免疫学实验指导
免疫学实验方法
免疫学实验方法免疫学实验方法是免疫学研究的重要部分，它通过一系列的技术手段来识别、分析免疫系统中的各种生物分子、细胞和组织，以及它们之间的相互作用。
这些方法在免疫学领域广泛应用于疾病诊断、药物研发、疫苗研究等方面，对促进免疫学的发展和应用发挥了重要作用。
下面将介绍一些常用的免疫学实验方法。
一、ELISA法ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种用于检测抗体或抗原的免疫学实验方法。
该方法通过将待测抗体或抗原与固相物质结合，再加入酶标记的二抗来进行标记，最后通过酶底物的底物变色反应或荧光底物的发光反应来检测待测抗体或抗原的存在量。
二、流式细胞仪流式细胞仪是一种用于分析和计数悬浮细胞的仪器，它利用激光照射细胞，通过细胞膜上的特异性抗体标记来检测细胞的表面标记物和内部细胞器的性质和分布，对免疫细胞的表型和功能进行高效的分析。
三、免疫印迹法免疫印迹法是一种用于检测蛋白质的免疫学实验方法，通过电泳将待测蛋白分离，再将其转移到膜上，最后使用特异性抗体和标记的二抗来检测待测蛋白的存在量和大小。
四、免疫组化法免疫组化法是一种用于检测组织中特定蛋白的免疫学实验方法，通过将组织切片后进行脱水、脱脂和脱水处理，再使用特异性的抗体来标记待测蛋白，并观察标记物的颜色变化或发光情况来确定蛋白的位置和表达量。
五、免疫沉淀法免疫沉淀法是一种用于检测蛋白相互作用的免疫学实验方法，通过将待测抗体与蛋白结合，再使用蛋白A/G琼脂糖或磁珠等材料将蛋白抗原免疫沉淀下来，最后使用核酸酶或质谱技术来分析蛋白的互作关系。
以上介绍的是一些常用的免疫学实验方法，它们在免疫学研究中起着举足轻重的作用，不仅在科研领域有重要应用，同时在临床诊断和治疗中也有着广泛的运用。
希望以上内容能够对您有所帮助。
医学免疫学-免疫学实验1
【实验步骤】
Mouse handling and manual restraint 小鼠固定方法
Intraperitoneal inje学院免疫学教研室
实验室规则
1.穿好隔离衣。
2.保持肃静和秩序，少说、多做、多想。
3.禁止饮食、吸烟，上课时关闭通讯工具。
4.用过的实验材料，放于指定地点，不得随意抛置。
5.注意节约实验试剂，爱护实验器材（显微镜的使用）。
6.易燃物品（如酒精等）不准接近火源。
7.实验结束后，将实验台整理清洁，值日同学打扫好室内
兔抗羊红细胞抗体（溶血素）制备方法
日期（天） 第1天
途径
皮内
抗原
全血
剂量（mL） 0.5
第3天 皮内 全血 1.0
第5天 皮内 全血 1.5
第7天 皮内 全血 2.0
第12天 第15天
静脉
静脉
20%悬液 20%悬液
1.0
2.0
【实验步骤】
（二）心脏采血
1. 固定家兔，用碘酒、酒精消毒心前区皮肤。 2. 胸骨左缘外侧1-2cm左右、3-4肋间，（胸骨中
线中段略偏左处），选择心跳最明显处垂直进 针。 3. 注射部位正确时，血液会自动涌入针管。缓慢 抽出所需血量，体重2kg左右的家兔，一般每次 可采血4~5ml 。
注意事项
•取血部位要准确，不要划破家兔心脏，尽量不 令动物死亡； •见到回血再取血； 1.向试管中注射血液时要将针头取下。
实验报告
• 吞噬细胞吞噬功能检测的原理、步骤及镜下观察结果； （瑞氏染色 观察倍数）
免疫学实验教案
实验一凝集反应一、目的要求学习和掌握用试管凝集反应测定抗血清效价的方法。
二、实验说明细菌、螺旋体、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在有适量电解质存在的情况下，抗原颗粒相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。
参加反应的抗原称凝集原，抗体称凝集素。
三、实验材料1．试剂抗原、石炭酸生理盐水、阳性血清、被检血清、阴性血清。
2．器材及其他载玻片、小试管（1 cm×6.5 cm）、试管架、移液管、吸管、水浴锅。
四、方法步骤1．玻片凝集实验（1）在载玻片两端各滴一滴大肠杆菌菌悬液。
（2）在一端的菌悬液中加入一滴1:10稀释的大肠杆菌抗血清，另一端悬液加入一滴生理盐水。
（3）将载玻片小心地振动使混合液混匀后静置于室温，数分钟后便可观察到加抗血清的一端产生凝集块，而另一端生理盐水对照没有凝集块产生。
若反应不明显，可放入培养皿中（皿内放入湿滤纸，以保持一定湿度），37℃保温30 min后观察结果。
