改良甲苯胺蓝染色法

pression of M DM2in primary(de nov o)glioblastomas.J Neuropathol Exp Neurol,1997,56:1802185.

5Jung JM,Bruner JM,Ruan S,et al.Increased levels of p21W AF1/ Cip1in human brain tum ors.Oncogene,1995,11:202122028

6Hermans on M,Funa K,K oopmann J,et al.Ass ociation of loss of het2 erozyg osity on chrom os ome17p with high platelet derived growth factorαreceptor expresslon in human malignant gliomas.Cancer Res,1996,56: 1642171.

7Ng HK,Lau K M,Tse J Y,et al.C ombined m olecular genetic studies of chrom os ome22q and the neurofibromatosis type2gene in central nerv ous system tum ors.Neurosurg,1995,37:7642773.

8Y ahanda AM,Bruner JM,D onehower LA,et al.Astrocytes derived from p532deficient m ice provide a multistep in vitro m odel for develop2 ment of malignant gliomas.M ol Cell Biol,1995,15:424924259.

9Louis DN.A m olecular genetic m odel of astrocytoma histopathology.

Brain pathol,1997,7:7552764.

10Ueki K,Ono W,Hens on JW,et al.CDK N2/p16or RB alterations oc2 cur in the majority of glioblastomas and are inversely correlated.Cancer Res,1996,56:1502153.

11R ollbrocker B,W aha A,Louis DN,et al.Am plifcation of the cyclin2 dependent kinase4(CDK4)gene is ass ociated with high cdk4protein levels in glioblastoma multiforme.Acta Neuropathol,1996,92:70274. 12Ono Y,T am iya t,Lchikawa T,et al.M alignant astrocytomas with ho2 m ozyg ous CDK N2/p16gene deletions have higher K i267proliferation in2 dices.J Neuropathol Exp Neurol1996,55:102621031.

13R osenberg J E,Lisle DK,Burwick JA,et al.Refined deletion mapping of the chrom os ome19q glioma tum or suppress or gene to the D19S4122 ST D interval.Oncogene,1996,13:2483.

14S onoda Y,Lizuka M,Y asuda J,et al.Loss of heterozyg osity at11p15in

malignant glioma.Cancer Res,1995,55:216622168.

15Rasheed BK A,M clendon RE,Friedman HS,et al.Chrom os ome10 deletion mapping in human gliomas:a comm on deletion region in10q25.

Oncogene,1995,10:224322246.

16S teck PA,Pershouse M A,Jasser S A,et al.Identification of a candidate tum our suppress or gene,M M AC1,at chrom os one10q23.3that is mutat2 ed in multiple advanced cancers.Nature G enet,1997,15:3562362.

17Cheney IW,Johs on DE,Vaillancourt M,et al.Suppression of tum ori2 genicity of glioblastoma cells by adenovirus2mediated M M AC1/PTE N gene.Cancer Res,1998,58:233122334,

18Shayester L,Lu Y,K uo W L,et al.PIK3CA is im plicated as an onco2 gene in ovarian cancer.Nat G enet,1999,21:992102

19Leung SY,Chan T L,Chung LP,et al.M icrosatellite instability and mu2 tation of DNA m ismatch repair genes in gliomas.Am J Pathol,1998, 153:118121188.

20G oldman CK,K im J,W ong W J,et al.E pidermal growth factor stimu2 lates vascular endothelial growth factor production by human malignant glioma cells:a m odel of glioblastoma multiforme pathophysiology.M ol Biol Cell,1993,4:1212133.

21Biemat W,T ohma Y,Y onekawa Y,et al.Alterations of cell cycle regu2 latory genes in primary(de nov o)and secondary gliobiastoma.Acta Neu2 ropathol,1997,94:3032309.

22T ohma Y,G ratas C,Biernat W,et al.PTE N(M M AC1)mutations are frequent in primary glioblastomas(de nov o)but not in secondary glioblas2 tomas.J Neuropathol Exp Neurol,1998,57:6842689.

23M eyer2Puttlitz B,Hayashi Y,W aha A,et al.M olecular genetic analysis of giant cell glioblastomas.Am J Pathol,1997,151:8532857.

(收稿:1999203215)

(本文编辑:常秀青)

?技术交流?

改良甲苯胺蓝染色法密方元　杨洪才

在常规病理工作中,为观察肿瘤的性质和预后,需对脑肿瘤标本作尼氏小体染色,在做动物实验时,也需对动物的脑组织进行尼氏小体染色,以观察神经元的存活情况。我们对原甲苯胺蓝染色法进行了一些改良,效果令人满意,现介绍如下。

一、材料和方法

11材料:作鼠脑损伤后应用人神经生长因子预防神经元死亡研究的雄性大鼠脑组织18例,冷冻切片10μm;人体尸检脑组织和正常小白鼠脑组织各2例,4%甲醛固定24小时,经常规法脱水,浸蜡,石蜡切片10μm。

21方法:(1)石蜡切片用二甲苯脱蜡,酒精清洗至水,冷冻切片无需此步骤;(2)1%甲苯胺蓝(上海试剂三厂生产,批号79047)水溶液室温下染3分钟,自来水清洗;(3)95%酒精分化至不掉色,显微镜下观察至尼氏小体清晰时止,水洗: (4)复染015%伊红染液1～2秒钟;(5)水洗切片后用吸水纸吸干切片上的水分,二甲苯透明,中性树胶封片。

