病毒学实验(抗原抗体检测)细菌学实验的详细实验步揍
各实验具体步骤：
病毒学实验
1.抗体检测：
有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合，常用于正粘病毒、副粘病毒及黄病毒等的辅助诊断、流行病调查，也可用于鉴定病毒型与亚型。疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验
目的意义：
1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法；
2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。
基本原理：
许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。
血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。
器材及试剂:
待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。
实验步骤：
(一)血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作：
1、第一排1-12孔各加生理盐水25ul，第二排1-12孔加生理盐水25ul为红细胞对照；
2、吸25ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取25ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去25ul，
3第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞25ul。
4、室温静置10-30分，观察结果
5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价
(二)血凝抑制试验（HI）取一96孔板，按以下步骤操作：
1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释
度。（根据学农实验配置4单位抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数除以4即为含4单位抗原的稀释倍数。
2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水25ul，于第一排第1孔中加入25ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取25ul至第2孔混匀，吸取25ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去25ul，经倍比稀释
3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素25ul，微量震荡器震荡2min混匀；
4、室温静置20min；
5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞25ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。
6、室温静置10-30分，观察结果。将板倾斜，观察红细胞有无成泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原货病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位。
ELISA（酶联接免疫吸附剂测定）
是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一) 原理
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二) 操作步骤
方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。
加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应
孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的
4、5、6。
(三) 试剂器材
1. 试剂
(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液): Na2CO３
1.59克，NaHCO３
2.93克，加蒸馏水至1000ml
(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M，KH2PO4，0.2克，
Na2HPO４·12H2O 2.9克， NaCl，8.0克， KCl 0.2克，Tween-20 0.05％0.5ml ，加蒸馏水至1000ml， (3) 稀释液：牛血清白蛋白(BSA) 0.1克，加洗涤缓冲液至100ml，或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。
(4) 终止液(2M H２SO４）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。
(5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸): 0.2M Na２HPO４(28.4克／L) 25.7ml ， 0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。
(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液: TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml 底物缓冲液(PH5.5) 10ml 0.75％H２O２32μl