亦可将载玻片放置显微镜下，凝集块明显可见。
2．试管凝集试验（1）抗血清的稀释抗血清稀释采取倍比稀释法。
取干净小试管7支，排列在试管架上，依次注明号码，每支试管用移液管加入0.5 ml生理盐水。
（2）按下表操作用0.5%石炭酸生理盐水，将待检血清稀释成4个稀释度，5、6、7管分别设为抗原对照、阳性对照和阴性对照。
（3）加入抗原各管中加入抗原0.5ml，充分混匀。
（4）抗原抗体反应把各管混合液振摇混匀，置37℃水浴箱中水浴4 h或在室温中过夜，观察结果。
（5）结果观察与效价判断①生理盐水对照管中的抗原（细菌）应分散，无凝集块沉淀而呈混浊菌悬液。
②实验管如有凝集，管底可见到凝集块，液体上部澄清、半澄清或混浊度降低，管底凝集块轻摇即浮起，呈片块状。
③凝集强弱的判断（以“+”表示）“-”：细菌不被凝集，液体混浊、无透明度，管底无伞状沉淀，但由于菌体自然下沉，管底中央出现圆点状沉淀，振荡时复呈均匀混浊状态。
“+”：液体透明度不明显（25%清亮），25%菌体凝集，管底有少许不明显的伞状沉淀。
病原生物学与免疫学 实验指导
病原生物学与免疫学实验指导病原生物学与免疫学实验指导一、引言病原生物学与免疫学是生命科学领域中重要的研究方向，它们关注病原微生物的致病机制以及机体的免疫反应。
通过实验研究，可以深入了解病原微生物的传播途径、生长特性、致病机制，以及机体的免疫应答过程。
本实验指导将介绍病原生物学与免疫学实验的基本原理、实验操作步骤和实验结果的分析与讨论。
二、实验原理1. 病原生物学实验原理病原生物学实验主要通过分离、培养和鉴定病原微生物，以及研究其生长特性、毒力因子和抗药性等方面的特征。
常用的实验方法包括细菌分离培养、菌落计数、菌液浓度测定、生长曲线分析等。
此外，还可以通过PCR技术、DNA测序等分子生物学方法进行病原微生物的鉴定和分析。
2. 免疫学实验原理免疫学实验主要研究机体的免疫系统以及对病原微生物的免疫应答。
常用的实验方法包括免疫细胞分离培养、细胞因子测定、抗体检测、细胞毒性测定等。
此外，还可以利用流式细胞术、ELISA、免疫组化等技术进行免疫细胞的鉴定和免疫反应的分析。
三、实验步骤1. 病原生物学实验步骤（1）细菌分离培养：从临床样本或环境中采集细菌样品，进行分离纯化并进行培养。
（2）菌落计数：将培养液均匀涂布在琼脂平板上，经过一定时间后，用计数器进行菌落计数。
（3）菌液浓度测定：通过分光光度计测定菌液的吸光度，根据标准曲线计算菌液中的菌落数量。
（4）生长曲线分析：将菌液接种到含有适宜培养基的培养皿中，定期取样测定菌液浓度，绘制生长曲线。
2. 免疫学实验步骤（1）免疫细胞分离培养：从外周血或组织中分离免疫细胞，进行细胞培养。
（2）细胞因子测定：通过ELISA等方法检测培养上清中细胞因子的含量。
（3）抗体检测：利用ELISA或免疫印迹等技术检测血清中抗体的水平。
（4）细胞毒性测定：通过流式细胞术等技术测定细胞对靶细胞的毒杀能力。
四、实验结果分析与讨论1. 病原生物学实验结果分析（1）菌落计数结果反映了样品中细菌的数量，可以用于判断感染程度。
免疫学实验技巧分享
免疫学实验技巧分享免疫学实验是生命科学研究中的重要组成部分，对于揭示免疫机制、诊断疾病以及研发免疫治疗方法都具有至关重要的意义。
在进行免疫学实验的过程中，掌握一些实用的技巧可以大大提高实验的成功率和准确性。
接下来，我将为大家分享一些在免疫学实验中积累的宝贵经验。
一、实验前的准备（一）实验设计在开始实验之前，一定要进行详细的实验设计。
明确实验的目的、预期结果以及所需的实验步骤。
同时，要考虑到可能出现的误差和干扰因素，并制定相应的应对措施。
合理的实验设计是实验成功的基础。
（二）试剂和材料的选择选择高质量、可靠的试剂和材料至关重要。
对于抗体、细胞因子等关键试剂，要选择知名品牌，并仔细查看其说明书，了解其适用范围、保存条件和使用方法。
此外，实验中使用的耗材，如移液器枪头、离心管等，也要确保无菌、无杂质。
（三）仪器设备的校准和维护定期对实验中使用的仪器设备进行校准和维护，如移液器、离心机、酶标仪等。
确保仪器的准确性和稳定性，能够有效减少实验误差。
二、细胞培养技巧（一）细胞的复苏细胞复苏是细胞培养的第一步，操作不当容易导致细胞死亡。
从液氮中取出细胞冻存管后，要迅速放入 37℃水浴中，轻轻摇动使其快速融化。
融化过程中要避免水没过管盖，以免造成污染。
待细胞完全融化后，将其转移至离心管中，加入适量的培养基，离心去除冻存液，然后将细胞重悬并接种到培养瓶中。