二、结果

神经细胞中的尼氏小体呈深蓝色,胞核若无色,切片背作者单位:210002　南京,解放军第八一医院病理科景呈淡红色。鼠脑组织和人体尸检脑组织的染色结果一致,冷冻切片和石蜡切片的鼠脑组织染色结果一致。

三、讨论

原甲苯胺蓝法要求将甲苯胺蓝染液预热至50℃,再置56℃温箱染15～20分钟。在预实验中,我们按照原法加温染色均不满意,染色分化困难或无法分化。后来我们在室温下分别染1,3和5分钟,经分化后,认为染3分钟效果最好。

原甲苯胺蓝染色法显示的尼氏小体呈深蓝色,其背景为淡蓝色,尼氏小体与背景对比不够鲜明是其缺点,给观察带来一定的难度,我们在工作中试用伊红作复染,也即增加了一步复染步骤。采用伊红复染后,尼氏小体和背景对比清晰,比未复染伊红者明显清晰可辨。

病理状态下神经细胞中的尼氏小体会发生数量和位置的改变,实验动物受伤或病变时尼氏小体也会减少或消失。改良后的甲苯胺蓝染色法比原法简便,无须加温,结果清晰,便于观察和照像,有助于某些脑肿瘤的诊断和一些实验动物的研究。

(收稿:1998206210 修回:1999201214)

(本文编辑:常秀青)

?中华病理学杂志1999年6月第28卷第3期　Chin J Pathol,June1999,V ol28,N o.3

实验2 细菌的芽孢染色和荚膜染色

实验二细菌的芽孢染色和荚膜染色生物111班杨明轩1102040128 一、实验目的 1、学习并掌握细菌芽胞染色的原理和方法。 2、学习并掌握细菌荚膜染色的原理和方法。二、实验原理（一）细菌的芽孢染色芽孢通常指某些细菌在生长后期于细胞内形成的一种圆形、椭圆形或圆柱形的、厚壁、折光性高、含水量极低而抗逆性极强的内生休眠体。芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染色剂亲合力不同的原理，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈现出不同的颜色而加以区别。芽孢通常具有厚而致密的壁，透性低，不易着色和脱色，当用着色力强的弱碱性染色剂孔雀绿在加热条件下染色师，芽孢和菌体同时着色，进入菌体的染色剂可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。经对比度大的复染液番红染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，呈绿色；而菌体被复染剂染成红色，易于区别。（二）细菌的荚膜染色荚膜是包围细菌细胞的一层粘液性物质，具有明确的外缘，牢固地附着在菌体细胞壁外；荚膜的主要成分是多糖，不易着色，其含水量高达90%以上，易变形。荚膜染色通常采用衬托染色法或称负染法，即将菌体和背景分别着色，从而把不着色且透明的荚膜给衬托出来。三、实验材料 1、菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），26~28℃培养2~3天；钾细菌（Bacillus mucilaginosus），点接于阿须贝平板上，26~28℃培养3天。 2、染色剂：孔雀绿染液、番红染液，石炭酸复红、墨汁（已过滤） 3、其他：载玻片、无菌水、洗瓶、擦镜纸、吸水纸、二甲苯、香柏油、接种用具四、实验方法（一）细菌的芽孢染色 1、制片：将枯草芽孢杆菌涂片、干燥固定。 2、染色：用吸水纸块盖住涂片处，然后在吸水纸张滴加孔雀绿染液至饱和。加热使染液微冒蒸汽后，保持5min。加热时应不断添加染液，不要使吸水纸干燥。 3、水洗：待玻片冷却后，用镊子除去吸水纸，再用水平轻轻冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 4、复染：用番红染液染色2~3min。 5、镜检：涂片干燥后，置油镜下观察。 6、清理：整理桌面，将显微镜恢复原样，将废片放入废片缸内。（二）细菌的荚膜染色 1、制片：在洁净的载玻片的中央滴加1滴无菌水，取少许钾细菌制成涂片，在空气中风干。 2、染色：用石炭酸复红在涂片处染色4~5min，水洗，稍风干。 3、滴加一滴墨汁在载玻片的一侧，左手持此玻片，右手拿一干净玻片作推片用。将推片边缘凭证的一端与混合菌液成30°胶接触，顺势将菌液推开（不要太用力），使其涂成一薄层，并在空气中充分自然干燥。 4、镜检：玻片自然干燥后，置油镜下观察。

革兰氏染色的实验原理

革兰氏染色的实验原理 ●G＋细胞壁的网状结构致密，交联度高，用乙醇处理后，发生脱水作用，肽聚糖层孔径缩小，透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。 ●G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染呈红色。涂片固定→结晶紫初染（碱性）→碘液媒染→乙醇（丙酮）脱色→番红复染（碱性）

◆◆◆原理：当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的兰紫色，碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有舦聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，用酒精脱色时细胞壁脱水，使舦聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同，由于其细胞壁舦聚糖层较薄，类脂含量较高，，所以当脱色处理时，类脂质被酒精溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 ◆◆实验步骤： 1、制片涂片——干燥——固定 2、初染滴加结晶紫染色1——2分钟，水洗； 3、媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟； 4、脱色滴加95%酒精脱色，25-30秒，立即水洗； 5、复染用番红液复染约2分钟，水洗； 6、镜检干燥后，用油镜观察。细菌：细菌是一种具有细胞壁的单细胞微生物，在适宜条件下，能进行无性二分裂繁殖，其形态和结构相对稳定。一般体积微小，通常需要借助光学显微镜才能看到，其测量单位用微米表示。