(7) ABTS使用液: ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3％H２O２2μl
(8) 抗原、抗体和酶标记抗体。
(9) 正常人血清和阳性对照血清。
2. 器材:
(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。
抗原检测
1.PCR
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链，在DNA聚合酶与引发子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做引发子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR反应步骤
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的"半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
Taq DNA 聚合酶
现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。发现耐热DNA聚合酶--Taq 酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。PCR的反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现"停滞效应" 这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA
聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 5ul 4种dNTP混合物各200μmol/L引物
各10～100pmol 模板DNA 0.1～2μg Taq DNA聚合酶 1～2 U Mg2+ 1.5～2.0mmol/L 加双或三蒸水至50μl
PCR反应五要素
*引物（Primer）
*酶（Taq DNA Polymerase） *dNTP（dATP, dGTP, dCTP, dTTP）*模板（Template）
*Mg2+（Magnesium）
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
1、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
2、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免
病毒学检验
《病毒学检验》课程教学大纲 一、课程基本信息 课程名称：病毒学检验（Experimental Virology） 课程编码： 课程类别: 必修课(专业课) 适用专业: 卫生检验学本科 开课学期: 第七学期 课程学时: 63学时（理论学时27，实验学时36） 课程学分：3.5 先修课程：医学寄生虫学及检验、细菌学检验、临床医学概要等 课程简介：病毒学检验是卫生检验重要的专业课程之一，是卫生检验课程体系的重要组成部分，也是卫生检验专业学生必修的考试课程。本课程通过课堂讲授、实验实习、网络自学等方式进行教学。注重培养学生综合性思维能力，重视学生自主学习、自觉学习，分析和解决实际问题能力，以及创新思维和能力的培养。 选用教材：李洪源、王志玉主编：《病毒学检验》，人民卫生出版社，第一版，2006年7月。 参考书: 1. 张朝武主编：《现代卫生检验》，第一版，人民卫生出版社，2005。 2. 李影林主编：《中华医学检验全书》，人民卫生出版社，1996。 3. 王秀茹主编：《预防医学微生物学及检验技术》，人民卫生出版社，2002。 4. 贾文祥主编：《医学微生物学》，四川大学出版社，2005年1月。 5. 李凡、刘星晶主编：《医学微生物学》，人民卫生出版社，第七版，2008年1月。 二、课程教育目标 通过学习，使学生知悉病毒学检验的基本技术和分子生物学技术，知悉 常见重要致病病毒。要求学生掌握病毒的分离培养方法、血清学实验及分子 生物学技术在病毒学检验中的应用；掌握常见重要致病病毒的生物学性状、 检验方法和预防医学意义。为学生能独立开展各种病毒学检验打下良好基 础。
三、理论教学内容与基本要求 绪论 （一）学时：0.5 （二）要求 【掌握】病毒的特性；病毒学检验的内容及其应用范围；病毒学检验的一般原则。 【熟悉】病毒学检验的质量控制；病毒学实验室的生物安全管理。 【了解】病毒学和病毒学检验的发展史。 第一篇病毒学检验技术 第一章细胞培养技术 （一）学时：1.5 （二）要求 【掌握】体外培养细胞的生物学特性；体外细胞培养的条件；组织培养的种类；细胞系和细胞株的概念；细胞培养方法；细胞培养中平衡盐、消化液和血清的作用；细胞检查方法；细胞的冻存。 【熟悉】用于病毒培养的细胞选择、细胞培养操作过程和细胞培养污染与监测。 【了解】细胞培养技术在病毒学研究中的发展；细胞系的鉴定。 第二章鸡胚接种技术 （一）学时：1.5 （二）要求 【掌握】鸡胚的结构；鸡胚的孵育与检查；接种途径与方法及其用途；病毒的检测；鸡胚接种技术的应用。 【熟悉】实验材料、器械与准备。 【了解】鸡胚的解剖与生理。 第三章动物实验技术 （一）学时：1.5 （二）要求 【掌握】实验动物的分类；普通动物、清洁动物、无特定病原体动物、无菌动物、悉生动物；近交系动物、封闭群动物、突变系动物、杂交群动物及其特点；常用实验动物种类及其品系；
临床细菌学检验的质量控制流程
临床细菌学检验的质量控制流程 1、质量的概念和质量保证 影响检验结果质量的因素很多,实验过程中,仪器、试剂和操作等均会引起试验结果的误差,衡量检验结果的质量常用准确度和精确度,或特异性和灵敏度。具体采用哪一种指标应根据实验的性质决定,目前临床细菌学检验的工作内容大致有3类,衡量起质量的技术指标不完全相同。 第一类是检出细菌的实验,包括标本直接涂片检查和细菌分离培养。现代的细菌感染,混合菌较常见,一份标本中,会有2种以上细菌存在。无论标本直接涂片还是分离培养,检验结果必须如实反映感染病灶中细菌的真实情况。这类实验的质量,应该用细菌检出率或细菌分离率来衡量。 第二类是鉴定细菌的实验。通过一系列生理生化及形态学、血清学的手段来鉴定病原菌。对分离到的病原菌都做出准确的鉴定,是反映细菌事工作质量的一个重要方面。 第三类是药敏实验。有稀释法和纸片法,前者是半定量的实验,可以用准确度和精密度来衡量,后者以敏感或耐药的形
