一代测序与二代测序的区别与联系
一代,二代,三代测序原理
一代测序一般指Sanger测序，是上世纪70年代由sanger和Coulson开创的DNA双脱氧链终止法测序，当初几 十个国家花了几十亿刀完成的人类基因组计划就是使用的改良版sanger测序。
Sanger测序一次可以读取600-1000bp的碱基，准确性十分之高，至今仍是正确性的金标准。该技术在当下依 然被广泛应用，比如构建载体做克隆，基因敲除等实验都可以用到。但其通量实在太低，导致在很多情况 下成本太高，难以广泛应用。
二代测序
二代测序技术，又称为Next Generation Sequencing（NGS）技术，高通量测序技术， 是为了改进一代测序通量过低的问题而出现的。刚面世时主要包括Roche公司的454技 术、ABI公司的Solid技术和Illumina公司的Solexa技术。这三种技术都极大的提高了测 序的通量，大大降低了测序成本和周期。
➢ 二代测序和一代测序最大的不同点在于其边合成边测序技术。
二代测序
二代测序
测序流动槽(flowcell)： 每个槽都有共价交联的两种oligo（P5和P7），分别与两 端的接头互补。DNA聚合酶
P5 P7
桥式PCR合成另一条链
NaOH解开双链
NaOH解开双链 后模板链被洗掉
二代测序
流动槽加入引物 Rd1 SP、DNA 聚合酶、荧光标 记的dNTP，对 第一条链测序
三代测序
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序， 并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小 的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅 地降低了背景荧光干扰。
简述基因一代、二代和三代测序技术原理及其应用范围
一、基因测序技术的发展1. 基因测序技术的概念及意义2. 基因测序技术的发展历程3. 基因测序技术的分类及特点4. 基因测序技术的应用范围二、基因测序技术原理及方法1. 基因一代测序技术原理及方法2. 基因二代测序技术原理及方法3. 基因三代测序技术原理及方法三、基因测序技术在生物研究中的应用1. 基因一代测序技术在生物研究中的应用2. 基因二代测序技术在生物研究中的应用3. 基因三代测序技术在生物研究中的应用四、基因测序技术在医学诊断与治疗中的应用1. 基因一代测序技术在医学诊断与治疗中的应用2. 基因二代测序技术在医学诊断与治疗中的应用3. 基因三代测序技术在医学诊断与治疗中的应用五、基因测序技术的发展趋势和展望1. 基因测序技术的发展趋势2. 基因测序技术的未来展望六、结语在人类基因组项目完成后，基因测序技术得到了长足的发展。
基因测序技术已经成为现代生物医学研究的重要工具，其在生物学研究、医学诊断与治疗等领域发挥着重要作用。
基因测序技术主要分为一代、二代和三代测序技术。
本文将对这三种基因测序技术的原理、应用范围等进行详细阐述，旨在全面了解基因测序技术的发展和应用。
一、基因测序技术的发展1. 基因测序技术的概念及意义基因测序技术是指通过化学或物理方法对DNA序列进行测定，进而推导出蛋白质的氨基酸序列的技术。
基因测序技术的发展对于了解生命活动、疾病的发生机制、药物研发等方面具有重要意义。
2. 基因测序技术的发展历程基因测序技术的发展经历了多个阶段，自20世纪末以来，随着技术的不断进步和成本的降低，基因测序技术得到了迅速发展和广泛应用。
3. 基因测序技术的分类及特点基因测序技术可以分为一代、二代和三代测序技术。
一代测序技术具有测序长度长、费用高、速度慢等特点；二代测序技术具有高通量、快速、低成本等特点；三代测序技术具有单分子测序、实时测序等特点。
4. 基因测序技术的应用范围基因测序技术在领域广泛，如生物学研究、医学诊断与治疗、个性化医疗、药物研发等领域都有重要应用。
简述一、二、三代测序技术
简述一、二、三代测序技术
一代测序技术
一代测序技术是一种拼接式测序技术，它可以将DNA片段进行拼接，从而得到DNA序列。
它是一种基于Sanger方法的技术，通过热板和冷板将DNA片段分别固定在支架上，再使用DNA聚合酶对支架上的DNA片段进行复制，最后通过测序仪来获取DNA序列信息。
一代测序技术已经被广泛应用于基因组学研究中，但是它仍然有很多缺点，比如时间短，费用较高，最大的问题是在测序过程中可能出现错误，这种错误很难被确认。