软骨染色液(甲苯胺蓝法)染色步骤及注意事项

软骨染色液(甲苯胺蓝法)染色步骤及注意事项货号：G2543 规格：100ml 保存：室温，避光，12个月。产品说明：甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)是一种常用的人工合成染料,属于醌亚胺染料类。这类染料主要含有胺基和醌型苯环两个发色团，从而成色原显色。甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用,组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团，还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色；肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色。甲苯胺蓝染色液(甲苯胺蓝法)呈强碱性，更利于组织细胞的着色。操作说明：（仅供参考） 1、常规脱钙，包埋，固定。 2、石蜡切片入二甲苯2次。 3、系列乙醇各1min。自来水洗2min。 4、入Toluidine Blue O Stain浸染30min。根据不同组织，染色时间不完全相同。 5、自来水洗2min，滤纸吸干水分。 6、丙酮分化至软骨细胞呈紫蓝色清楚可见。 7、逐级乙醇脱水。 8、二甲苯透明，中性树胶封固。染色结果：软骨、成骨细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。

注意事项： 1、第一次使用本试剂时建议先取1-2个样品做预实验。 2、针对于胃粘膜组织、软骨组织等较难着色组织的染色，浸染于甲苯胺蓝染色液的时间应相应延长。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。相关试剂： G3661甲苯胺蓝染色液(1%,磷酸盐法) G3662甲苯胺蓝染色液(0.5%,磷酸盐法) G3665甲苯胺蓝染色液(0.5%,硼酸盐法)

甲苯胺蓝染色液(0.5%,磷酸盐法)使用说明

甲苯胺蓝染色液(0.5%,磷酸盐法)使用说明货号：G3662 规格：100ml 保存：室温，避光，12个月。产品说明：甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)是一种常用的人工合成染料,属于醌亚胺染料类。这类染料主要含有胺基和醌型苯环两个发色团，从而成色原显色。甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用,组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团，还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色。肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色。操作说明：（仅供参考） (一)肥大细胞染色 1、脱蜡至蒸馏水。 2、浸染于甲苯胺蓝染色液10-15min，具体的染色时间根据切片厚度和组织的不同而定。 3、蒸馏水或去离子水轻轻冲洗。 4、(可选)0.5%冰乙酸分化，直到细胞核和颗粒清晰可见。 5、快速95%和无水乙醇脱水。 6、二甲苯透明，封固。染色结果：肥大细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 (二)软骨染色 1、石蜡切片入二甲苯2次每次15min。

2、系列乙醇各1min。 3、自来水洗2min。 4、入Toluidine Blue O Stain浸染30min。 5、自来水洗2min，滤纸吸干水分。 6、丙酮分化至软骨细胞呈紫蓝色清楚可见。 7、逐级乙醇脱水。 8、二甲苯透明，中性树胶封固。染色结果：软骨、成骨细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 (三)细胞涂片染色 1、用20%的乙醇溶液稀释甲苯胺蓝染色液,一般要求稀释到0.1%即可。 2、细胞涂片后，立即放入95%的乙醇中固定，取出放在纸巾上。 3、滴加稀释后的甲苯胺蓝染色液进行滴染，加盖玻片让染料渗透到细胞中。 4、将玻片竖起，稍加压力，使多余染料被纸巾吸去。 5、无需干燥，直接镜检。染色结果：细胞核、淋巴细胞呈深蓝色；核仁呈紫红色；红细胞呈橘红；细胞质、单核细胞呈淡蓝色。 (四)原位杂交染色 1、用蒸馏水或去离子水稀释到相应的浓度，凭经验一般稀释比例大于1:100。 2、玻片在稀释好的染色液中短暂浸泡。 3、在蒸馏水或去离子水浸泡数次。 4、按需求进行压片固定。注意事项：

(实验)细菌的荚膜染色

(实验)细菌的荚膜染色（一）实验目的：学习细菌的荚膜染色法：（二）实验原理：由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。（三）实验器材 1.活材料：培养3-5天的胶质芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus，俗称“钾细菌”）。该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，荚膜丰厚。 2.染色液和试剂：Tyler法染色液：（见附二、（一）、14）、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液（见附二、（一）、2）、黑素（见附二、（一）、7）、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。 3.器材：载玻片、玻片搁架，擦镜纸、显微镜等。（四）实验方法推荐以下四种染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。 1.负染色法：（1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。（2）干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。（3）染色：在涂面上加复红染色液染色2—3min。（4）水洗：用水洗去复红染液。（5）干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。（6）涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。（7）镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。结果：背影灰色，菌体红色，荚膜无色透明。 2.湿墨水法（1）制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。（2）加盖玻片放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。（3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。 3.干墨水法

