流动相在层析过程中
合集下载
层析柱的原理
层析柱的原理
层析柱是一种常用的色谱技术，它利用物质在固定相和流动相之间的分配行为
进行分离和分析。
层析柱的原理主要包括样品的吸附、分配和解吸过程。
首先，样品在固定相上发生吸附作用。
固定相是层析柱中的固体填充物质，它
能够吸附不同化合物的分子。
当样品混合物通过固定相时，不同成分的分子将以不同的速率被固定相吸附，从而实现分离。
其次，样品在固定相和流动相之间发生分配作用。
流动相是层析柱中的移动相，它可以是液体或气体。
当样品混合物通过固定相时，固定相吸附的成分会根据其在固定相和流动相之间的分配系数，以不同速率被分配到流动相中，从而实现进一步的分离。
最后，样品在流动相中发生解吸作用。
在流动相的作用下，被分配到流动相中
的成分将逐渐被释放出来，从而完成分离过程。
层析柱的原理可以用来解释各种类型的色谱技术，包括气相色谱、液相色谱和
超临界流体色谱等。
不同类型的色谱技术在固定相和流动相的选择上有所不同，但它们都遵循着样品的吸附、分配和解吸过程，以实现对样品混合物的分离和分析。
总的来说，层析柱的原理是基于样品在固定相和流动相之间的不同亲和性和分
配行为，利用固定相对样品混合物进行吸附和分配，最终实现对样品的分离和分析。
这种原理不仅在实验室中被广泛应用，也在工业生产和环境监测等领域发挥着重要作用。
通过深入理解层析柱的原理，可以更好地掌握色谱技术的应用和优化方法，为科研工作和实际应用提供有力的支持。
色谱技术
流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐
缓冲液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的 混合溶剂，水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面 的硅羟基，防止因吸附而至的拖尾现象。
通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来 增大蛋白质和多肽的疏水性。
4、离子交换色谱（ICE）
以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂
（2）抗体连接到载体上
离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段
操作要点：
– 由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离 程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以 用阴离子交换，可视具体情况而定 – 由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通 常采用弱阳或弱阴离子交换剂 – 适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常 采用的pH值靠近其等电点（不是等电点）
常用的吸附剂
氧化铝 硅胶 活性炭 纤维素 聚酰胺 硅藻土
展开剂的选择
展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大 根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分
离的效果
展开剂选择的原则：
（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极
性应比被分离物质的极性略小
（2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力
信 进样 号
tM
因为这种物质不被固定相吸附或溶 解，故其流动速度将与流动相流动速度 相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱
长L与tM的比值计算，即
ū = L/tM
2. 保留时间tR 试样从进样到柱后出现峰极大点时所 经过的时间，称为保留时间，如下图。
信 号
进样
tR
3.调整保留时间tR´ 某组分的保留时间扣除死时间后，称 为该组分的调整保留时间，
名词解释
固定相和流动相：层析系统中的两个互不相溶的相：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。
级联放大作用：由于酶的共价修饰反应是酶促反应，只要有少量的信号分子（如激素）存在，即可通过加速这种酶促反应，而使大量的另一种酶发生化学修饰，从而获得放大效应，这种调节方式快速，效率极高。
蛋白质超二级结构：在蛋白质分子中，特别是球状蛋白质中，由若干相邻的二级结构单元（即α-螺旋，β-折叠片和β-转角等）彼此相互作用组合在一起，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件单元，称超二级结构。
肽平面：组成肽键的四个原子及与之相连的两个α-碳原子都处在同一个平面内，这个刚性平面称为肽平面。
酶的国际单位：1个酶活力单位是指在特定条件下，在1min内能转化1u mol底物的酶量。
测定条件为250C 和其他最适条件，该单位为国际单位。
PCR：聚合酶链式反应，又称体外基因扩增。
该法模拟体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链分开，然后是引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。
重复此过程，DNA以指数方式扩增。
引物为特定引物。
RAPD：随机扩增多态性。
其方法是用一个随机核苷酸序列为引物对基因组DNA进行PCR扩增，产生不连续的DNA产物，再通过凝胶电泳来观察扩增片段的多态性，获得特异分子标记。
RFLP限制性片段多态性，由限制性内切酶把很大的DNA分子降解成许多长短不同的较小片段，其数目和长度反映了限制性内切酶的切点在DNA分子上的分布，它能作为某DNA或含这种DNA生物所特有的“指纹”，不同个体的等位基因之间碱基代换、重排、插入、缺失等都会引起这种“指纹”的多态性。