式报告,属于定性的实验,但实验过程中测量抑菌环是定量的指标。也应以准确度和精确度衡量。 所以实验室人员必须清楚认识到以上这一点,在实验室的设计和管理方面就应该主动设置误差检测系统,实验中一旦出现误差及时发出警报,查明原因及时纠正。 2、室内质量控制 2.1在职人员 2.1.1须受过细菌学检验的专门基础教育以及相关的生物交全防护知识,并以细菌检验为专业,及时终结并积累工作经验。 2.1.2作人员必须具有严谨的工作态度,技术操作须完全遵守操作规程,并直接参与质量控制工作。 2.1.3工作人员应不断加强自身的业务学习,及时了解本领域的新进展,将所掌握的新知识应用到实际工作中。 2.1.4实验室管理人员应注意利用一切机会培养技术人员,积极参加国际、国内学术会议、专业培训班,获取新信息。因为细菌学检验,投资人员培训远比投资与仪器设备更重要。 2.2操作手册及参考书
1生物学实验常用技术
生物学实验常用技术一、分子方面 1、基因工程 1)PCR (Polymerase Chain Reaction) (二楼PCR仪器全部会用) 2)RT-PCR;Q-PCR 3)琼脂糖凝胶电泳;胶回收 4)酶切/链接 5)转化 6)固体/液体LB培养基配制 (高压蒸汽灭菌锅使用方法) 7)质粒大/小抽原理及步骤 (手提、溶液I、II、III作用) 8)基因组DNA抽提 9)RNA提取; 2、蛋白质工程 1)蛋白收集 (蛋白裂解液+PMSF; 1×Loading 裂解(推荐)) 2)SDS-PAGE(电泳胶的配制) 2)考马斯亮蓝染色,银染 3)Western blot 4)蛋白定量常用的方法及原理, 以及熟练操作Bradford法蛋 白定量 (TRIZOL法原理、注意事项及步骤) 二、细胞方面 1)细胞培养、传代 2)细胞冻存与复苏 冻存液配制: (1)DMSO:血清=1:9(推荐)
(2)DMSO:培养基:血清=1:3:6 均可 DMSO为细胞专用型;现用现配,效果最好;冻存时细胞在-80℃中不要超过一周,最好在24-48h内放入液氮罐中保存。 3)细胞培养基配制(过滤除菌)、胰酶配制(过滤除菌),PBS配制(灭菌);(不同培养基的区别;谷氨酰胺(提供氮源),2周补充一次) 4)转染 5)MTT原理及操作(检测细胞存活率或死亡率) 6)碱性磷酸酶实验(ALP,检测细胞分化) (5、6 需学会SPSS软件及graphpad prism5软件使用) 7)Hoechst染色 8)结晶紫染色(不推荐) 9)苏木精/伊红染色 (9可以替代8,以后实验推荐使用9,图片漂亮) 10)荧光显微镜的使用 11)激光共聚焦显微镜样品制备(细胞固定,染色,洗脱) (7、8、9、10、11需学会Photoshop常用工具处理数据) 12)流式细胞仪样品制备(包括:转染效率与细胞凋亡染色标记)以及仪器操作(需学会FlowJo软件分析流式结果) 三、动物实验 1)小鼠的定制: 常见的小鼠: ICR小鼠(正常),9元/只
常用的单克隆抗体检测方法
常用的单克隆抗体检测方法 通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而 成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml 混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。b、洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。d、酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。e、底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。f、底物使用液：OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2
0.15ml。TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。g、抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。h、抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。病毒感染的传代细胞或全菌抗原。淋巴细胞等悬液。i、酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。j、细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。k、聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。l、酶联免疫阅读仪；或光镜。m、吸管、加样器及水浴箱、离心机等。②可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）a、纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。 b、以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。 c、弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。 d、每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省略。 e、洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。 f、每孔加50-100ul 待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干。 g、加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。 h、加底物