革兰氏染色法的步骤

革兰氏染色法的步骤详细阐叙革兰氏染色法的步骤浏览次数:174次悬赏分:0 |解决时间:2011-5-25 17:44 |提问者:肖箫 2011shaw 最佳答案革兰氏染色一、目的:在细胞发放之前,利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测,判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。二、原理: 通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色。三、实验用品准备: 灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器四、操作: 1 涂片:取灭过菌的载玻片于实验台上,用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央,用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层,涂布面不宜过大。 2 干燥:将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。 3 固定:固定常常利用高温,手持载玻片的一端,标本向上,在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次,共约2-3秒种,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60℃),放置待冷后,进行染色。 4 初染:在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴,使染色液覆盖涂片,染色约 1min。 5 水洗:斜置载玻片,在自来水龙头下用小股水流冲洗,直至洗下的水呈无色为止。 6 媒染:用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上,使染色液覆盖涂片,染色约1min。

甲苯胺蓝染色液(1%,磷酸盐法)

甲苯胺蓝染色液(1%,磷酸盐法) 简介：甲苯胺蓝(T oluidine Blue O)是一种常用的人工合成染料, 属于醌亚胺染料类, 这类染料主要含有胺基和醌型苯环两个发色团，从而成色原显色。甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用, 组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类, 帮助发色团对组织产生染色力, 使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色。组成：操作步骤(仅供参考)： (一)肥大细胞染色 1、脱蜡至蒸馏水。 2、根据切片厚度和组织的不同，浸染于甲苯胺蓝染色液。 3、蒸馏水或去离子水轻轻冲洗。 4、(可选)0.5%冰乙酸分化，直到细胞核和颗粒清晰可见。 5、快速95%和无水乙醇脱水。 6、二甲苯透明，封固。染色结果：肥大细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 (二)软骨染色 1、石蜡切片入二甲苯2次每次。 2、系列乙醇各1min 。 3、自来水洗2min 。 4、入Toluidine Blue O Stain 浸染。 5、自来水洗2min ，滤纸吸干水分。 6、丙酮分化至软骨细胞呈紫蓝色清楚可见。 7、逐级乙醇脱水。 8、二甲苯透明，中性树胶封固。染色结果：软骨、成骨细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 (三)细胞涂片染色编号名称 DA0055 Storage Toluidine Blue O Stain(1%,磷酸盐法) 100ml RT 避光使用说明书 1份

1、用20%的乙醇溶液稀释甲苯胺蓝染色液, 一般要求稀释到0.1%即可。 2、细胞涂片后，立即放入95%的乙醇中固定，取出放在纸巾上。 3、滴加稀释后的甲苯胺蓝染色液进行滴染，加盖玻片让染料渗透到细胞中。 4、将玻片竖起，稍加压力，使多余染料被纸巾吸去。 5、无需干燥，直接镜检。染色结果：细胞核、淋巴细胞呈深蓝色；核仁呈紫红色；红细胞呈橘红；细胞质、单核细胞呈淡蓝色。 (四)原位杂交染色 1、用蒸馏水或去离子水稀释到相应的浓度，凭经验一般稀释比例大于1:100。 2、玻片在稀释好的染色液中短暂浸泡。 3、在蒸馏水或去离子水浸泡数次。 4、按需求进行压片固定。注意事项： 1、针对于胃粘膜组织、软骨组织等较难着色组织的染色，浸染于甲苯胺蓝染色液的时间应相应延长。 2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

微生实验报告 2012.10.10 实验一细菌的简单染色和革兰氏染色

微生实验报告姓名： xx 专业年级：2011级生物技术学号：1032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。二、实验原理用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔

径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。三、实验器材 1、菌种：金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂：草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚：乙醇=7:3），xx柏油。 3、器材：废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。四、实验方法（一）简单染色 1．涂片：取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干：让涂片自然晾干。 3．固定：

实验五细菌的荚膜染色

实验五细菌的荚膜染色生物112 周泓兆1102040226 一、目的学习并掌握荚膜染色的原理及方法。二、原理荚膜的主要成分为多糖类，不宜着色，而且含水量高达90%以上，易变形，因此荚膜染色通常采用负染法，将菌体和背景分别着色，从而把不透明的荚膜衬托出来。三、材料 1.菌种：钾细菌（Bacillus mucilaginous），点接于阿须贝平板上，26℃-28℃培养三天。 2.染色剂：石炭酸复红，墨汁（使用前必须用滤纸过滤，除去墨汁中的杂质） 3.其它：载玻片，无菌水，洗瓶，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，酒精棉球，接种环，酒精灯，镊子。四、实验步骤 1.制片：在洁净载玻片上左右两侧各滴加一滴无菌水，取少许培养72小时的钾细菌制成涂片，空气中风干； 2.染色：用石炭酸复红与孔雀绿，分别在两涂片处染色1-2分钟，水洗，稍风干； 3.在载玻片的一侧滴加半滴到一滴墨汁，左手持此玻片，右手另拿一干净玻片做推片用，将推片边缘平整的一端与墨汁成30°角接触，顺势将墨汁推开，使其涂成一薄层，并在空气中充分自然干燥； 4.镜检：玻片自然干燥后，滴加香柏油，置于油镜下观察，菌体为红色（石炭酸复红染色）或绿色（孔雀绿染色），荚膜无色，背景黑色； 5.清理：用二甲苯与干净擦镜纸擦净镜头，将涂片和直接固体垃圾置入垃圾桶，液体垃圾倒入废液缸，无腐蚀性毒性液体可倒入下水道，用酒精棉球擦洗器材将溅出的染料擦除。五、结果与讨论：这个实验成功率较低，主要问题出现在以下几个方面：①如果取菌过少在镜检时会很难找到菌体，而如果取菌过多则涂片很难涂匀，会看到菌体形成菌胶团，无法观察到荚膜形状。 ②染色时间不能太短，否则无法看清菌体。而染色如果过长则会导致荚膜也被染上颜色。③尽可能挑取边缘的菌种，而且涂抹的时间不宜过长，否则会发现许多菌体破裂，影响观察。 ④涂抹墨汁的时候要求墨汁量少，而且要尽可能涂的均匀，才能明显看到荚膜形状。六、思考题 1.简单染色能否观察细菌荚膜？请解释原因。答：不能。荚膜主要成分为多糖，很难着色，通过简单染色无法染出荚膜，导致荚膜和背景均为透明的，因此无法观察到荚膜。 2.细菌的荚膜有何特点？在对其染色观察结果时应注意什么？答：细菌的荚膜含水量高达90%，在风干和染色过程中不应使其遇热。涂墨后风干时间也不宜过长，否则荚膜也会失水变形。