二代测序技术
二代测序技术是一种新的技术，它不需要DNA片段的拼接，而是使用DNA分子组装的方法来提取DNA序列信息。
该技术使用高通量测序技术，可以一次性同时测序大量的DNA片段，因此大大提高了测序效率，并减少了出错的几率，同时也降低了测序成本。
三代测序技术
三代测序技术是一种后续的测序技术，它能够更加精确地提取DNA序列信息，使用特殊的测序仪可以同时测定全基因组的DNA序列。
该技术采用短片段拼接的方法，可以实现更高精度的DNA序列测序，可以更好地发掘基因组中的变异位点，从而更好地研究遗传病和肿瘤的发生机制。
一代、二代、三代测序技术
一代、二代、三代测序技术(2014-01-22 10:42:13)转载第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。
其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。
一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。
第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。
用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。
测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。
延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。
从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。
第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。
新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。
市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。
Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。
在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
基因测序(一代测序和二代测序)-用于临床疑难病原体鉴定精选全文
（一）难鉴定细菌真菌一代测序方法
细菌核糖体基因结构特征
➢ 16S rRNA编码基因约1500 bp，包含约50个功能域。 ➢ 为细菌分类的金标准，由可变区和保守区组成。 ➢ 保守区为细菌共有，可变区有属或种特异性。
真菌核糖体基因结构特征
➢ 18S RNA基因、5.8S rDNA、28S RNA基因较保守， 不适合区分不同属种。
➢诊断不清、治疗 无效、束手无策
二代测序案例分析
➢48小时 ➢完成脑脊液标本二代测序
➢ 提示钩端螺旋体感染 ➢475条序列，占比0.016% ➢改用青霉素治疗
➢32天 ➢男孩痊愈出院
二代测序案例分析
共得到序列数 3,063,784
二代测序过程 PCR扩增选择 性，可丢失大 量病原体片段
二代测序案例分析
➢ 1个样品3000元以上。
二代测序流程
样本收集 保存转运
RNA病毒 也可建库
二代测序 百万序列
7000种病 原体分析
区分致病 菌污染菌
华大基因二代测序可检测病原体近 7000种
可检测病原种类 细菌 真菌 病毒
寄生虫 分枝杆菌（结核和非结核）
支原体/衣原体
种类数量/种 2328 199 4189 135 83 41
病毒有DNA病毒和RNA病毒之分，如怀疑流感病毒、呼吸道合 胞病毒、冠状病毒等RNA病毒，需要注意送检RNA检测流程。
迅敏康IngeniGen公司二代测序可检 测病原体14000多种
可检测病原种类 细菌 真菌 病毒
寄生虫 分枝杆菌（结核和非结核）
衣原体 支原体 立克次氏体
种类数量/种 5682 812 7098 138 94 85 96 90
➢ 间隔区ITSl、5.8S rDNA和间隔区ITS2 在不同真 菌属及种间表现出较高的差异，目前已用于真菌 分类鉴定和分子检测，以ITS2应用最广泛。
二代测序概念
二代测序概念介绍二代测序是一种基因组测序技术，也称为高通量测序技术。
