电转染标准步骤
电转染标准步骤
1.清洗电转杯，将电转杯置于75%酒精中浸泡2小时，然后在紫外灯下照射后即可使用。
2.电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前出于对数生长期。对于原代培养细胞，一般培养2-3天后，细胞单层融合度可以达到70-80%，即可开始试验。
3.PBS洗细胞2次后，胰酶消化细胞2min，待细胞变圆后，用完全培养基终止消化。
4.轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min。
5.完全弃去上清，根据细胞数量，加入适量的电转缓冲液重悬细胞（一般为0.5-0.6ml左右），并上下吹打均匀。
6.加入适量相应浓度的待转染核酸至相应的终浓度（质粒为20ug/ml，SiRNA的终浓度为100nM），上下吹打均匀。若以0.5ml计算，所需质粒为0.5×20=10ug。
7.将含有相应浓度核酸的细胞悬液转移入相应规格的电转杯中，按照预定条件设置参数，进行电击操作。（不同细胞电转前，需要进行预试验摸索电转的最佳条件，既要保证较高的转染效率，又要保证较高的细胞存活率。经过实践摸索后得出，相应的最佳参数为：质粒：250V，10ms，1（最多2），0，4mm cuvette；SiRNA: 250V，5ms，1（最多2），0，4mm cuvette。
8.电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中8-12min，以使核酸充分进入细胞。
9.将电击杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养。
10.正常培养4h，待细胞贴壁后，给细胞换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞。
11.培养24h后，即可进行细胞转染效率的检测或是进行细胞的实验处理。
高频电刀的操作流程和注意事项(正式)
编订：__________________ 单位：__________________ 时间：__________________ 高频电刀的操作流程和注意事项(正式) Standardize The Management Mechanism To Make The Personnel In The Organization Operate According To The Established Standards And Reach The Expected Level. Word格式 / 完整 / 可编辑
文件编号：KG-AO-9053-19 高频电刀的操作流程和注意事项(正 式) 使用备注：本文档可用在日常工作场景，通过对管理机制、管理原则、管理方法以及管理机构进行设置固定的规范，从而使得组织内人员按照既定标准、规范的要求进行操作，使日常工作或活动达到预期的水平。下载后就可自由编辑。 一电刀的结构和工作原理。 1.结构与配件由主机、电刀笔、脚控开关和回路电极（负极板）组成。 使用负极板的作用：可构成电流回路，同时降低极板处的电流密度，避免电流离开病人后返回高频电刀时继续对组织加热而灼伤病人。 2.工作原理利用475～480KHz高频电流在电刀的刀尖形成高温和放电，使组织快速脱水、分解蒸发，血液凝固，实现切割组织和凝血作用。 二使用电刀的禁忌症：安装心脏起搏器的病人禁止使用高频单极电刀或咨询心内科医生。三电刀安全使用的操作程序和注意事项 （一）首先评估病人是否适合使用电刀，根据手
术选择合适品牌的电刀，检查电源、电极线路有无断裂和金属线外露。 （二）选择并检查负极板：检查导线和夹头；选择大小形状合适的负极板（15Kg以下的小儿应选用婴幼儿极板），检查导电胶的粘附力。 （三）评估病人皮肤，选择合适的部位安装负极板并将极板插头连接至机器。 合适的安装部位：尽量靠近手术部位（但不少于15cm）的平坦的血管丰富的肌肉区；局部皮肤剔除毛发并保持清洁干燥；与手术部位不可左右交叉；距ECG 电极15cm；环路中不能有金属移植物、起搏器、心电图电极；极板的长边接近高频电流的来向。 不合适的安装部位：皮肤皱褶和骨性隆起、疤痕、脂肪较厚、身体负重部位、液体积聚部位。 安装负极板时要注意：极板和皮肤要紧密连接；保持极板平整，不能切割和折叠；消毒和冲洗时避免浸湿极板。 （四）连接电刀笔与机器，开机自检，显示负极