甲苯胺蓝染色液(0.5%,硼酸盐法)

甲苯胺蓝染色液(0.5%,硼酸盐法) 简介：甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)是一种常用的人工合成染料, 属于醌亚胺染料类, 这类染料主要含有胺基和醌型苯环两个发色团，从而成色原显色。甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用, 组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类, 帮助发色团对组织产生染色力, 使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色。另外，肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质，遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色，临床上经常用于肥大细胞染色。 Leagene 甲苯胺蓝染色液(Toluidine Blue,1%,硼酸盐法)由于硼酸盐缓冲液呈强碱性，更利于组织细胞的着色。组成：操作步骤(仅供参考)： (一)肥大细胞染色 1、脱蜡至蒸馏水。 2、根据切片厚度和组织的不同，浸染于甲苯胺蓝染色液。 3、蒸馏水或去离子水轻轻冲洗。 4、冰乙酸分化，直到细胞核和颗粒清晰可见。 5、快速和无水乙醇脱水。 6、二甲苯透明，封固。染色结果：肥大细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 (二)软骨染色 1、石蜡切片入二甲苯。 2、系列乙醇各。 3、自来水洗。 4、入Toluidine Blue O Stain ，浸染。 5、自来水洗，滤纸吸干水分。 6、丙酮分化至软骨细胞呈紫蓝色清楚可见。 7、逐级乙醇脱水。编号名称 DA0059 Storage Toluidine Blue O stain (0.5%,硼酸盐法) 100ml RT 避光使用说明书 1份

8、二甲苯透明，中性树胶封固。染色结果：软骨、成骨细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 (三)细胞涂片染色 1、用乙醇溶液稀释甲苯胺蓝染色液, 一般要求稀释即可。 2、细胞涂片后，立即放入乙醇中固定，取出放在纸巾上。 3、滴加稀释后的甲苯胺蓝染色液进行滴染，加盖玻片让染料渗透到细胞中。 4、将玻片竖起，稍加压力，使多余染料被纸巾吸去。 5、无需干燥，直接镜检。染色结果：细胞核、淋巴细胞呈深蓝色；核仁呈紫红色；红细胞呈橘红；细胞质、单核细胞呈淡蓝色。 (四)原位杂交染色 1、用蒸馏水或去离子水稀释到相应的浓度，凭经验一般稀释比例大于1:100。 2、玻片在稀释好的染色液中短暂浸泡。 3、在蒸馏水或去离子水浸泡数次。 4、按需求进行压片固定。注意事项： 1、针对于胃粘膜组织、软骨组织等较难着色组织的染色，浸染于甲苯胺蓝染色液的时间应相应延长。 2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。有效期：12个月有效。相关：编号名称 DA0056甲苯胺蓝染色液(0.5%,磷酸盐法) DC0032Masson三色染色液 DG0005糖原PAS染色液 DH0006苏木素伊红(HE)染色液 TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)

革兰氏染色实验

革兰氏染色实验革兰氏染色（Gram Staining）是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，可将细菌分成两类，即革兰氏阳性（Gram Positive）与革兰氏阴性（Gram Negative）。(这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年所发明)。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。阳性紫色，阴性红色革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌：革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要的病原菌。

革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐药，产生“新德里金属酶”（NDM-1）的绝大多数细菌都是革兰氏阴性菌（主要是大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌）。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的两大类细菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。细胞形态和结构细胞的基本结构包括细胞壁和原生质体两部分。原生质体位于细胞壁内，包括细胞膜（细胞质膜）、细胞质、核质和内含物。另外细胞还含有有些特殊结构，主要有荚膜、芽孢、鞭毛和菌毛等4种。 1.细胞壁

