmol/孔（以24孔板为例），具体用量根据转染效率检测实 验确定； 4.转染试剂的用量：转染试剂说明书推荐了一个使用范围，具体用量根据转染 效率检测实验确定； 5.根据转染效率检测实验确定核酸的用量及转染试剂的用量（核酸与转染试剂 的比例关系），转染效率检测实验一般在24孔板中进行，其他格式的培养器皿请根据底面积的比例（表1）进行计算； 6.转染试剂使用前才从4℃中取出，取用前，先短暂离心（转速达到3000RPM 时即可停止），然后放在涡旋振荡器上点动混匀三次，每次持续1秒，混匀后短暂离心（转速达到3000RPM时即可停止），上述措施是为了混匀转染试剂，保证使用效果，使用后立即放回4℃保存； 7.核酸和转染试剂分别用Opti-MEM（这是专用的转染稀释培养基，如果没有 Opti-MEM，可以用细胞对应的基础培养基代替）稀释，稀释的核酸可以通过弹匀，吹打均匀，颠倒混匀或涡旋点动混匀（三次，每次持续1秒），稀释的转染试剂可以通过弹匀，颠倒混匀或涡旋点动混匀（三次，每次持续1秒），不可使用吹打均匀；混匀后均需短暂离心； 8.把稀释的核酸和稀释的转染试剂复合混匀时，应该把稀释的核酸加入稀释的 转染试剂中（顺序不可调转）；加入后立即进行（不要耽搁）弹匀或颠倒混匀（稀释的核酸和稀释的转染试剂一旦复合，转染复合物的形成立即启动，如果不及时混匀，所形成的转染复合物的效率就会很低），先不进行短暂离心，待所有的管子复合完毕后，在一起进行涡旋点动混匀三次，每次持续1秒，然后短暂离心； 9.转染复合物孵育形成时尽量避光室温或37℃放置；siRNA说明书
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