2020年心脏电除颤技术操作规程(课件)
2020年心脏电除颤技术操作规 程（课件） 心脏电除颤技术操作规程 【目的】 用较强的脉冲电流通过心脏来消除心律失常,使之恢复窦性心律。 【评估】 1、患者心电监护波形、操作环境。 2、患者病情、意识、合作程度。 3、电除颤部位皮肤情况及是否装有起搏器。 【准备】 1、护士按要求着装。 2、物品心电除颤、心电监护仪、导电膏、盐水纱布数 块、急救车、卫生纸、快速手消液、污物桶、护理记录单。 3、环境安静、安全。 4、体位去枕平卧位,暴露胸部。 【方法】 巡视病房—发现患者心律失常（为室颤）--呼叫医生—准备除颤仪及急救车推至床旁—将除颤器插上电源—打开除颤器-患者取去枕平卧位—解开患者衣扣，暴露胸部-取
下电极片—检查导电膏有效期—将除颤器两侧的电极板分别涂以专用导电膏，或在患者除颤部位垫上5－6层盐水纱布—选择非同步直流电除颤-选择除颤能量（单向波３60J，双向波２0０J)－-将电极板置于标准位置【常规位置：STERNUM（左手）一块在胸骨右缘第二肋间，（右手）APEX一块在左侧腋中线与第五肋间交界处(心尖部）】—-按充电电钮，迅速充电至所需能量—让床旁其他人员离开患者及病床—电击时两拇指同时按压电极板上的放电按钮（放电前大声呼叫“1、2、3放电”,电极板紧贴皮肤病加压）—－固定电极板—观察示波器上患者的心律恢复正常，生命体征正常，判断电复律成功(如不成功行心肺复苏5个循环后在进行除颤）--撤离电极板,关闭除颤器—用卫生纸擦拭患者胸前区导电膏-为患者行心电监护—扣上患者衣扣,整理床单元，协助患者取舒适卧位—用卫生纸擦拭电极板上的导电膏—消毒双手—观察患者心律、血压、呼吸、脉搏、意识—记录—遵医嘱进行后续治疗—分离除颤器电源—推除颤器及急救车回治疗室-整理用物—除颤器擦拭干净后充电备用—洗手。......感谢聆听 【评价】 1、选择除颤方式正确。 2、患者体位摆放正确。 3、除颤能量选择正确。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
高频电刀使用技术规范与操作流程
高频电刀使用技术规范与操作流程 高频电刀是利用高频电流对人体组织进行切割、止血的一种高频大功率的电气设备。它具有止血快、出血少、术后恢复快等优点，广泛应用于临床，同时使用中也增加了安全隐患。近年来随着高频电刀及附件的发展，安全隐患已明显减少或避免，但如果未按规程进行操作，容易造成意外伤害。 一、基本构造 1. 单极电刀：主机，电刀笔，负极板，脚踏控制开关。 2. 双极电刀：主机，双极镊，脚踏控制开关。 二、工作原理 1. 单极电刀: 利用RF（Radio Frequency）射频原理，将高频和高压的电流，通过刀笔，作用到病患部位，利用刀笔尖端部位对所接触的组织产生的瞬间烧灼现象，以达到切割或凝血的效果。而作用到人体的电流，则必须经过回路负极板流回高频电刀内部，以形成完整的回路。 2. 双极电刀:通过双极镊子的两个尖端向机体组织提供高频电能，使双极镊子两端之间的血管脱水而凝固，达到止血的目的。 三、优点 1. 切割速度快、止血效果好、操作简单、安全方便。 2. 与传统采用机械手术刀相比，在临床上采用高频电刀可大大缩短手术时间，减少患者失血量及输血量，从而降低并发症及手术费用。
3. 与其他电外科手术器（如激光刀、超声刀、水刀、半导体热凝刀等）相比高频电刀适应手术范围广，容易进入手术部位，操作简便，性能价格比合理等优越性。 四、应用范围 1. 单极电刀:可同时进行切割和凝血,目前不仅广泛应用在直视手术中,如普通外科、心胸外科、五官科、妇产科、泌尿外科等临床外科,还可应用于各种内窥镜手术中,如腹腔镜、前列腺切镜、膀胱镜、宫腔镜等手术中;安装心脏起搏器的病人禁止或慎用单极电刀。 2. 双极电刀:主要是凝血功能,切割功能基本没有,适用于精细组织和部位的手术,如神经外科的各类手术及整形外科、耳鼻喉科和骨科的颈椎、腰椎、脊髓手术,并适用于安装心脏起搏器的病人。 五、操作流程 1、单极电刀： （1）连接电源线，负极板线路。 （2）负极板粘贴于患者肌肉丰富的合适部位。 （3）开机自检，根据手术选择合适的输出功率。 （4）连接电刀笔线路，使用手控或脚控开关。 （5）选择切割方式，根据手术需要调节切割功率和凝血功率. 。 第2 / 5页（6）使用完毕，将数字键值调到最低值，先关主机电源开关,再拔电源插头。.