AFLP：扩增片段长度多态性。
是RFLP和PCR技术相结合产生的一项新技术，用限制性内切酶消化基因组DNA，由于不同材料的DNA的酶切片段存在差异，用特定引物选择性的扩增基因组限制性酶切片段，再用凝胶电泳分离就可以观察基因组DNA的多态性拓扑异构酶通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二脂键，然后重新纠缠和封口来改变DNA连环数的酶。
生物化学实验-层析实验
结果解释
实验结论
根据实验结果分析，得出实验的结论，如各组分的含量、比例以及 分离效果等。
结果解释
对实验结果进行合理解释，包括组分性质、分离原理等方面的解释。
误差分析
对实验结果进行误差分析，找出可能影响实验结果的因素，提高实 验的准确性和可靠性。
05
层析实验注意事项
安全注意事项
避免使用过期试剂
过期的试剂可能含有有害物质或产生 不稳定的结果，应避免使用。
要点二
检测程序
设置检测程序，控制检测器的参数，进行实时监测和记录 数据。
04
层析实验结果分析
数据记录
实验数据
在层析实验中，需要详细记录实 验过程中的各项数据，包括洗脱 液的体积、流速、检测波长等。
图像记录
层析实验通常伴随着色谱图的生 成，需要准确记录色谱图，包括 峰高、峰面积等关键信息。
异常情况记录
生物化学实验-层析实验
目录
• 层析实验简介 • 层析实验的种类 • 层析实验操作流程 • 层析实验结果分析 • 层析实验注意事项
01
层析实验简介
层析实验的定义
层析实验是一种分离和纯化混合物中 各组分的方法，利用不同物质在固定 相和流动相之间的分配差异进行分离。
它是一种常用的生物化学实验技术， 广泛应用于生物、医学、药学等领域。
使用高质量的试剂可以减少实验误差，提高 实验结果的准确性。
重复实验
对实验结果进行重复验证，以减少误差并提 高结果的可靠性。
标准化操作
按照标准化的操作步骤进行实验，避免因操 作不当导致误差。
数据处理
对实验数据进行正确的处理和分析，以减少 误差并得出准确的结论。
实验结果可靠性评估
第四章层析
（三）按照载体性质分类
1. 疏水性载体----苯乙酸型树脂；丙烯酸型树脂
1.1 凝胶型树脂 1.2 大孔树脂
2. 亲水性载体
2.1 纤维素离子交换剂 2.2 交联葡聚糖离子交换剂 2.3 琼脂糖离子交换剂
1. 疏水性载体
母体：苯乙烯
交联 剂
聚苯乙烯
1.1 凝胶型素
层析技术：固定相+流动相+支持物
固定相：与流动相互不相溶，与待分离的化合物进行 可逆的吸附，溶解，交换等作用。
流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物 质 朝着一个方向移动的液体、气体等。柱层析中一 般称 为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
支持物：纸层析，薄层层析，柱层析
层析的分类
分类原则 据溶质分子与固 定相相互作用的 机理不同
据固定相的形 状 不同
据流动相的物态 不同
按操作方式不同
类型
吸附色谱 离子交换色谱 疏水作用层析 金属螯合色谱 共价作用色谱 分配色谱 凝胶过滤 亲和色谱 柱层析 纸层析 薄层层析
气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱
迎头法（迎头 分 析） 顶替法 (置换 展 开)
结构疏松，对生物高分子物质(如蛋白质和核酸 分子)有较大的穿透性；
表面积大，因而有较大的吸附容量； 基质是亲水性的，避免了疏水性反应对蛋白质 分离的干扰；
电荷密度较低，与蛋白质分子结合不牢固，在 温和洗脱条件下即可达到分离的目的，不会引起蛋白 质的变性。
但纤维素分子中只有一小部分羟基被取代，结 合在其分子上的解离基团数量不多，故交换容量小， 仅为交换树脂的1/10左右。
显微孔：平均孔径2-4nm 适合吸附无机离子（0.3-0.6nm），不能吸附大分子有
柱层析 第七组
陈雪燕 陈湘 罗芳芳 张洁娣 曹静怡 郑立君
层析的原理
固定相 固定相是层析的一个基质。 固定相是层析的一个基质。它可以是固 体物质（如吸附剂、凝胶、 体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂 ），也可以是液体物质 也可以是液体物质（ 等），也可以是液体物质（如固定在硅 胶或纤维素上的溶液）， ），这些基质能与 胶或纤维素上的溶液），这些基质能与 待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、 待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、 交换等作用。 交换等作用。 固定相对层析的效果起着关键的作用 对层析的效果起着关键的作用。 固定相对层析的效果起着关键的作用。
(4) 洗脱
洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。 洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。 简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。 简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。 如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（ 如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或 洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。 洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。 分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液， 分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级 洗脱。