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
病毒学检验重点
病毒得特点: 1、形体微小,能通过细菌滤器,用电子显微镜才能观察到。 2、无细胞结构,其主要成分就是核酸与蛋白质 3、每种病毒只含有一种类型得核酸(RNA或DNA) 4、因缺乏完整得酶系统与能源,故只能寄生于活细胞内,依靠宿主细胞得代谢系统合成蛋白质与核酸 5、病毒以其基因为模板,在宿主细胞内复制出新得病毒颗粒 6、为了在生物界保存其种属,病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主得能力,并具有对敏感宿主得侵染性与复制性 7、在宿主体外,能以大分子状态存在,并可长期保持其侵染能力 8、有些病毒得核酸能整合到宿主细胞得基因组中,并能诱发潜伏感染 体外细胞培养得基本条件: 1、条件要求高,培养液组分复杂,需要添加血清才能满足生长需要 2、避免微生物污染,需要在培养液中加入抗生素。 3、体外细胞培养得基本要求主要包括细胞接种(尽量选择对数期细胞接种)、 4、培养液营养成分、 5、酸碱度(能耐受得ph范围为 6、6- 7、8,依靠缓冲系统调节)、 6、气体条件(细胞生长需要CO2 ,大规模培养需要有足够得氧气)、 7、温度(最适温度为35-37。C)、 8、水得纯度(一般要求去离子水或三蒸水)、 9、无菌条件等 实验动物得微生物控制分类: 1、普通动物,一级动物,要求不携带动物烈性传染病与人兽共患病病原 2、清洁动物,二级动物,在一级动物要求上,不携带对动物危害大、对实验干扰大得病原 体,外观健康,主要器官不得有组织病理学病变 3、无特定病原体动物,三级动物,除普通动物、清洁动物不得携带病原体外,还要求排除 潜在感染或条件致病菌得感染 4、无菌动物,四级动物,要求在体内外不得检出其它生命体 实验动物得遗传学分类 1、近交系,指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育得动物品系 2、封闭系,不从外界引入新得血缘,非近亲交配方式得实验动物群体 3、突变系,由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状得动物 4、杂交群动物,由不同品系杂交所产生得后代 5、转基因动物,插入外源基因后能正常繁殖得动物 大鼠、小鼠得采血方法 1、剪尾采血,动物麻醉后,将尾端剪去约5mm,待血液流出采集,小鼠可每次采血0、1ml, 大鼠约0、4ml 2、眼眶后静脉丛采血,拇指及食指抓住鼠两耳之间得皮肤固定,轻轻压迫颈部两侧,使眼 球充分外凸。采血管插入眼角与眼球之间,向眼底方向刺入,切开静脉丛,血流即流入取血管。 3、颈(股)动脉或颈(股)静脉采血,麻醉动物,剪去被毛,作颈静脉或劲动脉分离术后采血 4、摘眼球采血,采血时,用左手固定动物,压迫眼球,尽量使眼球凸出,右手用弯头镊子摘 除眼球,迅速采集血液 病毒得纯化方法:
蛋鸡抗体检测实验室建设方法
蛋鸡抗体检测实验室建设方法 一、面积、台面、墙面 面积至少要有6平方，放置一张操作台（桌子，面要平，长1.5米，宽1米），一张凳子，墙用彩钢板隔开，制作一个门，保持空间独立。 二、器材 1、一台小高压锅，用于灭菌。 2、冰箱，用于盛放易耗品等。 3、离心机（5000转以下）一台，用于制作红细胞。 4、移液枪两把，一把为1毫升的，另一把为200微升的。 5、电子天平一台。 三、耗材 1、枪头，1毫升的及200微升的，各500个。 2、盛放枪头的盒子，两种规格，各5个。 3、Ependorf管100个，Ependorf管架2个。 4、葡萄糖瓶子10各。 5、量筒2个。 6、记号笔一支。 四、 血凝试验(HA) 定义：某此病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(hemagglutination，HA)，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HA) 血凝抑制试验(HI) 定义：当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HI) 。 原理：特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝集红细胞的能力，从而抑制血凝现象。 用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定 根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒作HA和HI试验。病毒悬液能凝集红细胞，并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么，这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制，说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。 阿氏（Alsevers）液配制
ELISA检测方法
ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。 基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。
②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。 注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
2020智慧树知到《病毒学检验》章节测试题【完整答案】