电除颤术操作流程
电除颤术操作流程及相关知识 一、定义 指在严重快速心律失常时（室颤），用外加的高能量脉冲电流通过心脏，使全部或大部分心肌细胞在瞬间同时除极，造成心脏短暂的电活动停止，然后由最高自律性的起搏点（通常为窦房结）重新主导心脏节律的治疗过程。 二、目的：通过电除颤纠正、治疗心律失常，恢复窦性心律 三、适应症 1、心室颤动、心室扑动。 2、室性心动过速伴有血液动力学显著改变并出现心力衰竭、休克等，房颤、房扑伴血流动力学不稳定者可首选。 四、操作流程 （一）操作前 1、评估： 1）、患者的心律、神志、年龄、体重、除颤部位皮肤情况，去除金属物品。2）、除颤仪的性能、蓄电池充电情况。 3）、环境温度、光线适宜、电源插座配套。 2、准备： 1）、护士：衣帽整齐，动作敏捷、迅速、准确。 2）、物品：除颤仪，治疗盘（导电胶一支或生理盐水纱布，治疗碗1个，纱布2块、弯盘）、电源插座、心电监护仪。 3）、患者：卧于硬板床，（可模拟患者心电监护在位，已建立静脉通道）。（二）操作中 1、一看：护士发现患者心电监护显示室颤，二喊：呼喊患者的姓名判断意识，患者无意识，看时间，立即呼叫医生病人出现室颤，同时呼救另一名护士推抢救车，三摆体位：去枕平卧，解开衣襟，暴露除颤部位。告知病情，请家属离开。 2、连接电源线，打开除颤仪开关，观察心电监护显示，再次判断除颤指征。 3、选择合适模式（同步或非同步），选择电极板（成人直径10－13cm，儿童4－5cm）。 4、均匀涂导电膏于电极板表面。 5、选择电击能量：成人单向波360J，双向波150J；按下标有charge Defib英 文的电极板进行充电；同时断开心电监护仪导联线接头。 6、正确放置电极板（左手将标有STERNUM电极板置于右侧锁骨中线第二肋间、右手将标有APEX电极板置于左侧腋前线第5肋间）；电极板紧贴皮肤加压10-20kg。
细胞转染的详细过程
细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。 细胞培养在适合的培养基中。 细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合： 用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。 用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。 将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下： 澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状
细胞转染的操作步骤
细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
电除颤的操作步骤
电除颤的操作步骤 The latest revision on November 22, 2020
电除颤与电复律 ：cardiaoversion 电复律 除颤：defibrilation 两者指利用高能电脉冲直接或经胸壁作用于心脏，消除异位心律失常，恢复窦性心律的方法电复律：主要用于心房颤动、室上性或室性心动过速用同步 除颤：心室颤动（与扑动）可以用非同步 电复律与除颤必备的两个条件： 1、窦房结功能必须正常； 2、能量要足够，心肌纤维要全部除极 同步电复律：脉冲电流应落在R波的下降支上；如落在T波顶峰前20~30ms以内的易损期上，易诱发心室颤动 非同步除颤、：任何时间放电，消除心室颤动 除颤和电复律电流：是将60HZ的交流电转变为4~7kVd的高压直流电，储存于16~32UF的电容中，在2~4ms以内向心脏放电，功率可达360~400焦耳 电复律禁忌症：房颤未用洋地黄治疗、心室率小于50~60次/分、或洋地黄中毒引起的房颤、左房巨大、或完全性房室传导阻滞的房颤或房扑，以及风湿活动不能控制、或低血钾房颤患者同步电复律的使用方法： ⑴前先用洋地黄控制心率（直止复律前1-2天停用），同时服用奎尼丁、等药物以防复律后心律失常复发。 ⑵复律当天禁食 ⑶监测心电图和血压 ⑷适当应用异丙酚、依托眯酯等麻醉药 ⑸方式房颤、室上性和室性心动过速采用同步复律 ⑹能量 : 体外复律100-150J(房扑 25-50J)，以后每次增加50-100J ⑺电极放置：负极（Apex）放于心尖区，正极(Stenal)放于胸骨右缘第二肋间 ⑻采用同步放电，重复进行时，每次间隔3分钟以上，3~4次为限，最大能量<300~400焦耳 除颤使用方法： ⑴除颤器要经常检查，充足电池以备急用，胸内除颤电极板需消毒（分成人与小儿） ⑵测试：将除颤器充电50ms，先机内放电，指针回到零点，说明机器正常，一些机器也可以在电极板中间夹一块肥皂进行放电测试 ⑶电极板的放置：基本同复律相同，胸内除颤电极板要压在心脏左右两侧 ⑷能量：从小开始，胸外100-300J,小儿2J/kg，胸内10-30J,小儿5-20J 并发症：局部红癍、疼痛、心律失常、血栓脱落引起栓塞等 双相波除颤：心脏病协会支持首次除颤采用低能量（150J），不逐级增加的双相波除颤方法，有安全、有效、除颤后复法率低的特点。 电除颤的操作步骤 1、作好术前准备，备好各种抢救器械和药品。 2、病人平卧于木板床上，开放静脉通道，充分暴露胸壁。
