分子生物学实验技术

分子生物学实验技术

（1）基因操作：DNA克隆概述、质粒DNA的制备、限制酶与电泳、连接、转化与重组

体分析

（2）克隆载体：载体设计、各种载体的特征

（3）工具酶的种类、特点

（4）PCR的基本原理及操作技术

（1）掌握基因操作和PCR的基本原理和过程；（2）熟悉常用克隆载体、工具酶的特性。

（1）克隆原理；

（2）质粒载体构建原理；

（3） PCR原理及操作。

讲授与交流互动相结合，采用多媒体教学。

DNA cloning 一、DNA 克隆

克隆一词是英文单词clone的音译，作为名词，c1one通常被意译为无性繁殖系。同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的，例外仅见于有突变发生时。

自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆，例如：同卵双胞胎实际上就是一种克隆。

作为动词，cloning是指用人工方法产生无性繁殖系的一系列操作过程。

DNA cloning (DNA 克隆)的定义：将基因组中携有目的基因或其他相关序列的较小片段连接到一段可以自主复制的DNA即载体(vectors)上，形成通常可以在另一宿主中进行复制的重组DNA(recombinant DNA)，这种复制是独立于原初基

因组的。带有重组DNA的宿主(Hosts)细胞的增殖构成了一群具有遗传一致性的个体，或称为

单克隆。这一系列操作过程被称为DNA克隆。

Blotting the DNA or RNA on a membrane

Hybridize the labeled probe with DNA membrane (Southern) or RNA (Northern)

membrane

二、Hosts and vectors

1．Host organism/cell: where the plasmids get multiplied and propagated faithfully

忠实增殖, which is crucial for DNA cloning. 2. Hosts for DNA cloning vector:

Prokaryotic host : E. coli ( most cases)

Eukaryotic host : Yeast Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 (large fragments of

human genome)

3. General features of a Vector

（1）autonomously replicating DNA independent of host?s genome.

（2）Easily to be isolated from the host cell

（3）Most are circular, some are linear

（4）Contains at least one selective marker, which allows host cells containing the vector to be selected amongst those which do not.

（5）Contains a multiple cloning site (MCS)

4Types of vectors

（1）Cloning vectors

allowing the exogenous DNA to be inserted, stored, and manipulated at DNA level.

E. coli cloning vector: plasmids, bacteriophages (l and M13), plasmid-bacteriophage l hybrids (cosmids).

Yeast cloning vector: yeast artificial chromosomes (YACs)

PCR

2Expression vectors allowing the exogenous DNA to be inserted and expressed.

Promoter and terminator for RNA transcription are required.

bacterial expression vectors

yeast expression vectors

mammalian expression vectors

（3）Integration vectors

A. allowing the exogenous DNA to be inserted and integrated into a chromosomal

DNA after a transformation.

B. The integration is conducted by homologous recombination between the

homologous sequence shared by the plasmid and the genome of the recipient

cells.

C. bacterial integration vectors (Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid is used to

integrate DNA into plant genome)

D. yeast integration vectors

E. Mammalian integration vector: virus based

Subcloning

2．初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，

在诸如表达序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一

小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”。

3The Role of Subcloning:

（1）Enables us to investigate a short region of a large cloned fragment in more detail.

（2）To transfer a gene from one plasmid to a vector designed to express it in a

particular species.

4Identify the protein product of an interested gene

（1）Protein activity

（2）Western blotting using a specific antibody

DNA libraries

DNA libraries DNA文库是一套DNA克隆，每个克隆都是插入了不同片段的载体在宿主中扩增后的产物.

a) Genomic libraries是用基因组DNA的随机片段制备成的。效率低

b) cDNA libraries是用来自表达目的基因细胞或组织的mRNA作为来源构建成的。经反

将mRNA合成cDNA后，插入载体建成cDNA文库。转录

Screening libraries

Searching the genes of interest in a DNA library

Hybridization to identify the interested DNA or its RNA product

1. Radiolabeled probes（放射性探针） which is complementary to a region of the interested

gene

Probes:

An oligonucleotide derived from the sequence of a protein product of the gene

A DNA fragment/oligo from a related gene of another species

2． Blotting the DNA or RNA on a membrane

3． Hybridize the labeled probe with DNA membrane (Southern) or RNA (Northern) membrane

六、Analysis of a clone

1. Restriction mapping: digestion of the with restriction enzymes.

2. Sequencing the cloned DNA

You may have to fully understand the function and application of all the enzymes showed in

Page 304~310 of your textbook before the final exam

基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。

所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改

造、优化、而产生的生物工程产品。

一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现，阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖

1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成。

原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。

识别和切割序列：中心对称的回文结构。

限制性酶：Hind?