2020智慧树知到《病毒学检验》章节测试 题【完整答案】 2020智慧树知到《病毒学检验》章节测试答案 绪论 1、用于测量病毒大小的单位是： A.μm B.nm C.pm D.fm E.am 答案: nm 第一章 1、PCR反应的引物需要2条。 A:对 B:错 答案: 对 2、甲型肝炎病毒归属于嗜肝DNA病毒科 A:对 B:错 答案: 错 3、病毒只含有一种核酸，DNA或RNA A:对
B:错 答案: 对 4、乙肝大三阳时，以下哪些项应为阳性 A:HBsAg B:HBeAg C:HBcAg D:抗HBc E:抗HBs 答案: HBsAg,HBeAg,抗HBc 第二章 1、可传播HIV的途径有 A:分娩 B:共用牙刷、剃须刀等 C:输血、血浆及血液制品 D:手术器械 E:皮肤接触 答案: 分娩,共用牙刷、剃须刀等,输血、血浆及血液制品,手术器械 2、狂犬病防治措施有 A:捕杀病犬加强家犬管理 B:人被咬伤后应及时处理伤口 C:动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗
D:及时足量注射丙种球蛋白 E:对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清 答案: 捕杀病犬加强家犬管理,人被咬伤后应及时处理伤口,动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗,对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清 第三章 1、DNA的Tm值大小与下列哪个因素有关 A:温度的升高 B:酸碱度的改变 C:DNA的均一性 D:化学试剂 E:缓冲液 答案:B 2、下列哪项决定了PCR特异性与产量( ) A:变性温度 B:退火温度 C:延伸温度 D:循环次数 E:二价阳离子 答案:B 3、基因分型的传统方法是( )
病毒学检验
病毒的特点是：1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA）4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染 细胞培养技术：是对由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的体外培养方法，即模拟体内的生理环境条件，提供细胞适宜的营养条件和温度，在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术 二、单层细胞培养： 用于培养病毒的细胞有原代细胞、传代细胞（二倍体细胞株和传代细胞系） 三、鸡胚的接种途径：1、羊膜腔接种2、绒毛尿囊膜接种3、尿囊腔接种4、卵黄囊接种 四、 间接计数在病毒检验过程中较为常用，是判定病毒感染性的定量方法，常用的有：空斑形成单位法，50%终点法，血凝试验和干扰测定 空斑形成单位（PFUs）试验：是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度 凡事能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。 50%终点法：是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。 LD50：为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量 ID50：即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量 CCID50：造成50%细胞培养产生病变效应的剂量 五、病毒纯化的一般原则：1、释放病毒至细胞外2、去除细胞碎块3、病毒悬液浓缩 六、病毒的保存：1、用低温（-60~25℃）、超低温（-70以下）冰箱或液氮罐（-196~150）保存 2、冷冻干燥保存 七、血清学实验的方法很多，最常用的是中和试验、补体结合试验、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验 中和试验：是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。 中和抗体：凡是能与病毒结合，并使其失去感染力的抗体称为中和抗体 中和试验必须在敏感的动物体内（包括鸡胚）和细胞培养中进行
微生物学检验题库及答案
微生物学检验题库及答案
《微生物学与检验》题库及答案 一.名词解释 1.医院感染 2.肥达反应 3.内基小体 4. 噬菌体： 5.血浆凝固酶 6.败血症 7.灭菌 8.药物敏感试验 9.外 - 斐氏试验 10.L 型细菌 11.菌群失调： 12.微生物 13.细菌 14.最小抑菌浓度 15.菌落 16.汹涌发酵 17.无菌操作 18.流感杆菌“卫星现象” 19.培养基 20.包涵体 21.正常菌群 22. 内毒素 23. 干扰现象： 24.菌血症 25菌丝： 二.填空题 1 L 型细菌是指（）。 2 杀灭物体上所有微生物的方法称为（）。 3 细菌 H-O 变异是指（）。 4 药敏试验所用标准培养基是，所用菌液相当于（）个细菌／ ml ，细菌接种采用（）划线接种法。 5 细菌致病因素包括（）、（）和（）。 6 细菌引起的全身感染包括（）、（）、（）和（）四种类型。 7 不染色标本检查主要用于观察细菌的（）。 8 影响革兰染色结果的关键步骤是（）。 9 有动力细菌在半固体培养基中的生长现象是穿刺接种线（），无动力细菌穿刺接种线（）。 10 糖发酵试验用于观察细菌分解糖是否产（）和（）。 11 靛基质试验的原理为，细菌产生的色氨酸酶分解蛋白胨中的色氨酸而生成（），此代谢产物与加入的试剂反应，生成（）。 12 链球菌根据溶血现象分为（）、（）和（）三种类型。 13 葡萄球菌触酶试验结果为（）性，链球菌触酶试验结果为（）性。 14 呈现脐窝状菌落的球菌是（）。 15 抗 O 试验是测定病人血清中（）抗体效价的试验，用于风湿热等疾病的辅助诊断。 16 血平板上呈现草绿色溶血环的病原性球菌是（）和（）。 17 IMViC 试验包括（）、（）、（）和（）四项试验。 18 分解乳糖的细菌在肠道选择平板上呈现（）菌落，不分解乳糖则为（）菌落。 19 KIA 斜面红色表明，底层黄色、有气泡表明（）、（），有黑色沉淀表明（）试验阳性 20 霍乱弧菌生物型包括（）和（）。 21 AIDS 的传染源是（）和（），传播途径主要有（），（）和（）。 22 真菌菌落有（）、（）和（）三种。 23 病毒培养方法有（）、（）和（）。 24 病毒的基本结构由（）和（）组成，有些病毒还具有（）。 25 流感病毒根据抗原结构不同分（）、（）、（）三型，其中容易引起流感大流行的是其中的（）型。