（二）细胞的传代当细胞生长至 80%－90%汇合度时，需要进行传代。
传代前要先对细胞进行消化处理，常用的消化酶有胰蛋白酶和 EDTA 等。
消化时间要根据细胞的类型和状态进行调整，一般控制在 1-5 分钟。
消化结束后，加入适量的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其分散，然后按照适当的比例进行传代。
（三）细胞的冻存为了长期保存细胞，需要进行冻存。
冻存细胞时，要先将细胞消化、离心，然后用含有 10%DMSO 的冻存液重悬细胞，将细胞分装至冻存管中，缓慢降温至－80℃，最后转移至液氮中保存。
免疫实验
操作
1、溶菌酶测定 P.56
2、豚鼠过敏性休克
3、血脑屏障
【实验原理】 溶菌酶是一种小分子蛋白，分子量约14kD，由129个氨基酸组成， 属一种碱性蛋白质。它能与细菌牢固结合，并通过水解革兰阳性菌细 胞壁中的粘肽成份，而致细菌溶解。革兰阴性菌的细胞壁粘肽层的外 面含有脂多糖和脂蛋白，在一般情况下不受溶菌酶的影响。 【主要试剂与器材】 1. 溶壁微球菌 溶壁微球菌是从空气中分离出的一种革兰阳性球菌，其对 营养要求不高，在普通培养基生长良好，菌落呈黄色，1个月传代1次 或冻干保存。 2. 琼脂粉(优质) 溶于1/15mol/L pH6.4PBS。 3. 溶菌酶溶菌酶标准品。
4. 新鲜鸡蛋清、唾液、人血清。
5. 无菌打孔器(孔径5mm左右)、毛细滴管。
【结果判断】 加唾液孔和标准溶菌酶孔周围的溶壁微球 菌被溶解，可见圆形透亮区，即溶菌环。溶菌 环的大小与溶菌酶的含量成正比。
原理
注射异种蛋白——IgE（致敏状态） 再次较大剂量相同抗原注射，抗原与IgE结合
肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒——释放活性 介质
过敏性休克 （兴奋不安、抓鼻、呃逆、竖毛、大小便失禁和 痉挛性跳跃，重者数分
免疫学方法
免疫学方法免疫学是研究生物体对抗外源性病原体和异物的免疫应答机制的科学。
免疫学方法是研究免疫学过程和免疫学问题的一种手段，主要包括免疫学实验方法、免疫学检测方法和免疫学治疗方法等。
本文将从这几个方面对免疫学方法进行介绍。
一、免疫学实验方法。
1. 免疫细胞分离和培养。
免疫细胞分离和培养是研究免疫细胞生物学特性的重要方法。
通过离心、梯度离心、磁珠分选等技术，可以分离出各种免疫细胞，如T细胞、B细胞、巨噬细胞等，并进行体外培养，用于进一步的实验研究。
2. 免疫组化技术。
免疫组化技术是利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过染色或荧光标记等方法来检测组织中特定抗原的分布和表达情况。
这项技术在病理诊断、免疫细胞定位等方面有着广泛的应用。
3. 免疫沉淀技术。
免疫沉淀技术是利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过将抗体与抗原结合后沉淀下来，从而分离出特定的蛋白质或复合物。
这项技术在蛋白质相互作用、蛋白质结构分析等方面有着重要的应用。
二、免疫学检测方法。
1. ELISA法。
ELISA法是一种常用的免疫学检测方法，通过将待检样品中的抗原或抗体与固相载体上的特异性抗体或抗原结合，再加入酶标记的二抗或底物，通过酶的催化作用产生可检测的信号，从而进行定量或半定量的检测。
2. 免疫印迹法。
免疫印迹法是通过将待检样品中的蛋白质分离、转膜到膜上，然后用特异性抗体结合，最后通过化学发光或染色等方法来检测特定蛋白质的存在和表达水平。
3. 流式细胞术。
流式细胞术是一种利用流式细胞仪对细胞进行快速、高通量的检测和分析的方法，可以用于细胞表面标记物的检测、细胞周期分析、细胞凋亡检测等。
三、免疫学治疗方法。
1. 免疫抑制剂。
免疫抑制剂是一类能够抑制免疫系统功能的药物，常用于器官移植术后的免疫抑制治疗，以防止移植物排斥反应。
2. 免疫增强剂。
免疫增强剂是一类能够增强免疫系统功能的药物或治疗方法，常用于免疫功能低下或免疫缺陷性疾病的治疗，以增强机体抵抗能力。
医学免疫学实验
【实验方法】
1. 标记。取洁净载玻片1块，如下图标记。
A B
2. 采血。用酒精棉签消毒被检者手指尖端，以采 血针刺破皮肤，稍加挤压，使血液流出。收入小 试管，用吸管各取适量分别加在载玻片的两端。
A B
3. 加抗体。将抗A、B试剂分别加1滴与玻片上两 侧的血液混匀。