细胞转染操作步骤
RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix
加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参
高频电刀的操作流程和注意事项
行业资料：________ 高频电刀的操作流程和注意事项 单位：______________________ 部门：______________________ 日期：______年_____月_____日 第1 页共8 页
高频电刀的操作流程和注意事项 一电刀的结构和工作原理。 1.结构与配件由主机、电刀笔、脚控开关和回路电极（负极板）组成。 使用负极板的作用：可构成电流回路，同时降低极板处的电流密度，避免电流离开病人后返回高频电刀时继续对组织加热而灼伤病人。 2.工作原理利用475～480KHz高频电流在电刀的刀尖形成高温 和放电，使组织快速脱水、分解蒸发，血液凝固，实现切割组织和凝血作用。 二使用电刀的禁忌症：安装心脏起搏器的病人禁止使用高频单极电刀或咨询心内科医生。三电刀安全使用的操作程序和注意事项（一）首先评估病人是否适合使用电刀，根据手术选择合适品牌的电刀，检查电源、电极线路有无断裂和金属线外露。 （二）选择并检查负极板：检查导线和夹头；选择大小形状合适的负极板（15Kg以下的小儿应选用婴幼儿极板），检查导电胶的粘附 力。 （三）评估病人皮肤，选择合适的部位安装负极板并将极板插头连接至机器。 合适的安装部位：尽量靠近手术部位（但不少于15cm）的平坦的血管丰富的肌肉区；局部皮肤剔除毛发并保持清洁干燥；与手术部位不可左右交叉；距ECG电极15cm；环路中不能有金属移植物、起搏器、心电图电极；极板的长边接近高频电流的来向。 不合适的安装部位：皮肤皱褶和骨性隆起、疤痕、脂肪较厚、身体 第 2 页共 8 页
负重部位、液体积聚部位。 安装负极板时要注意：极板和皮肤要紧密连接；保持极板平整，不能切割和折叠；消毒和冲洗时避免浸湿极板。 （四）连接电刀笔与机器，开机自检，显示负极板安装正确无报警指示后，调节输出功率。 （五）使用过程中的注意事项和故障排除方法。 1.避免旁路灼伤：病人的肢体用布类包裹后妥善固定，避免皮肤对皮肤的接触（如患者手臂与身体间），不可与接地的金属接触，与金属床之间至少保持4cm厚度的干燥的绝缘层。 2.避免设备漏电或短路：勿将电线缠绕在金属物品上；有地线装置者要连接，如威力电刀。 2.输出功率尽可能小，使用小儿负极板输出功率要控制在常规输出功率的1/3以内。每次激励时间小于10秒，间隔应大于30秒。 3.病人发生移动后再次检查负极板接触面积或有无移位。 4.预防环境火警：避免在有易燃易爆和挥发性气体、高氧环境环境中使用电刀（尤其是胸部或头部手术），在气道部位使用时应暂时移开氧气。 5.预防意外烧伤：尤其在使用碘酊、酒精消毒皮肤时；肠道手术禁忌使用甘露醇灌肠，肠梗阻的病人慎用电刀，以免爆炸。 6.避免操作不当导致意外伤害 注意事项：①保持手术巾的干燥。 ②不接触目标组织时避免使用电刀。电刀笔应放于绝缘容器内。 ③尽量使用直接电凝止血法。如使用间接凝血法，应用美国威力电刀只能选CUT键， 第 3 页共 8 页
电除颤的操作步骤
电除颤的操作步骤 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】
电除颤与电复律 ：cardiaoversion 电复律 除颤：defibrilation 两者指利用高能电脉冲直接或经胸壁作用于心脏，消除异位心律失常，恢复窦性心律的方法 电复律：主要用于心房颤动、室上性或室性心动过速用同步 除颤：心室颤动（与扑动）可以用非同步 电复律与除颤必备的两个条件： 1、窦房结功能必须正常； 2、能量要足够，心肌纤维要全部除极 同步电复律：脉冲电流应落在R波的下降支上；如落在T波顶峰前20~30ms以内的易损期上，易诱发心室颤动 非同步除颤、：任何时间放电，消除心室颤动 除颤和电复律电流：是将60HZ的交流电转变为4~7kVd的高压直流电，储存于16~32UF的电容中，在2~4ms以内向心脏放电，功率可达360~400焦耳电复律禁忌症：房颤未用洋地黄治疗、心室率小于50~60次/分、或洋地黄中毒引起的房颤、左房巨大、或完全性房室传导阻滞的房颤或房扑，以及风湿活动不能控制、或低血钾房颤患者 同步电复律的使用方法： ⑴前先用洋地黄控制心率（直止复律前1-2天停用），同时服用奎尼丁、等药物以防复律后心律失常复发。 ⑵复律当天禁食