智慧树知到《病毒学检验》章节测试答案
智慧树知到《病毒学检验》章节测试答案绪论 1、用于测量病毒大小的单位是： A．μm B．nm C．pm D．fm E．am 答案: nm 第一章 1、PCR反应的引物需要2条。 A:对 B:错 答案: 对 2、甲型肝炎病毒归属于嗜肝DNA病毒科 A:对 B:错 答案: 错 3、病毒只含有一种核酸，DNA或RNA A:对 B:错 答案: 对
4、乙肝大三阳时，以下哪些项应为阳性 A:HBsAg B:HBeAg C:HBcAg D:抗HBc E:抗HBs 答案: HBsAg,HBeAg,抗HBc 第二章 1、可传播HIV的途径有 A:分娩 B:共用牙刷、剃须刀等 C:输血、血浆及血液制品 D:手术器械 E:皮肤接触 答案: 分娩,共用牙刷、剃须刀等,输血、血浆及血液制品,手术器械 2、狂犬病防治措施有 A:捕杀病犬加强家犬管理 B:人被咬伤后应及时处理伤口 C:动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗 D:及时足量注射丙种球蛋白 E:对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清 答案: 捕杀病犬加强家犬管理,人被咬伤后应及时处理伤口,动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗,对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清
第三章 1、DNA的Tm值大小与下列哪个因素有关A:温度的升高 B:酸碱度的改变 C:DNA的均一性 D:化学试剂 E:缓冲液 答案:B 2、下列哪项决定了PCR特异性与产量（）A:变性温度 B:退火温度 C:延伸温度 D:循环次数 E:二价阳离子 答案:B 3、基因分型的传统方法是（） A:反向杂交 B:质谱 C:基因芯片技术 D:焦磷酸测序技术 E:超深度焦磷酸测序 答案:A
病毒学检验重点
病毒的特点： 1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。 2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质 3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA） 4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸 5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒 6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性 7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力 8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染 体外细胞培养的基本条件： 1、条件要求高，培养液组分复杂，需要添加血清才能满足生长需要 2、避免微生物污染，需要在培养液中加入抗生素。 3、体外细胞培养的基本要求主要包括细胞接种（尽量选择对数期细胞接种）、 4、培养液营养成分、 5、酸碱度（能耐受的ph范围为6.6-7.8，依靠缓冲系统调节）、 6、气体条件（细胞生长需要CO2 ，大规模培养需要有足够的氧气）、 7、温度（最适温度为35-37。C）、 8、水的纯度（一般要求去离子水或三蒸水）、 9、无菌条件等 实验动物的微生物控制分类： 1、普通动物，一级动物，要求不携带动物烈性传染病和人兽共患病病原 2、清洁动物，二级动物，在一级动物要求上，不携带对动物危害大、对实验干扰大的 病原体，外观健康，主要器官不得有组织病理学病变 3、无特定病原体动物，三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带病原体外，还要求 排除潜在感染或条件致病菌的感染 4、无菌动物，四级动物，要求在体内外不得检出其它生命体 实验动物的遗传学分类 1、近交系，指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系 2、封闭系，不从外界引入新的血缘，非近亲交配方式的实验动物群体 3、突变系，由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状的动物 4、杂交群动物，由不同品系杂交所产生的后代 5、转基因动物，插入外源基因后能正常繁殖的动物 大鼠、小鼠的采血方法 1、剪尾采血，动物麻醉后，将尾端剪去约5mm，待血液流出采集，小鼠可每次采血 0.1ml，大鼠约0.4ml 2、眼眶后静脉丛采血，拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤固定，轻轻压迫颈部两侧， 使眼球充分外凸。采血管插入眼角与眼球之间，向眼底方向刺入，切开静脉丛，血流即流入取血管。
常规病毒学实验技术