A
抗A
B
抗B
4. 观察红细胞有无凝集发生？ 如有凝集，可见红细胞凝集成细沙样； 无凝集，红细胞呈均匀分散。
【讨论】
实验二、直接凝集反应（玻片法） —— 血型鉴定
玻片凝集试验为定性试验，一般用已知抗体作 为诊断血清，与受检颗粒抗原，如菌液或红细胞抗 原各加一滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼 观察凝集结果，出现凝集颗粒的为阳性。此法简便， 快速，适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断 或分型，也可用于红细胞ABO血型的鉴定。
医学免疫学实验（一） ——凝集反应
【实验目的】
1. 了解凝集反应的原理、基本类型及其临床意义。 2. 掌握玻片凝集实验、间接凝集实验的实验方法和 结果分析。
【实验内容】
1. 直接凝集反应（试管法）— 溶血素效价的测定 2. 直接凝集反应（玻片法) — 血型鉴定
3. 间接凝集反应 — RF因子的乳胶凝集实验（示教）
NS (ml)
溶血素 (ml)
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
弃去
—
0.2
稀释度
1%SRBC(ml）
1:100
0.2
1:200
0.2
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实验一免疫球蛋白的粗提（盐析法）一、实验目的1、学习免疫球蛋白的粗提方法2、实践IgG分离纯化过程3、了解分离纯化抗体的原理二、实验原理随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。
纯化的方法很多，有单一法，常用盐析法、凝胶柱层析、离子交换剂层析以及免疫亲和层析等技术对血清抗体进行分离纯化。
但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过透析或层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。
硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。
不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。
盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进行分离。
水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础，在蛋白质胶体溶液中加入一定量的（NH4）2SO4或Na2SO4盐类，使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白质溶解度也随之降低。
蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级析出。
33% （NH4）2SO4为沉淀IgG的最适饱和度。
二、实验材料与试剂配制1．人全血清（购买商品）2．硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH 调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。
如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3．0.01Mol/L pH7.4 PBS液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至 1 000mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。
4．0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液三、实验步骤1、取免疫血清0.25 mL置于1.5ml离心管中，加0.25mL 生理盐水/PBS2、逐滴加入饱和（NH4）2SO4 0.5 mL（此时为50%饱和度），4℃，静置20 min，3000 r/min 离心20 min3、弃上清，取沉淀溶于1 mL 生理盐水/PBS中4、逐滴加入饱和（NH4）2SO4 0.5 mL（此时为33%饱和度），4℃，静置20 min，3000 r/min 离心20 min5.重复步骤3～4，2次6.取沉淀溶于0.5 mL 生理盐水中，-20摄氏度保存备用四、注意事项1、盐析时注意饱和硫酸铵加入血清中的速度和方式，边加边缓慢摇动，并避免产生气泡。