甲苯胺蓝染色液(软骨专用)使用说明书

甲苯胺蓝染色液(软骨专用)使用说明书货号：G2493 规格：100ml 保存：室温，避光，12个月。产品说明：甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)是一种常用的人工合成染料,属于醌亚胺染料类。这类染料主要含有胺基和醌型苯环两个发色团，从而成色原显色。甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用,组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团，还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色；肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色。甲苯胺蓝染色液(Toluidine Blue，1%，硼酸盐法)由于硼酸盐缓冲液呈强碱性，更利于组织细胞的着色。操作说明：（仅供参考） 1、常规脱钙，包埋，固定。 2、石蜡切片入二甲苯2次，每次15min。 3、系列乙醇各1min。自来水洗2min。 4、入Toluidine Blue O Stain浸染15-20min。根据不同组织，染色时间不完全相同。 5、自来水洗2min，滤纸吸干水分。 6、丙酮分化至软骨细胞呈紫蓝色清楚可见。 7、逐级乙醇脱水。 8、二甲苯透明，中性树胶封固。染色结果：软骨、成骨细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。注意事项： 1、第一次使用本试剂时建议先取1-2个样品做预实验。

2、针对于胃粘膜组织、软骨组织等较难着色组织的染色，浸染于甲苯胺蓝染色液的时间应相应延长。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。相关产品： G3661甲苯胺蓝染色液(1%,磷酸盐法) G3662甲苯胺蓝染色液(0.5%,磷酸盐法) G3665甲苯胺蓝染色液(0.5%,硼酸盐法)

实验二革兰氏染色法

实验二革兰氏染色法【实验目的】 1.学习并初步掌握革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 3.巩固显微镜油镜的使用方法。【实验仪器、材料】 1.菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌菌液。 2.染色剂：革兰氏染色试剂盒（结晶紫染色液、碘液、脱色液（95%乙醇）、复红染液）。 3.仪器及其他物品：显微镜、香柏油、无水乙醇、载玻片、擦镜纸、滤纸、酒精灯、试管架、废液缸、记号笔、接种环、镊子、打火机等。【实验内容】革兰氏染色法一、染色标本制备 1.涂片取一张洁净的载玻片，滴加少许生理盐水，用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，与生理盐水研磨均匀，做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（事先在载玻片的反面滴加菌液的相应位置做好标记） 2.干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥。(温度不宜过高) 3.固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常

用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。二、染色 l.初染滴加结晶紫覆盖菌膜，染lmin，自来水缓缓冲洗，甩去积水。 2.媒染滴加卢氏碘液，染lmin，水洗，甩去积水。 3.脱色滴加95%乙醇数滴，20s~30s，见紫色脱下立即用水冲洗，甩去积水。 4.复染滴加石炭酸复红液，染lmin，水洗，甩去积水，标本片用滤纸吸干。三、镜检待染色片充分干燥后，用油镜观察。【实验结果】葡萄球菌呈葡萄状排列，呈紫色，为革兰氏阳性菌；大肠杆菌为散在的短小杆菌，呈红色，为革兰氏阴性菌。注：绘图展示染色结果【结果分析、讨论（结论与评价）】注：分析你的染色结果是否正确？如果不正确，请分析原因。

甲苯胺蓝水溶液(0.1%)

甲苯胺蓝水溶液(0.1%) 简介：甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)是一种常用的人工合成染料, 属于醌亚胺染料类, 这类染料主要含有胺基和醌型苯环两个发色团，从而成色原显色。甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用, 组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类, 帮助发色团对组织产生染色力, 使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色。另外，肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质，遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色，临床上经常用于肥大细胞染色。 Leagene 甲苯胺蓝水溶液(0.1%)由甲苯胺蓝、去离子水组成，一般用于特殊细胞的染色，不推荐用于软骨、胃粘膜等难染组织的染色。组成：操作步骤(仅供参考)： (一)肥大细胞染色 1、脱蜡至蒸馏水。 2、根据切片厚度和组织的不同，浸染于甲苯胺蓝染色液。 3、蒸馏水或去离子水轻轻冲洗。 4、冰乙酸分化，直到细胞核和颗粒清晰可见。 5、快速和无水乙醇脱水。 6、二甲苯透明，封固。染色结果：肥大细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。 (二)细胞涂片染色 1、细胞涂片后，立即放入乙醇中固定，取出放在纸巾上。 2、滴加稀释后的甲苯胺蓝染色液进行滴染，加盖玻片让染料渗透到细胞中。 3、将玻片竖起，稍加压力，使多余染料被纸巾吸去。 4、无需干燥，直接镜检。染色结果：细胞核、淋巴细胞呈深蓝色；核仁呈紫红色；红细胞呈橘红；细胞质、单核细胞呈淡蓝色。 (三)原位杂交染色编号名称 DA0051 Storage 甲苯胺蓝水溶液(0.1%) 100ml RT 避光使用说明书 1份

实验三-普通光学显微镜的使用方法及细菌的革兰氏染色法

实验三普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色、革兰氏染色法生科15.2 周罡201500181104 【实验目的】 1.复习光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。 3.掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能，了解球菌、杆菌、放线菌、酵母、真菌在光学显微镜下的基本形态特征。 4.学习并掌握微生物的制片及简单染色的基本要求。 5.学习并掌握革兰氏染色法。 6.了解革兰氏染色原理。 7.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。【实验原理】（一）普通显微镜的基本原理 1.基本原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来昂达成像，故又称为复式显微镜。它们包括机械部

分和光学部分两部分。机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。 2.油镜微生物学使用的显微镜的物镜通常有低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），油镜是三者中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与