它主要对混合物组成简单、 洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适 每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。 用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。 梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。 梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。 它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH 它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH 值等。最常用的是浓度梯度。 值等。最常用的是浓度梯度。 • 在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种，如下页图所 在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种， 示。
层析的原理
固定相 固定相是层析的一个基质。 固定相是层析的一个基质。它可以是固 体物质（如吸附剂、凝胶、 体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂 ），也可以是液体物质 也可以是液体物质（ 等），也可以是液体物质（如固定在硅 胶或纤维素上的溶液）， ），这些基质能与 胶或纤维素上的溶液），这些基质能与 待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、 待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、 交换等作用。 交换等作用。 固定相对层析的效果起着关键的作用 对层析的效果起着关键的作用。 固定相对层析的效果起着关键的作用。
(4) 洗脱
洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。 洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。 简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。 简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。 如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（ 如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或 洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。 洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。 分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液， 分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级 洗脱。它主要对混合物组成简单、 洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适 每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。 用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。 梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。 梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。 它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH 它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH 值等。最常用的是浓度梯度。 值等。最常用的是浓度梯度。 • 在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种，如下页图所 在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种， 示。
层析技术
流动相在推动固定相中的混合物朝一个方 向移动是，由于混合物中各组分的理化性 质（吸附力、溶解度、分子形状和大小、 分子极性、分子亲和力等）的差异，各组 分受固定相的阻滞作用和受流动相的推动 作用各不相同，在层析柱中移动速度也不 同，从而使混合物中结构上只有微小差异 的组分分离开来。
2、析法的特点
3.按操作形式不同
柱层析
平面层析:包括纸层析、薄层层析、薄膜层 析等
三、常用的层析方法
1、凝胶层析 2、离子交换层析 3、亲和层析 4、吸附层析 5、分配层析
（一）凝胶层析
1、凝胶层析的原理
凝胶层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝胶颗粒，颗粒 内部不是实心的，而是三维多孔网状结构。在洗脱过程中， 混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因其直径大于凝胶网 孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着凝胶颗粒的 空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快，先流出层析柱； 小分子组分由于其分子直径小于网状结构的孔径，可进入 凝胶颗粒内部，流程长而移动速度。慢，比大分子物质后 流出层析柱，分子大小不同的混合物因此得到分离。
层析技术介绍
一、层析技术的基本概念和特点
1、定义