2、注意区别前后2次盐析所采用的饱和硫酸铵的终浓度。
五、实验报告1、记录实验步骤结果2、思考题：分离纯化IgG时，为什么硫酸铵的饱和度先调至50%，然后调至33%？加入硫酸铵溶液时，为什么要一滴滴地加？实验二琼脂糖免疫电泳实验一、实验目的1、了解免疫电泳的原理和用途。
2、掌握免疫电泳的操作过程和方法。
3、掌握免疫电泳实验结果的分析方法，并对粗提的蛋白进行检测。
二、实验原理免疫电泳为区带电泳与双向免疫扩散的结合。
先利用区带电泳技术将不同电荷和分子量的蛋白抗原在琼脂内分离，然后在与电泳方向平行的方向上开槽，加入抗血清。
37℃下使两者扩散，各区带蛋白在相应的位置与抗体反应形成弧形沉淀线。
免疫电泳原理见图。
三、实验材料和试剂配制人全血清、粗提蛋白、兔抗人血清、琼脂糖、0.05mol/L巴比妥缓冲液（PH8.6）、电泳槽、电泳仪、载玻片、毛细管、塑料吸管四、实验步骤1、配制1.5％的琼脂糖，加热使之融化，（巴比妥缓冲液配制）2、吸取4－5 mL琼脂糖溶液，均匀涂布到载玻片上，注意要马上用吸管尖把琼脂表面整平，若有气泡立刻除去，并立即于中间横放一根毛细管，待凝，制成2mm的琼脂板。
3、打孔及开槽，挑去孔内的琼脂，槽内琼脂暂不挑出。
（打一个孔即可）。
于酒精灯上小心烘烤，使琼脂与玻璃板贴紧。
4、用微量加样器加入10－20uL的粗提蛋白和人全血清，不要溢出（可加入指示剂）。
5、把载玻片放到电泳槽中，倒入巴比妥缓冲液，琼脂板两端用滤纸与缓冲液搭桥，接通电源，电压10-12v/cm电泳1-2h。
6、样品中有蓝色染料，当蓝色接近另一端时，终止电泳，小心取出载玻片。
7、用刀片在胶体的中央，划两道平行线。
刀刻要深及底部，两道平行线间隔不可大于3 mm。
用大头针挑去琼脂。
8、加入兔抗人血清，放入湿盒中，37 ℃下扩散24h。
9、观察实验结果五、实验结果观察沉淀弧的位置和条数，并画出沉淀弧。
五、注意事项1、抗原与抗体浓度比例应适当，否则会使某些成分不出现沉淀线。
当蛋白质抗原浓度高于20g/L，应用缓冲液稀释后再进行电泳和扩散。
2、浇板时要求厚度均匀，无气泡。
3、打孔挖槽时要求外壁整齐，防止琼脂破裂。
4、扩散过程中需要在不同时间进行结果观察，做好记录。
5、每次电泳后应倒换正负电极或将两槽缓冲液混合后再使用实验三酶联免疫吸附（ELISA）夹心法测乙肝表面抗原（HBsAg）一、实验目的1．熟悉ELISA的原理、夹心法。
2．了解免疫标记技术的原理。
二、实验原理免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。
它以酶作为标记物，与抗体（或抗原）联结，与相应的抗原（或抗体）作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。
目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），它是将可溶性抗原（或抗体）吸附于固相载体上，加入酶标抗体（或抗原）与吸附在载体上的抗原（或抗体）结合，形成酶标记复合物，再加入酶底物时，即可显色。
颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量相关。
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），相应的底物分别是邻苯二胺（OPD）和对硝基苯磷酸盐。
实验方法有间接法、夹心法和竞争法。
在本次实验中，采用多克隆抗-HBs包被反应板，加入待测标本，同时加入单克隆抗-HBs-HRP，如待测标本中含有HBsAg时就与包被抗-HBs、抗-HBs-HRP 结合形成复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之就无显色反应。
三、实验材料1．乙肝病毒HBsAg酶联免疫诊断试剂盒（包含以下部分）。
预包被微孔条（用纯化的抗-HBs包被）。
酶联试剂（用HRP标记的抗HBs）。
HBsAg阳性对照。
HBsAg阴性对照。
洗涤液(浓缩液)。
显色剂A、B。
终止液（2 mol/L H2SO4）。
2．微量加样器，混合振荡器，恒温箱，吸水纸，蒸馏水等。