常规病毒学实验技术 （一）病毒的培养 实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠 主要用于： ①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒 ②培养病毒，制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验） ④制备免疫血清和单克隆抗体 ⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等 注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。 鸡胚 （一）条件要求 SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。 （二）优点 组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。 （三）接种途径 1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚） 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 1）方法一（造人工气室） ①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的 烤焦圈。 ②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。 ③在气室端中央钻一个小孔。 ④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。 ⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压， 使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。 ⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。 ⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的 小孔用石蜡密封。 ⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。 2）方法二 ①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。 ②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。 ③滴入接种物。 ④用透明胶纸封闭开口。 2．尿囊腔接种（10-11日龄） 用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）
第十四章 病毒学实验技术
第三篇病毒学实验技术 实验学时计划：实验一实验须知6小时；实验二细胞培养用水的制备及检验15小时；实验三组织培养技术20小时；实验四病毒的分离及其理化性质的测定20小时；实验五病毒提纯技术15小时。 实验一实验须知 一、实验室注意事项 1．凡参加病毒学实验的人员均应接种与实验有关的病毒疫苗。 2．实验室内，特别是组织培养操作室，须经常保持干燥、清洁。在进行病毒接种或无菌操作前后，均应用紫外线照射灭菌，必要时可用3～5%的酚或煤酚皂溶液擦拭或喷雾消毒。 3．进入操作室，须先洗净双手并用消毒药水严格消毒；更换拖鞋，戴口罩和帽子，穿消毒的实验服。 4．病毒实验操作完毕后，将所穿戴实验服、口罩、帽子和拖鞋等物，出操作室前须更换；两手须经消毒药水严格浸洗后方能外出。 5．一个接种操作室，严禁同时进行两株病毒株的传种；吸取病毒材料时，勿于悬空吹出或打出。 6．凡沾病毒材料的吸管、试管等器具，须随时投入5%煤酚皂或1%盐酸溶液内，浸泡过夜，或煮沸消毒后才能进行洗涤。 7．凡带有感染性的鸡胚或动物尸体，须立即投入炉内焚化或进行煮沸消毒，或盛入容器内进行高压消毒后，方能携出室外进行处理。 8．工作人员要随时注意安全操作，以免发生事故；如发生意外，应迅速采取有效措施补救。 二、病毒材料收集、运送和保存 （一）材料的收集 分离病毒的成功率与采集材料有密切的关系。采集病料必须在适当的部位和时间内进行，前者与各种传染的发病机理有关，后者常规在疾病早期，因为通常在疾病刚出现时病毒的滴度高。各种病毒感染所采适宜病料参见图1和图2。 由于许多病毒的不稳定性，欲作病毒分离的材料，都应尽快的冷藏。－30℃保存的病毒材料（除少数例外），至少可以活存几个月以上；而－70℃保存的病毒，甚至几年不见毒力降低。有些病毒需在潮湿环境下保存，有的则需干燥环境（如Orf virus）。
分子生物学实验技术实验内容
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 二）反转录 实验安排： 每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样 μl4 5× Buffer
病毒学实验
实验一病毒对细胞的感染 目的：病毒对细胞的感染具有高度的特异性，通过该实验掌握病毒感染细胞的实验操作，并进一步理解病毒对宿主细胞的选择性。 材料：杆状病毒Sf9细胞 器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器 步骤： 1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%； 2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜； 3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基；同时设立空白对照； 4、28℃培养24-48h，对照观察细胞病变。 实验二病毒的扩增与收集 目的：病毒属于严格细胞内寄生生物，故只能在其敏感宿主细胞内进行有效增殖。通过该实验掌握病毒的扩增及收集、储存方法。材料：杆状病毒Sf9细胞 器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器、低温高速离心机、离心管，滤器 步骤：