Nathans：用限制性酶切割猴子SV40 DNA，DNA测序。

自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。

这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。

在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。

一、限制性核酸内切酶(restriction enzyme)

当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。

而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基

化。

EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。

仍有少量phage λ (K)可在 E. coli B中生存，是因为E.coli B phage对λ (K)进行了修饰。

R-M系统：

（1）细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限

制

—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。

（2）R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。

（3）个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。 1．限制

性核酸内切酶的发现 1．限制性核酸内切酶的发现

1968 Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶?

1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶?

1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金

限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。

功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。 2．限制性核酸内切酶的分类2．限制性核酸内切酶的分类

根据识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键,分类：?型、?型、?型

命名：

宿主: 属名第一字母、种名头两个字母，斜体

菌株或型号

序号: 罗马字

E.g.: EcoR?(E：属名；co：种名；R：株；?：发现次序)

属名种名株名

Haemophilus influenzae d d

H i n d III

H i n d III

3.限制性核酸内切酶的活性单位限制性核酸内切酶的活性单位

50μL Buffer中，含1μg底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1μg

DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。 buffer

（pH=8.0）：

50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2

1mmol/L DTT或巯基乙醇100μg BSA/ml

（DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白)

4.限制性核酸内切酶的切割特点 4.限制性核酸内切酶的切割特点

在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的DNA片段，具有互补的单链延伸末端。

5.识别序列 5.识别序列

绝大多数的?型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷

酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。

识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。

6.不同核酸内切酶的特异识别位点 6.不同核酸内切酶的特异识别位点

核酸内切酶Hind?对双链DNA分子的切割作用 7.三种酶切末端 7.三种酶切末端

(1)平齐末端（如Sma?、Alu?、Hae?）

A.同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同

样的末端。

如：Hpa?和Msp?均可切割C CGG。

当胞嘧啶甲基化后， Msp?不能再切割。

B、同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子产生的

粘性末端相同的限制性核酸内切酶。

BamH? Bcl? Bgl?三种酶可产生相同的5?GATC粘性末端，由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。

8．限制性核酸内切酶的反应条件 8．限制性核酸内切酶的反应条件

（1）.底物 DNA

（a）DNA纯度:

RNA 与 E 结合影响有效酶浓度；

（b）DNA浓度:

[DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散

如：4μg DNA/1U HPa? 50μl 37? 15h

1μg DNA/1U HPa? 50μl 37? 1h

（c）识别位点及邻近位点特异性序列：如：pBR322 DNA 有4个Nar?切点(GGCGCC)，其中2个切点用1U酶水解1h完全切开，2个切点用50U酶水解16h水解不完全。又如Xma?切点（CGGCCG）在GGCGGCCGCC时不切割。（d）DNA二级/三级结构：如：超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需酶多。

2+（e）提取时混入杂质可改变识别特异性：如：高浓度Hg、酚、氯仿、乙醇、

EDTA、 SDS、NaCl等。

(2).反应系统因素

（a）缓冲液（无菌、无污染）

22+2+（b）金属离子：如：?型酶需Mg+，若以Mn代替Mg（如Hind?，EcoRI）则

特异性改变。离子浓度不合适会抑制酶活。（c）牛血清蛋白(BSA)：BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的

酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾

(3).星活性

限制性内切酶识别特异性放宽。

EcoR?在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过5%，其识别位点发生松动，可在AATT处发生切割，EcoR?这种特殊的识别能力叫*做星活性，用EcoR?表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。

影响因素：甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子，12%乙醇。 8.8.

a.重组DNA前的切割

b.构建新质粒

c.构建物理图谱

d.DNA分子杂交

e.用限制性内切酶消化受体DNA

f.制备DNA探针

h.亚克隆以用作序列分析

i.基因定位，DNA同源性研究

9.酶切反应注意事项

（1）价格昂贵

（2）决不能用水稀释,以免变性失活。

（3）预先加入除酶以外的所有其他试剂。（4）取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。（5）使用无菌的新吸头。