⑶监测心电图和血压 ⑷适当应用异丙酚、依托眯酯等麻醉药 ⑸方式房颤、室上性和室性心动过速采用同步复律 ⑹能量 : 体外复律100-150J(房扑 25-50J)，以后每次增加50-100J ⑺电极放置：负极（Apex）放于心尖区，正极(Stenal)放于胸骨右缘第二肋间 ⑻采用同步放电，重复进行时，每次间隔3分钟以上，3~4次为限，最大能量 <300~400焦耳 除颤使用方法： ⑴除颤器要经常检查，充足电池以备急用，胸内除颤电极板需消毒（分成人与小儿） ⑵测试：将除颤器充电50ms，先机内放电，指针回到零点，说明机器正常，一些机器也可以在电极板中间夹一块肥皂进行放电测试 ⑶电极板的放置：基本同复律相同，胸内除颤电极板要压在心脏左右两侧 ⑷能量：从小开始，胸外100-300J,小儿2J/kg，胸内10-30J,小儿5-20J 并发症：局部红癍、疼痛、心律失常、血栓脱落引起栓塞等 双相波除颤：心脏病协会支持首次除颤采用低能量（150J），不逐级增加的双相波除颤方法，有安全、有效、除颤后复法率低的特点。 电除颤的操作步骤 1、作好术前准备，备好各种抢救器械和药品。 2、病人平卧于木板床上，开放静脉通道，充分暴露胸壁。 3、术前常规作心电图。完成心电记录后把导联线从心电图机上解除，以免电击损坏心电图机。
高频电刀的操作流程
高频电刀的操作流程 1. 首先评估病人是否适合使用电刀，根据手术选择合适的电刀，检查电源、电极线路有无断裂和金属线外露。 2. 选择并检查负极板：检查导线和夹头；选择大小形状合适的负极板（15Kg以下的小儿应选用婴幼儿极板），检查导电胶的粘附力。 3. 评估病人皮肤，选择合适的部位安装负极板并将极板插头连接至机器。 合适的安装部位：尽量靠近手术部位（但不少于15cm）的平坦的血管丰富的肌肉区；局部皮肤剔除毛发并保持清洁干燥；与手术部位不可左右交叉；距ECG电极15cm；环路中不能有金属移植物、起搏器、心电图电极；极板的长边接近高频电流的来向。 不合适的安装部位：皮肤皱褶和骨性隆起、疤痕、脂肪较厚、身体负重部位、液体积聚部位。 安装负极板时要注意：极板和皮肤要紧密连接；保持极板平整，不能切割和折叠；消毒和冲洗时避免浸湿极板。 4. 连接电刀笔与机器，开机自检，显示负极板安装正确无报警指示后，调节输出功率。 5. 使用完毕，正确关机和揭除负极板，检查极板下方的皮肤，
注意事项 1. 避免旁路灼伤：病人的肢体用布类包裹后妥善固定，不可与接地的金属接触，与金属床之间至少保持4cm厚度的干燥的绝缘层。 2. 避免设备漏电或短路：勿将电线缠绕在金属物品上。 3. 输出功率尽可能小，使用小儿负极板输出功率要控制在常规输出功率的1/3以内。每次激励时间小于10秒，间隔应大于30秒。 4. 病人发生移动后再次检查负极板接触面积或有无移位。 5.预防环境火警：避免在有易燃易爆和挥发性气体、高氧环境环境中使用电刀（尤其是胸部或头部手术），在气道部位使用时应暂时移开氧气。 6.预防意外烧伤：尤其在使用碘酊、酒精消毒皮肤时；肠道手术禁忌使用甘露醇灌肠，肠梗阻的病人慎用电刀，以免爆炸。 7.避免操作不当导致意外伤害 ①保持手术巾的干燥。 ②在常规功率下，使用效果差时，不可盲目加大功率，而 应首先检查负极板与病人的接触及连情况；功率应由小 到大逐渐调试。 ③禁止将报警系统消声，有异常声音发出时，应立即停止 使用并检查原因。
细胞转染的步骤
【试剂与仪器】 1 ．小牛血清。 2 ．双抗溶液（链霉素100μg+ 青霉素100 单位）。 3 ．DMEM 培养基。 4 ．转染试剂（LIPOFECTAMINE 2000 ）。 5 ．细胞培养基（DMEM+10%NCS ）。 6 ．PBS 。 7 ．无血清培养基。 8 ．胰酶（Trypsin ）。 9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机，15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和CCD 。 【操作步骤】 1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90% 。细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用50μl 无血清DMEM 培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用50μl DMEM 培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在5 分钟内同稀释的DNA 混合。保温时间过长会降低活性。 4. 混合稀释的DNA （由第2 步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000 （由第3 步）。在室温保温20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6 小时稳定。 5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml 无血清培养基。 6. 在37℃，5 ％的CO 2 中保温24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
稳定转染步骤