1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%； 2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜； 3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基； 4、28℃培养24-36h，观察细胞裂解情况； 5、吹吸细胞，并转移细胞裂解物至无菌冰预冷离心管； 6、4℃，12000rpm,10min，取上清； 7、滤器过滤上清，取滤液，分装于无菌冻存管，避光保存于4℃或-20℃或-80℃. 实验三病毒的敏感性测定 目的：不同类型的病毒对不同理化因子的敏感性存在着显著差异。本实验拟检测杆状病毒对高温及有机溶剂的敏感性，以加深对病毒理化因子敏感性差异的理解。 材料：杆状病毒Sf9细胞乙醚氯仿 器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器，水浴锅 步骤： 1、氯仿预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为5%的氯仿，混匀，4℃静置1h，2000rpm，10min，取上清备用；同样，取等量病毒不加氯仿于4℃同样处理备用（空白对照）； 2、乙醚预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为20%的乙醚，
药敏试验及抗体检测试验方法
药物敏感性试验 一试验前的准备工作 1高压灭菌平皿、棉签，灭菌后放入培养箱中烘干。 2按照营养琼脂上的说明来配制固体培养基，115℃高压灭菌15分钟。 3 将试验台进行紫外灯消毒15~30分钟。 二试验方法 1 先用酒精棉球擦拭试验台面然后再点燃酒精灯。 2 用酒精棉球消毒双手，将高压灭菌后的营养琼脂倒入玻璃平皿的三分之一高度。 3 将倒好琼脂的平皿水平放置在试验台上，让琼脂冷却凝固同时打开紫外灯消毒15分钟。 4 将采集好的病料如带菌棉签、肝脏、肠道、脾脏等直接涂于培养基上，涂抹均匀后直接贴药敏片。 5 将贴好药敏片的平皿放入恒温培养箱中37℃培养16~18小时。 6 观察试验结果测量抑菌直径。 三结果判定
血凝试验与血凝抑制试验 一试验材料 离心机及离心管、冰箱、微量振荡器、96孔v型板、微量移液器、一次性吸头、注射器、天平 二试验用试剂 1 抗凝剂用天平称量3.8g柠檬酸钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。 2 生理盐水 3 标准抗原 4 1%红细胞悬液 由鸡心脏采血或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管中（抗凝剂：全血=1:2的比例）。2500转离心8分钟。用吸管吸去上清液和红细胞沉淀上层白色沉淀层，将沉淀的红细胞用生理盐水混匀后离心，如此反复离心4~5次。若要配制10ml的1%红细胞悬液需取0.1ml红细胞沉淀，加入9.9ml的生理盐水中混匀即可。 5 被检血清 由鸡心脏或翅静脉采血0.5ml静置或离心，待血清析出后备用。 6 被检卵黄 收集鸡蛋，用清水洗净蛋壳外表，取卵黄液1ml ，加生理盐水1ml，充分混匀后备用。 三实验方法 （一）血凝试验
动物病毒学(DOC)
《动物病毒学》实验课 讲稿 任课教师：方六荣 授课对象：2002级动物医学专业1-4班 授课时间：2004.09-2005.01
目录 实验一鸡胚接种 (1) 实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 (6) 实验三原代细胞培养 (9) 实验四病毒TCID50的测定 (11) 实验五中和试验 (13)
实验一鸡胚接种 一、实验目的 了解鸡胚的基本结构与功能及鸡胚接种的方法，掌握常用的鸡胚接种方法。 二、鸡胚接种的作用 主要用于： ①分离病毒，并根据病变初步鉴定病毒 ②培养病毒，制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系（用鸡胚作中和试验和交叉保护实验） ④测定病毒毒力 三、材料 1、鸡胚10日龄 2、病毒鸡传染性支气管炎病毒（IBV） 3、照蛋灯 4、打孔器 5、石蜡 6、注射器 7、蛋座 8、酒精棉球、碘酊棉球 四、鸡胚用于病毒培养的优缺点 （一）优点 1、组织分化程度低 2、可选择不同的日龄和接种途径 3、病毒易于增殖 4、感染病毒的组织和液体中含大量病毒 5、容易采集和处理 6、来源充足 7、设备和操作简便易行 （二）缺点 1、胚内可能污染细菌和病毒 沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒 2、母源抗体 3、许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针
五、鸡胚的结构与功能 1、卵壳上有细孔，进行气体交换 2、壳膜使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。 3、气室呼吸和调节压力 4、绒毛尿囊膜起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。 5、尿囊腔胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中 尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。 6、羊膜与羊膜腔其中盛有羊水，胎体浸泡于其中 7、卵黄在胚胎发育早期供给鸡胚营养。 8、卵白在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。 六、受精卵的选择 1、最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响。 2、受精卵的壳最好是白色的，以便于检卵。 3、受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。 七、鸡胚的孵育 1、孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ 2、相对湿度：50%-60% 3、必须保证具有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后