层析(又名色谱)一种 利用混合物中各组分 的物理化学性质间的 差异，使各组分在层 析两相中以不同程度 分配，借此将各组分 分离。
任何层析都有两相：固定相与流动相，两相互不相溶
固定相由层析介质组 流动相指在层析过程 成，它可以是固体物 中推动固定相上待分 质也可以是固定在固 离的物质朝着一定方 体物质上的液体物质。 向移动的液体或气体。 这些物质能与待分离 柱层析中的流动相一 的化合物进行可逆的 般称为洗脱剂。它也 吸附、溶解与交换作 是层析中的重要影响 用，对分离混合物起 因素之一。 着关键作用。
实验五层析实验
料离心管中备用。
C2分5B配%：层一物析本碘质〔醋在实p酸氨Ba钾相rt验it溶〔基ion液流是c移5动h滴r相o将，m换〕同a中tGo置反g的r4la浓0up响℃h度与y水〕，浴丙中然保酮温后3酸0分用在钟纸。肝层匀析浆法中检的查谷反-丙响转体氨系酶中的A作la的用生下成进。行 精0本1氨实m酸 验ol是以由/L，碱天于p性冬影H氨氨=谷7基酸响. 酸〔氨氨，Aspp酸I〕基=1和0、.移精氨丙换酸〔酮过Ar酸g程〕混在的合物肝观为匀例察，浆利，用中磺因酸可此型阳循在离子其反交换他响树代脂体〔谢国系产途中732径树添脂分加〕将解一二者和碘分别转醋从化混酸合，物(或中别离。 一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。 3 cm为宜，等干后，在1、2号原点上，再重复点一次(注意，不可调错)，然后分别点上谷氨酸、丙氨酸，作为对照，干后置层析缸中
【操作步骤】
1．层析薄板的制作： 称取硅胶G 2g置研钵中参加0.3%羧甲基纤维素8mL，研匀后迅速 倒在8 cm×12 cm玻片上，水平放置，使分布均匀，待其凝固后， 置100℃烘箱中烘干备用。 2．点样及展层： 分别用毛细玻管吸取各种脂质的标准液及试样，在薄板的一端1.5 cm高度处取间距为1 cm点样，待溶剂蒸发后置于盛有展开剂的标 本缸中，点样一端起点以下，浸入展开剂中。注意：点样处切勿浸 入展开剂中。
实验五层析实验
层析法又称色谱法〔Chromatography〕
是利用混合物中各组分理化性质〔如溶解度、极性、吸附力、亲和力、 电荷和分子量等〕的差异，将多组分混合物中的物质进行别离、分析 和纯化的一种技术
是利用混合物中各组分在两相〔固定相和流动相〕间进行分配。当流 动相携带混合物经过固定相时，即与固定相相互作用，由于各组分的 理化性质、分子结构等的不同，使得待别离物质与固定相的作用程度 存在着差异〔即不同组分具有不同的分配系数〕，不同组分在固定相 中的滞留时间不同，从而随流动相移动的速率也有所不同，最终到达 各组分彼此别离的目的。
C2分5B配%：层一物析本碘质〔醋在实p酸氨Ba钾相rt验it溶〔基ion液流是c移5动h滴r相o将，m换〕同a中tGo置反g的r4la浓0up响℃h度与y水〕，浴丙中然保酮温后3酸0分用在钟纸。肝层匀析浆法中检的查谷反-丙响转体氨系酶中的A作la的用生下成进。行 精0本1氨实m酸 验ol是以由/L，碱天于p性冬影H氨氨=谷7基酸响. 酸〔氨氨，Aspp酸I〕基=1和0、.移精氨丙换酸〔酮过Ar酸g程〕混在的合物肝观为匀例察，浆利，用中磺因酸可此型阳循在离子其反交换他响树代脂体〔谢国系产途中732径树添脂分加〕将解一二者和碘分别转醋从化混酸合，物(或中别离。 一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。 3 cm为宜，等干后，在1、2号原点上，再重复点一次(注意，不可调错)，然后分别点上谷氨酸、丙氨酸，作为对照，干后置层析缸中
【操作步骤】
1．层析薄板的制作： 称取硅胶G 2g置研钵中参加0.3%羧甲基纤维素8mL，研匀后迅速 倒在8 cm×12 cm玻片上，水平放置，使分布均匀，待其凝固后， 置100℃烘箱中烘干备用。 2．点样及展层： 分别用毛细玻管吸取各种脂质的标准液及试样，在薄板的一端1.5 cm高度处取间距为1 cm点样，待溶剂蒸发后置于盛有展开剂的标 本缸中，点样一端起点以下，浸入展开剂中。注意：点样处切勿浸 入展开剂中。
实验五层析实验
层析法又称色谱法〔Chromatography〕
是利用混合物中各组分理化性质〔如溶解度、极性、吸附力、亲和力、 电荷和分子量等〕的差异，将多组分混合物中的物质进行别离、分析 和纯化的一种技术
是利用混合物中各组分在两相〔固定相和流动相〕间进行分配。当流 动相携带混合物经过固定相时，即与固定相相互作用，由于各组分的 理化性质、分子结构等的不同，使得待别离物质与固定相的作用程度 存在着差异〔即不同组分具有不同的分配系数〕，不同组分在固定相 中的滞留时间不同，从而随流动相移动的速率也有所不同，最终到达 各组分彼此别离的目的。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
•Polymer beads composed of crosslinked dextran (dextrose) which is highly porous (like Swiss cheese)
凝胶层析的原理 b.蛋白质混合物上柱 c.样品上柱后，小分子进入凝胶微孔，大分子不能进入，故洗脱时大分子先洗脱 下来 d.小分子后洗脱下来
名称 吸附层析法 分配层析法 离子交换层析法 凝胶层析法 亲和层析法 分离原理 组份在吸附剂表面吸附固定相是固体 吸附剂，各能力不同 各组份在流动相和静止液相（固相） 中的分配系数不同 固定相是离子交换剂，各组份与离子 交换剂亲和力不同 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大 小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度 不同 固定相只能与一种待分离组份专一结 合，以此和无亲和力的其它组份分离
层析的特点
1、具有极高的分辨效力：能分离同系物、同分异 构体。 2、具有极高的分析效率：只需几十分钟，乃至几 分钟就可完成一个分析周期。 3、具有极高的灵敏度：样品组分含量仅数微克， 或不足一个微克都可进行很好的分析。 4、操作简便，应用广泛。 • 在现代生化制备技术中层析法占有核心地位。