稳定转染细胞株的制备 带质粒的大肠杆菌的激活和扩增 （1）取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻，或者放置37℃恒温水中约2min,待冰完全融解即可使用。 （2）LB培养基的制备按照如下配方配制 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化钠(NaCl) 10g/L 用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4，高温高压灭菌后室温保存，使用时加入氨苄青霉素(浓度为0.1mg/ml) （3）LB固体培养基的制备到200mlLB液体培养基加入3g琼脂混匀后高温高压灭菌，待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀，分别倒入6-7个培养皿中，用封口膜封边，并倒置放于4℃保存。 （4）扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到LB固体培养基上，待凉干后，用封口膜将培养皿封闭，然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃)，根据情况可适当延长培养时间。观察培养基上的单克隆工程菌，待长出后，用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到10mlLB液体培养基中，放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜，第二天观察，待LB液体培养基变浑浊后，4℃冰箱保存，以待进行下一步质粒的提取。 质粒的提取 准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液 （1）取75ml扩增变浑浊的LB液体培养基置于试管中。 （2）5,000×g离心10分钟，弃去上清液，将试管倒置在滤纸上空干。 （3）取出质粒提取盒，用3ml细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。 （4）加入3ml细胞裂解液，轻轻摇晃试管混匀，室温下孵育3分钟，产生白色絮状沉淀，然后加入5ml中和液混匀 （5）将Clearing Column(兰色)放入一新的50ml离心管，将上述试管中裂解后的液体倒入兰管，孵育2分钟，1500×g离心5分钟，效果不佳的话可再离心一次，离心液待用。
电除颤操作流程最新版本
电除颤操作流程 （一）评估 了解患者病情状况、评估患者意识、心电图状态以及是否有室颤波。 （二）操作前准备 1.除颤机处于完好备用状态，准备抢救物品、导电糊、电极片、治疗碗内放纱布5块、摆放有序。 2.暴露胸部，清洁监护导联部位皮肤，按电极片，连接导联线。 3.正确开启除颤仪，调至监护位置；观察显示仪上心电波形；检查除颤仪后向考官报告“设备完好，电量充足，连线正常；电极板完好” 。 4.报告心律“病人出现室颤，需紧急除颤”；（准备时间不超过30秒钟）。 （三）操作 1.将病人摆放为复苏体位，迅速擦干患者皮肤。 2.选择除颤能量，单相波除颤用360J，直线双相波用120J，双相指数截断（BTE）波用150～200J。若操作者对除颤仪不熟悉，除颤能量选择200J。确认电复律状态为非同步方式。 3. 迅速擦干患者胸部皮肤，手持电极板时不能面向自己，将手控除颤电极板涂以专用导电糊，并均匀分布于两块电极板上。 4.电极板位置安放正确；（“STERNVM”电极板上缘放于胸骨右侧第二肋间。“APEX”电极板上缘置于左腋中线第四肋间）电极板与皮肤紧密接触。
5.充电、口述“请旁人离开”。 6.电极板压力适当；再次观察心电示波（报告仍为室颤）。 7.环顾病人四周，确定周围人员无直接或间接与患者接触；（操作者身体后退一小步，不能与患者接触）。 8.双手拇指同时按压放电按钮电击除颤；（从启用手控除颤电极板至第一次除颤完毕，全过程不超过20秒钟）。 9.除颤结束，报告“除颤成功，恢复窦性心律”。 10.移开电极板。 11.旋钮回位至监护；清洁除颤电极板。 12.协助病人取舒适卧位，报告：密切观察生命体征变化，继续做好后续治疗；病人病情稳定，遵医嘱停用心电监护。取下电极片，擦净皮肤。 13.电极板正确回位；关机。 （四）操作后 1. 擦干胸壁皮肤，整理病人衣物，协助舒适卧位，密切观察并及时记录生命体征变化。 2.整理用物。 【本文档内容可以自由复制内容或自由编辑修改内容期待你的好评和关注，我们将会做得更好】
各种转染试剂中文说明
FuGENE6（Roche）转染步骤: 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总 体积到100ul。 2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。 4.室温孵育20分钟。 5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液 洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。 6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。 细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释 4.0ugDNA，轻轻混匀。 