它的出现革命性地改变了基因组学研究领域，使得更快、更廉价的基因组测序成为可能。
二代测序技术的发展，加速了人类对基因组的了解，并为生物医学研究、农业和环境研究等领域带来了巨大的变革。
发展历程第一代测序技术第一代测序技术是早期的基因组测序方法，也被称为经典测序技术。
这些技术包括Sanger测序和Maxam-Gilbert测序。
虽然第一代测序技术在基因组测序方面做出了突破性的贡献，但其过程繁琐、耗时且昂贵。
第二代测序技术第二代测序技术的出现，彻底改变了基因组测序的方式。
与第一代测序技术相比，二代测序技术具有高通量、快速、经济等优势。
这些技术能够同时测序多个DNA片段或RNA序列，大幅度提高了测序效率。
工作原理二代测序技术的工作原理基于DNA扩增和测序-by-synthesis方法。
它包括以下主要步骤： 1. DNA扩增：通过PCR或其它扩增方法，将DNA样本复制成数百万份。
2. 文库构建：将扩增的DNA片段连接到特定适配器上，形成文库。
3. DNA亚化学分析：在流式细胞仪中，将DNA亚化学发光素与DNA片段相结合。
4. 聚合酶扩增：为每个DNA片段提供一个引物，进行轮序扩增。
5. 测序：通过DNA聚合酶，在每个轮序步骤中，加入一个核苷酸，并记录发光情况。
应用领域二代测序技术的广泛应用促进了各个领域的研究和发展。
以下是一些二代测序技术在不同领域的应用： ### 人类基因组学 - 人类基因组测序：通过二代测序技术，可以快速、准确地对人类基因组进行测序，促进了对疾病相关基因的研究和疾病的诊断与治疗。
- 基因组变异分析：通过对人类基因组进行测序，可以发现基因组中的变异，从而研究与疾病相关的遗传变异。
生物多样性研究•元基因组学研究：通过二代测序技术，可以对不同环境中的微生物进行高通量的测序，从而揭示微生物的多样性和功能。
•DNA条形码研究：通过测序特定的基因区域，如COI基因，可以对不同物种进行快速鉴定和分类。
基因测序行业知识普及
基因测序行业知识普及：二代测序无法替代一代测序大多数人的想法是二代测序迟早替代一代测序，这是一个典型的外行人的误区！首先先说明，这里所说的一代测序主要是金标准的Sanger测序，以及其他分型技术和非主流的其他检测方法，例如PCR、芯片、质谱等等，简称为一代测序技术！要说一代测序跟二代测序最大的区别，用我朋友的话说就是现在美国要打本拉登，那么就要搜索本拉登在哪儿，用二代测序它只能告诉你大概范围，比如本拉登60%的概率在阿富汗，20%的概率在德国，20%的概率在美国，然后美国不可能把整个阿富汗炸平吧，更不可能炸完阿富汗去炸德国，然后再炸美国吧，那怎么办，这时候一代测序就要出动了，它可以精确扫描每一个洞穴（基因），找到以后扔一个导弹，本拉登就挂了！你不可能一上来就用一代测序去找，因为全世界洞穴太多，你也不可能用二代测序去定位本拉登，因为它显示的只是概率，究竟本拉登在哪儿还是要精确扫描过！那么回到基因测序上，雪球上有朋友说了，他到深圳想做一次全身测序，结果发现没地方做，深入问了之后发现即使做了意义也不大，因为告诉你的只是概率，甚至误差还不小，价格还很贵！美国之前有一个记者写了一篇文章，她去N个不同的实验室做了基因测序，结果得到的报告结果是截然不同的（这文章可以去百度），原因就是一方面测序的方式不同，导致准确率不同，另外一点就是各个实验室对数据的解读也不同，于是对个体某种疾病的患病风险的评估也会不同！其实这就意味着二代测序对个体而言几乎是完全无意义的。
这可能会颠覆很多人想象中包治百病，神之奇技一样的二代测序吧！但是，虽然二代测序对于个体而言没用，但是如果样本足够多了，就有用了！举个例子，首先，解读不同很大的一个原因还是因为样本数不足，所以大家有分歧，现在全球的样本数也不过就几百万，依然太少，其次，对你个人而言这个基因患病几率50%完全没意义，但是对于整个黄种人而言，如果集体带这个基因，有10%的黄种人有可能患这个疾病，那就有非常重大的意义了，对于药厂而言只要研发成功针对这个基因的靶向药就是赚大钱了！接着，二代测序的成本依然很贵，虽然ILMN宣称成本降低到1000美金，其实还是不够的，就算1000美金也要6000多RMB，谁会吃饱撑了去花6000块做这个检查，关键是检查完了你能得到的只是海量数据（几个TB的数据），然后你去找专业人士解答，结果5个不同的专业人士还给了你5种完全不同甚至截然相反的建议。
一代-二代-三代测序原理