四、实验方法1．配液浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释使用。
2．编号将微孔条固定于支架，按序编号。
3．加样分别用加样器加待检血清和阴、阳性对照50 μ1（1滴）于相应孔中，设空白对照孔（加50 μ1洗涤液）。
4．加酶除空白对照外，每孔加酶联试剂50 μl（1滴）。
5．温育振荡混匀，置37℃30 min后取出。
6．洗涤甩去孔内液体，扣干，用洗涤液注满各孔，静置2 s，甩干，重复5次后拍干。
7．显色每孔加显色剂A、B各50 μl（1滴）振荡混匀，37℃暗置15 min。
五、实验结果1．在白色背景下观察各孔显色情况，有明显蓝色者为阳性，无色者为阴性。
六、注意事项1．试剂盒应于4℃存放，在有效期内使用。
2．微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余者及时封存。
3．滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。
滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将试剂滴在孔壁上。
4．洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。
5．待测标本不可用NaN3防腐。
所有样品都应按传染源处理。
实验四血涂片的制作及免疫细胞形态观察一、目的要求（一）掌握微量采血及血涂片的制作方法。
（二）学习使用光学显微镜观察免疫细胞。
二、实验原理血涂片是临床化验中最常规的技术，也是血液学研究中的最基本技术。
将血液样品制成单层细胞的涂片标本，经瑞氏（Wright）染液染色后，不同免疫细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。
根据细胞中颗粒的颜色、大小及多少，再结合细胞的大小及细胞核的形态，就可以将免疫细胞进行分类计数。
三、实验器材医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、经脱脂洗净的载玻片等四、实验试剂伊红-甲基蓝染液取伊红-甲基蓝粉末0.1克（旧称瑞氏染剂），放在研缽内加适量甘油研磨。
量取纯甲醇60毫升，少许倒入研缽内使染料溶解，已溶部分移入棕色瓶中，未溶部分再加少许甲醇研磨，直到全部溶解为止。
把装染液的棕色瓶密封放阴暗处保存。
最好提前半年配制。
五、实验步骤1．采血采血前用70%酒精棉球消毒人的指腹或耳垂，干后用采血针刺破指腹或耳垂的皮肤；挤去第一滴血不要（因含单核细胞较多）。
2．涂片挤出第二滴血置于载玻片的一端，再取另一张边缘光滑的载玻片，斜置于血涂片的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状，两玻片的角度以30°~40°角为宜（角度过大血膜较厚，角度小则血膜薄），轻轻将载玻片向前推进，即涂成血液薄膜（如下图），推进时速度要一致，否则血膜成波浪形，厚薄不匀。
3．染色待涂片在空气中完全干燥后，将伊红-甲基蓝染液滴在血膜上，至染液淹没全部血膜，染半分钟。
加等量蒸馏水或缓冲液与染液混合再染5分钟。
最后用蒸馏水把染液冲掉，用吸水纸吸干，待自然干燥后，即可。
涂片如有色渣，可用三种方法清除：一是再加伊红-甲基蓝染液于涂片上，略加摆动，使色渣溶于甲醇中，待甲醇挥发，加蒸馏水或缓冲液。
二是把血片放水槽中，保持水平，色渣即从玻片边缘溢出。
三是把血片呈45°倾斜，吸95%酒精徐徐滴涂片面，至流下酒精变蓝后，清水冲净晾干。
涂片如有香柏油，用擦镜纸擦去仍可用酒精处理。
4．观察分别用低倍、高倍和油镜观察血涂片，分辨不同的血细胞类型。
用低倍镜观察血涂片，可见红细胞染成粉红色，呈中间色浅、周围色深的圆盘状，没有细胞核。
白细胞较少，难找到，多集中在涂片边缘或推片方向前缘。
比红细胞大，染成蓝紫、红紫色。
主要看白细胞中较多的嗜中性粒细胞与淋巴细胞的形态。
1.嗜中性粒细胞细胞质染成红紫色，核染成蓝紫色。
核分为2～5叶。
刚成熟的细胞仅有一叶呈“S”状的细胞核。
2.淋巴细胞直径大小不一，以小淋巴细胞为主，其大小与红细胞相似。
细胞核呈圆形或卵圆形，一侧有凹痕，染色质致密块状，被染成深蓝紫色。
核周围可见少数淡蓝色细胞质。
3.血小板为不规则小体，直径约2～3微米。
血小板周围部分为浅蓝色，中央有细小的紫红色颗粒，且聚集成群。