3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如 OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。 Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。 NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放 置20分钟。 5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入 2ml无血清配养基。 6.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
lipo2000转染操作步骤
Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
电转染标准步骤
电转染标准步骤 1.清洗电转杯，将电转杯置于75%酒精中浸泡2小时，然后在紫外灯下照射后即可使用。 2.电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前出于对数生长期。对于原代培养细胞，一般培养2-3天后，细胞单层融合度可以达到70-80%，即可开始试验。 3.PBS洗细胞2次后，胰酶消化细胞2min，待细胞变圆后，用完全培养基终止消化。 4.轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min。 5.完全弃去上清，根据细胞数量，加入适量的电转缓冲液重悬细胞（一般为0.5-0.6ml左右），并上下吹打均匀。 6.加入适量相应浓度的待转染核酸至相应的终浓度（质粒为20ug/ml，SiRNA的终浓度为100nM），上下吹打均匀。若以0.5ml计算，所需质粒为0.5×20=10ug。 7.将含有相应浓度核酸的细胞悬液转移入相应规格的电转杯中，按照预定条件设置参数，进行电击操作。（不同细胞电转前，需要进行预试验摸索电转的最佳条件，既要保证较高的转染效率，又要保证较高的细胞存活率。经过实践摸索后得出，相应的最佳参数为：质粒：250V，10ms，1（最多2），0，4mm cuvette；SiRNA: 250V，5ms，1（最多2），0，4mm cuvette。 8.电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中8-12min，以使核酸充分进入细胞。 9.将电击杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养。 10.正常培养4h，待细胞贴壁后，给细胞换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞。 11.培养24h后，即可进行细胞转染效率的检测或是进行细胞的实验处理。
细胞转染操作方法
细胞转染操作方法 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1.试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2.弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3.用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟(37℃，5%CO2)。
用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4.加入1ml的含血清培养基终止反应。 5.用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6.将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7.用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。 8.将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9.将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1.转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2.选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3.将混合液在室温放置10―15分钟。 4.吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5.加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6.到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。