• 化学试剂三羧基乙基膦（TCEP）淬灭荧光信号；有时荧光基团切割不完全给簇形成荧光背景，导致测序够长。 • 叠氮保护基团遇到巯基试剂(如二巯基丙醇)会发生断裂，并在原来的位置形成羟基，供下一个碱基合上。
一代测序
一代测序一般指Sanger测序，是上世纪70年代由sanger和Coulson开创的DNA双脱氧链终止法测序，当初几 十个国家花了几十亿刀完成的人类基因组计划就是使用的改良版sanger测序。
Sanger测序一次可以读取600-1000bp的碱基，准确性十分之高，至今仍是正确性的金标准。该技术在当下依 然被广泛应用，比如构建载体做克隆，基因敲除等实验都可以用到。但其通量实在太低，导致在很多情况 下成本太高，难以广泛应用。
三代测序
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序， 并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小 的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅 地降低了背景荧光干扰。
优势3 ：高准确率
SMRT 测序优势
三代测序
SMRT 测序优势
优势4 ：实时检测碱基修饰信息
三代测序
三代测序
三代测序
SMRT 测序建库
三代测序
Thank you for time
流动槽加入引物 Rd2 SP、DNA 聚合酶、荧光标 记的dNTP，对 第二条链测序。
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一代测序与二代测序的区别与联系
Sanger 法测序（一代测序）
Sanger 法测序利用一种DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。
直到掺入一种链终止核苷酸为止。
每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP 缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T 或 C 处终止。
终止点由反应中相应的双脱氧而定。
每一种dNTPs 和ddNTPs 的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
高通量测序（二代测序）
高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger 测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。
第一代和第二代测序技术
第
X 代公司
平台
名称
测序方
法
检测
方法
大约
读长
(碱基
数)
优点相对局限性
第一代ABI/
生命
技术
公司
3130
xL-37
30xL
桑格-
毛细管
电泳测
序法
荧光/
光学
600-1
000
高读长，准确度一
次性达标率高，能
很好处理重复序
列和多聚序列
通量低；样品制备
成本高，使之难以
做大量的平行测
序
第
一代贝克
曼
GeXP
遗传
分析
系统
桑格-
毛细管
电泳测
序法
荧光/
光学
600-1
000
高读长，准确度一
次性达标率高，能
很好处理重复序
列和多聚序列；易
通量低；单个样品
的制备成本相对
较高
小型化第
二代罗氏
/454
基因
组测
序仪
FLX
系统
焦磷酸
测序法
光学
230-4
00
在第二代中最高
读长；比第一代的
测序通量大
样品制备较难；难
于处理重复和同
种碱基多聚区域；
试剂冲洗带来错
误累积；仪器昂贵
第
二代以鲁
米那
HiSeq
2000/
miSe
q
可逆链
终止物
和合成
测序法
荧光/
光学
2x15
很高测序通量
仪器昂贵；用于数
据删节和分析的
费用很高
第二代ABI/S
OLiD
5500
xlSOL
iD系
统
连接测
序法
荧光/
光学
25-35
很高测序通量；在
广为接受的几种
第二代平台中，所
要拼接出人类基
因组的试剂成本
最低
测序运行时间长；
读长短，造成成本
高，数据分析困难
和基因组拼接困
难；仪器昂贵
第
二代赫利
克斯
Helis
cope
单分子
合成测
序法
荧光/
光学
25-30
高通量；在第二代
中属于单分子性
质的测序技术
读长短，推高了测
序成本，降低了基
因组拼接的质量；
仪器非常昂贵----资料来源于文献：尹银亮、陈会平、毛良伟《新一代DNA测序技术总览》。