细菌的荚膜染色

细菌的荚膜染色（一）实验目的：学习细菌的荚膜染色法：（二）实验原理：由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。（三）实验器材 1.活材料：培养3-5天的胶质芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus，俗称“钾细菌”）。该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，荚膜丰厚。 2.染色液和试剂：Tyler法染色液：（见附二、（一）、14）、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液（见附二、（一）、2）、黑素（见附二、（一）、7）、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。 3.器材：载玻片、玻片搁架，擦镜纸、显微镜等。（四）实验方法推荐以下四种染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。 1.负染色法：（1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入

水滴中混匀并涂布。（2）干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。（3）染色：在涂面上加复红染色液染色2—3min。（4）水洗：用水洗去复红染液。（5）干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。（6）涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。（7）镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。结果：背影灰色，菌体红色，荚膜无色透明。 2.湿墨水法（1）制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。（2）加盖玻片放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。（3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。 3.干墨水法（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀。（2）制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而

实验七革兰氏染色法doc资料

实验七革兰氏染色法

实验四革兰氏染色法一、目的要求了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。三、器材大肠杆菌，枯草芽孢杆菌；革兰氏染色液，载玻片，显微镜等。四、操作步骤

改良的细菌荚膜染色法

?技术与方法?改良的细菌荚膜染色法綦廷娜,陈峥宏 (贵阳医学院微生物学教研室,贵州贵阳　550004) [关键词]细菌荚膜;染色和标记;吕氏美蓝染色法;改良荚膜染色法 [中图分类号]R446.5 [文献标识码]B [文章编号]100022707(2006)022******* 荚膜(cap sule)是某些细菌细胞壁外的一层黏液性物质,其厚度≥012μm且边界明显。通常认为荚膜与细菌的致病性有关,在细菌鉴定中有重要意义。传统的细菌荚膜染色法有H iss法、Muir法、墨汁负染法以及常用的吕氏美蓝染色法等,但这些荚膜染色法的染色效果往往不够理想[1～4]。改良荚膜染色法是在吕氏美蓝染色法的基础上进行改良,染色效果良好,现报告如下。 1　材料和方法 1.1　材料　菌种:Ⅲ型肺炎链球菌(S treptococcus pneum oinae),编号为31003,中国药品生物制品检定所提供。实验动物:K M小鼠,由贵阳医学院实验动物中心提供。培养基:10%绵羊血琼脂平板,按文献[3]方法制备。荚膜染色液:按文献[4]方法配制。改良荚膜染色液:(1)初染液:甲液为5%石炭酸5份,钾明矾饱和液2份,20%鞣酸2份,混合备用;乙液为碱性品红酒精饱和液1份。甲乙两液混合过滤后备用;(2)媒染液为20%甲醇水溶液;(3)复染液为5%孔雀绿水溶液。 1.2　方法 1.2.1　菌种与涂片的制备　将肺炎链球菌血琼脂平板24h培养物用无菌生理盐水洗涤,以比浊法制备成浓度为1×109个/m l的菌液。于小鼠腹腔内注射肺炎链球菌菌液(015m l/只),待小鼠发病,于濒死前取心血及胸腔血液注射另1只小鼠。待小鼠发病,于濒死前取其心脏血或腹腔液涂片60张,室温下自然干燥。 1.2.2　吕氏美蓝荚膜染色法染色　按文献[4]方法对1.2.1中的30张涂片进行染色,逐一于油镜下观察。 1.2.3　改良荚膜染色法染色　取1.2.1中的涂片30张进行染色。滴加初染液染色5m in,水洗;滴加20%甲醇作用30～40s,水洗;用5%孔雀绿染液复染80s ～90s,水洗。温火烘干,逐一于油镜下观察。 2　结果 2.1　吕氏美蓝荚膜染色法染色结果　于油镜下可观察到背景沉渣较多,为红色或蓝色,菌体呈紫红色或蓝色,背景和菌体的着色不均。仅有13张涂片可观察到部分菌体周围呈淡蓝色的荚膜。 2.2　改良荚膜染色法染色结果　于油镜下可见背景沉渣较少,为淡红色,菌体呈深绿色,荚膜呈淡绿色。有26张染色片可观察到大而清晰的荚膜(图1),背景与荚膜对比明显。图1　改良荚膜染色法染色结果(肺炎链球菌) Fig.1　A s mear of S treptococcus pneum onia stained with modified cap sule staining 3　讨论大多数细菌的荚膜是多糖,荚膜多糖为高度水合分子,含水量在95%以上。荚膜对一般碱性染料亲和力低,不易着色[5]。因此,荚膜染色法是一种较难掌握的特殊染色方法。吕氏美蓝染色法是本教研室教学中常用的一种荚膜染色法,但使用这种方法,荚膜着色较差,背景、菌体及荚膜三者对比不清晰,染色效果不理想。本改良法通过延长初染 181

革兰氏染色标准操作程序

革兰氏染色标准操作规程 1 目的确保革兰氏染色的正确操作，使革兰氏染色的操作得到有效控制，以提供稳定的实验结果。 2 适用范围适用于本公司微生物实验室革兰氏染色实验。 3 职责实验室技术人员应遵循此程序，确保按标准操作规程进行革兰氏染色。 4 程序 4.1革兰氏染色原理通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层较多且交联致密，故遇丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故丙酮处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过丙酮脱色后仍呈无色，再经番红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 4.2实验物品灭菌玻片、接种环、移液器、酒精灯、计时器、显微镜、香柏油、革兰氏染色液等。 4.3实验步骤 4.3.1涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液器吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用移液器分别吸取10ul金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌位于待检品的两侧（中间要有足够的空间），分别作为阴阳性对照。用无菌接种环将液滴涂布成均匀的薄层，涂布面不宜过大。