（6）少加水,使体积最小,•但保证酶液体积不超过总体积的10％,否则酶液中的甘油

会抑制酶活性。

二、(methylase) 二、

类R-M系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两种酶分子组成。大多数限制酶都已分离出相应的甲基化酶。

1．甲基化酶也称修饰酶(modification enzyme)，用来修饰限制酶的识别序列，在该

序列位点的胞嘧啶（C）5-氨基上加一个甲基，使得该序列可以被限制性内切酶识别

而免于切割。

2．甲基化酶分两类：

（1）维持性甲基化酶：用于在新合成的DNA链上进行甲基化的酶。甲基化位置

与模板链上的相同。

（2）构建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA链上进行甲基化的酶。 3．用甲基化酶进行甲基化的作用

（1）封闭DNA链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。（2）构建新的酶切位点

DNAligase

能够催化DNA中相邻的3?-羟基和5?-磷酸基末端之间形成3′，5′-磷酸二酯键， 1．TDNA连接酶 4

可连接带匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的双链DNA分子相互连接。2．大肠杆菌DNA连接酶

只能连接带匹配粘末端的DNA分子

DNADNApolymerase

1．DNA聚合酶：指在DNA(或RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3? -OH末端聚合DNA链的一类酶。DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。

2．DNA聚合酶主要有三类：

–聚合酶?（pol?）：参与DNA修复，是基因工程中的常用酶

–聚合酶?(pol?)

–聚合酶?(pol?)：聚合酶?参与DNA复制。

3．DNA聚合酶的特点：

需模板(DNA或RNA)；

需引物；

具有三种酶活性，即5′?3′聚合酶活性；5′?3′外切酶活性和3′?5′外切外切酶活性。

4．DNA聚合酶?在DNA复制过程中的作用

（1）DNA pol?的5…?3?聚合活性和5…?3?外切酶活性协同作用，可以使DNA一条链上的切口从5…?3?方向移动，这种反应叫做缺刻平移(nick translation)。

32（2）利用此反应可在体外对DNA片段进行放射性磷(α-PdNTP)的标记制成探针(probe)，进行核酸的分子杂交实验，是现代分子生物学的一项重要技术。DNA聚合酶?在分子克隆中的主要用途是通过DNA缺口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。

5．DNA杂交探针的制备

探针（probe）：用来探知被测物存在的小DNA或RNA叫做探针。标记物：探针上结合有易被检测的化合物称为标记物。

分子杂交：探针DNA或RNA与被测物的互补结合叫做分子杂交（molecular hybridization）

6．主要的DNA聚合

A.DNA聚合酶?

来源: E.coli，由染色体DNA基因编码。商品上用的此酶来源于Phage NM964整合的溶源性E.coli。

结构: 一条多肽链，MW = 109，000 D。

活性: 5′? 3′聚合，3′? 5′和5′?3′外切。

B.Klenow

来源：E.coli DNA Polymerase?经蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.1970)

Klenow

用途:填补限制酶的5′-粘性末端为平齐末端

C.TDNA聚合酶 4

来源：TPhage感染的E.coli 4

结构：MW=114，000d

活性：

5′?3′聚合活性；

3′?5′外切活性，对单链活性大于双链DNA，外切酶活性比Klenow大200倍用途:

填补或标记限制酶切后产生的5′-粘性末端的3′-凹缺末端。（同Klenow）

3′-粘性末端的标记制备DNA探针,同 Klenow 末端标记。 D.TDNA聚合酶（测序酶） 7

来源：T7Phage感染的E.coli

结构：由2个蛋白亚基组成：

Tphage gene5蛋白 + 宿主硫氧蛋白 7

活性：

5′?3′聚合，持续反应时间最长，所以合成的DNA链长。故在DNA测序中很优越。

3′?5′外切，是DNA 聚合酶?的 1000倍。

用途:

复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列;

用填补或交换反应快速进行末端标记;

与T４DNApol一样，平齐粘性末端;

定点突变中互补链的合成。

E. 修饰的 TDNA 聚合酶(测序酶) 7

来源：天然 TDNA聚合酶经修饰处理７

结构：同T聚合酶。７

２+ 用还原剂、分子氧、低浓度 Fe与酶保温几天，可使PhageT7 gene5蛋白N-端3′?5′外切酶活性中心失活(O- 修饰)。即：5′?3′聚合酶作用提高，持续性长。3′? 5′外切作用下降99%以上。

F. Taq DNA 聚合酶(Thermusaqraticus)

来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种

结构：单亚基MW=94000d。

活性：聚合最适温度为75-80?，不具3′?5′外切酶活性，具5′?3′外切活性。用途：

PCR反应;

测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。 H. 末端转移酶(不依赖模板的DNA聚合酶)

来源：只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的DNA聚合酶(Chang和Bollum,1986)。

结构：MW=60，000d.