按层析原理分类
葡聚糖(dextran)
3-氯-1,2-环氧丙烷 (Epichlorohydrin)
•Sephadex可以分成不同的型号,有G-10，G-15，G-25，G50，G-75，G-100，G-150，和G-200。 •交联度可用“吸水量”表示，如每克凝胶吸水量为2.5克即定 为G-25型。 • 吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。 数字越大， 排阻极限越大，分离范围也越大。
柱层析的主要操作步骤（续）
• 加样
– 加样量的多少直接影响分离的效果。一般说来，加样量尽 量少些，分离效果比较好。通常加样量体积应低于5%的床 体积。 – 洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。 – 流速太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开， 仍以混合组分流出。 – 流速太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效 果。 – 一般采用部分收集器收集分离纯化的样品。每管的收集量 不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相 近，可低至0.5ml / 管。 – 许多基质可反复使用多次，且价格昂贵，所以层析后要回 收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。
实验
血红蛋白与核黄素的
凝胶层析分离
三峡大学医学院 生化教研室
什么是层析？
• 层析法又称色层分析法或色谱法 （Chromatography），于19031906年由俄国植物学家M. Tswett首 先系统提出来。 • 他将叶绿素的石油醚溶液通过 CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗， 由于CaCO3对叶绿素中各种色素的 吸附能力不同，色素被逐渐分离， 在管柱中出现了不同颜色的谱带或 称色谱图（Chromatography）。
柱层析的主要操作步骤
• 介质的选择与处理 • 装柱
– 柱子装的质量好坏，是能否成功分离纯化物质 的关键步骤之一。 – 一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中 不能有气泡等。
• 平衡
– 柱子装好后，要用所需的缓冲液平衡柱子。 – 平衡液体积一般为3-5倍柱床体积，以保证平衡 后柱床体积稳定及基质充分平衡。
凝胶层析介质
• 交联葡聚糖，商品名为Sephadex，它是由 葡聚糖交联而成的多孔性网状结构的凝胶 颗粒 • 交联琼脂糖凝胶，如Sepharose-6B。 • 聚丙烯酰胺基葡聚糖凝胶，商品名 Sephacryl。
交联葡聚糖是葡聚糖与3－氯－1,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而 成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。
层析为何能把混合物分开？
• 在层析过程中，固定相位置固定不变，并阻止所 分离的组分向前移动；流动相相当于固定相作单 相运动，并带动所分离的组分向前移动。 • 由于混合物中各组分的理化性质的差异(吸附力、 溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和 力等)，各组分受到的推力和阻力不同，移动速度 不同，使混合物中的组分得以分离。
凝胶层析根据什么来分离混合物？
• 混合物中各种成分因分子大小不同而被分离的 技术 • 分子筛效应 – 大分子物质因其分子直径大于凝胶网孔而不 能进入凝胶颗粒内部，流程短而移动速度快， 先流出层析柱； – 小分子组份则由其分子直径小于网状结构的 孔径而进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速 度慢，后流出层析柱，
凝胶层析的特点及其应用
• 特点 – 操作条件温和，不会引起生物大分子的变性失活 – 一次装柱后凝胶可反复使用，每次洗脱过程即是 凝胶的再生过程 – 具有高度的重复性，回收样本几乎可达100%， 既可用于大样本制备，亦可用于小样品的分析 • 应用 – 脱盐；高分子溶液的浓缩 ；蛋白质分子量的测定； 生物大分子的分离提纯 • 缺点 – 样品浓度会发生数倍稀释；上样量较小，仅占柱 床体积2-5%。
• 洗脱
• 收集、鉴定及保存
• 再生
洗脱液储液 瓶（高位槽）
层析柱
记录仪
紫外检测仪
部分收集器
实验目的
1、掌握凝胶层析原理 2、熟悉凝胶层析柱的装柱、检查、上样、 洗脱与收集过程
试剂
1、葡聚糖凝胶：SephadexG-25 2、血红蛋白及核黄素 3、洗脱液：0.05M pH7.3磷酸缓冲液
注：Sephadex由于含有羟基基团，呈弱酸性，使它有可能 与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生 吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎 没有吸附作用。
为何需要固定相和流动相？
• 任何层析都有两相：固定相(stationary phase)与流动相 (mobile phase)，两相互不相溶。
• 固定相：是层胶，离子交换剂等），也 可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）
– 这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交 换等作用。对层析的效果起着关键的作用。 • 流动相： – 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向 移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。 – 柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。