4.3.2干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯火焰高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 4.3.3固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉得烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。 4.3.4初染：在涂片薄膜上滴加革兰氏结晶紫试剂1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 4.3.5水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 4.3.6媒染：取1-2滴革兰氏碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 4.3.7水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 4.3.8脱色：斜置载玻片，滴加革兰氏脱色剂脱色，至流出的脱色剂不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。 4.3.9复染：在涂片薄膜上滴加革兰氏番红精复染剂1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 4.3.10水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 4.3.11干燥：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下观察。 4.3.12观察：待标本片干后置显微镜下观察，用低倍镜观察，发现目标物后滴一滴香柏油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色。 4.4结果判定显微镜观察由金黄色葡萄球菌制成的标本显示葡萄球状蓝紫色，大肠埃希菌制成的标本显示杆状红色，则实验过程有效。一方不成立则实验结果无效。此时，如果样品在显微镜下呈蓝紫色，则判定样品菌株为革兰氏阳性菌；如果样品在显微镜下呈红色，则判定样品菌株为革兰氏阴性菌。 4.5实验结束 4.5.1实验结束后，按显微镜使用、维护和保养规程的要求，关闭和清洁显微镜。 4.5.2实验过程中用到的带菌工具，根据工具的不同选择不同的灭菌方式，确保物品丢弃前均已灭菌。

SD大鼠甲苯胺蓝染色步骤

SD大鼠甲苯胺蓝染色步骤 1、甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞表型 Ⅱ代软骨细胞以2x105／ml的密度接种到铺有多聚赖氨酸盖玻片的24孔细胞培养板中，与原代培养条件相同，制作细胞爬片，常规培养48h后行甲苯胺蓝染色。具体操作步骤如下： (1)倾去培养液，PBS充分漂洗3次，加入10％的中性甲醛常温下固定30min。 (2)倾去10％的中性甲醛，PBS充分漂洗3次，加入70％的乙醇固定30min除去四价铵离子，以免影响染色。 (3)倾去70％的乙醇溶液，PBS充分漂洗3次，晾干，加入甲苯胺蓝乙醇液(甲苯胺蓝0.2g 溶于30％乙醇100m1)染色_20min。 (4)PBS充分漂洗3次，迅速用无水乙醇再漂洗1次。 (5)取出爬片，干燥后中性树脂封片，电子显微镜下观察、摄片。 2、型胶原免疫细胞化染色法鉴定软骨细胞表型 Ⅱ代软骨细胞以2×105／ml的密度接种到铺有多聚赖氨酸盖玻片的24孔细胞培养板中，与原代培养条件相同，制作细胞爬片，常规培养48h后行免疫细胞化学法染色。实验过程严格遵照免疫细胞化学染色试剂盒说明书进行操作，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照组。具体操作步骤如下： (1)倾去培养液，冰冷的PBS漂洗3x3min，加入4%多聚甲醛1ml室温固定15min。 (2)PBS清洗标本3x3min，每张标本滴加1滴新鲜配制的3％H202，室温下孵育10min。 (3)PBS清洗标本3x3min，每张标本滴加穿膜液0.5m](0.1％timton+o.1M Glycine)冰上孵育 30min。 (4)PBS清洗标本3x3min，每张标本滴加5mg／ml的动物非免疫封闭血清(BSA)0.5ml，室温下封闭1h。 (5)滴加1：150稀释的兔抗大鼠II型胶原多克隆抗体50ul于封口膜上，使标本与一抗充分接触，置于湿盒中4℃过夜。PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照组。 (6)PBS清洗标本3x3min，加入二抗工作液，37℃孵育20min。 (7)PBS清洗标本3x3min，每张标本滴加1滴SABC试剂，37℃孵育20min后PBS(pH7．2~7．6) 清洗标本4x5min。 (8)DAB显色：取蒸馏水1ml，加入试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后滴加至标本。室温下显色，显微镜下观察并控制反应时间(约5-30min)。 (9)蒸馏水漂洗，苏木素轻度复染，脱水。 (10)干燥后中性树脂封片，电子显微镜下观察、拍照。豚鼠关节软骨细胞甲苯胺蓝染色鉴定将F1代豚鼠关节软骨细胞以1×104／ml的浓度传代至孔底铺有圆形盖玻片的24孔板中；正常培养，制作细胞爬片，镜下观察细胞状态，取细胞状态及数量适宜(2天左右) 的爬片染色。染色步骤如下： 1取出细胞爬片，用PBS缓冲液漂洗3次，每次3min，吸弃PBS，每张爬片滴加4％多聚甲醛100 ul，铺满爬片，室温固定3h。 2 PBS漂洗3次，每次3min后吸弃PBS，每张爬片滴加70％的乙醇100 ul室温固定20min。 3 PBS漂洗3次，每次3min后吸弃PBS，晾干后每张爬片滴加0．04％的甲苯胺蓝溶液50 ul，室温下处理20min，无水乙醇迅速漂洗1次，晾干封片，观察拍照记录。