活性：催化dNTP掺入DN A 3′-OH末端，形成同聚物末端；反应不需模板DNA，需2+ Co

用途：

克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接;

末端标记.

I. 反转录酶（reverse transcriptase）

来源：商品反转录酶有两种

来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV);

来自能表达Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因的E.coli。

结构和活性：

用途：

(1) 5? 3? 聚合酶活性, 能以RNA或DNA模板合成DNA分子； (2) RNA酶H活性，对RNA:DNA杂交体中的RNA特异性地降解，免除了在反转录

完成后再用NaOH降解RNA模板的步骤。

(3)用于３?凹陷末端的标记，杂交探针的制备和DNA序列测定．

cDNA的合成主要步骤：

在某种生物的mRNA分子中，加入引物使之与mRNA退火，并引导逆转录酶按照mRNA模板合成第一链cDNA，产物是mRNA:DNA杂交分子；然后再以cDNA第一链为模板合成cDNA．

RNA RNApolymerase

来源：T、TRNA 聚合酶在E.coli （或细菌）中的克隆表达； 73

E.coli RNA聚合酶。

活性：在DNA指导下合成RNA，结合于启动子部位，转录无意义链(一)产生与有意义链相似(以U代替模板中T)的链。

转录链为无意义链，负链(-)。

不转录链为有意义链，正链(+)。

磷酸激酶催化5?-OH 加 P （标记）

和磷酸酶去除 5?- P （防止自身环化）

nuclease

1．Bal13 核酸酶

从DNA末端同时降解两条链。

用于基因表达调控序列的研究。

2．S1 核酸酶

降解单链核酸。

用于把具粘性末端的DNA变为平齐末端的DNA。

在DNA部分变性条件下，能在富含AT区切断DNA。

ribozyme

具有酶活性的RNA片段。

是真核生物转录产物地内含子本身含有的前导序列，能在离体条件下特异地催化内含子剪切。

1981 Cech和Altman首次发现，并因此获得1989年的诺贝尔奖。

核酶可以作为RNA的限制性内切酶用于基因操作。

一、质粒（plasmid）的基本特性一、质粒（plasmid）的基本特性

1. 质粒的一般生物学特性

2.质粒的类型

A. 接合型质粒：

又叫自我转移型质粒。

除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移

的基因。

如：F质粒（性质粒、或F因子）：

甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。

不符合基因工程的安全要求。

B. 非接合型质粒：

虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的

基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。符合基因工程的安全要求。

3.质粒的复制类型

4.质粒的复制

5.质粒的不相容性

两个质粒在同一宿主中不能共存。

利用同一复制系统，即使微小的差别最终被放大，从而导致子细胞中只含一种质

粒。

二、质粒载体的构建二、质粒载体的构建

1. 天然质粒的局限性

ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。

colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。

唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞……

2. 质粒载体必须具备的基本条件

3. 质粒的选择标记及其工作原理

4. 人工构建的质粒载体的类型

三、经典的大肠杆菌质粒载体三、经典的大肠杆菌质粒载体

1. pSC101

2. ColE1

3. pBR322

4. pUC系列

四、其它质粒载体四、其它质粒载体

1. pGEM-3Z

2. pGEM-4Z

3.穿梭质粒载体

五、质粒载体的不稳定性五、质粒载体的不稳定性

1. 质粒稳定遗传必须的两个条件

2. 质粒分配方式 2. 质粒分配方式

3. 分离的不稳定性

4. 结构的不稳定性

5. 影响质粒载体稳定性的主要因素

一、历史

1、[保罗.拉比诺（朱玉贤译）：PCR传奇——一个生物技术的故事]

1960s-70s：基因的体外分离技术。

Khorana（1971）：美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主。“经

过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克

隆tRNA基因”。

核酸体外扩增最早设想遗忘:

当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物；