生物化学实验5
生物化学实验 实验五 脂质的提取及薄层层析
2. 层析薄板的制备
称取3-4g的200目硅胶G，加 0.02mol/L NaAC 10ml-12ml，磨匀， 铺板，然后令其自然干燥，再放入 烘箱中，在 110℃活化30min，保存 于干燥器中备用。
3. 点样：在烘干活化的硅胶G板上，于距底部2cm
处，用毛细管点上蛋黄提取液，点样直径不要大于 3cm，然后用冷风吹干。
通常使用硅胶G。
流动相：展层剂，通常为有机溶剂。
2. 脂类的薄层层析
将提取的脂类混合液点在薄板上，由于样品 各组分的分子结构不同，吸附剂对其的吸附力不 同，当展层剂流过时，吸附力小的成分移动的快， 吸附力大的成分移动的慢，由此将各组分分开。
吸附力的强弱，受分子本身极性影响。极性 强的分子，容易被吸附，移动慢，Rf小，反之， 亦然。
4. 展层：展层缸中装展层剂约1cm深，将已点样的
硅胶板放入展层缸中，展层，至展层液前沿到达薄层 顶端约2cm处时，即可取出硅胶板，记下展层剂前沿 线，用热风吹干。
5. 显色：把硅胶板立即放入预先装置有数粒碘片的
干净层析缸中，密闭几分钟，已经展层分开的脂质成 分将分别吸附碘蒸汽而显黄色斑点。
五、实验结果及分析
3. 生物组织中脂类物质的提取
生物组织中含有多种脂质成分，包括三酰甘油， 胆固醇，脑磷脂和卵磷脂等，多与蛋白质合成疏松的 复合物，要将这类脂质提取出来并与蛋白质分离，所 用抽提液必须包含亲水性成分和 具有形成氢键的能力。
氯仿-甲醇混合液，就符合生物组织中脂质提取的要求。
生物组织脂质提取液，经过多次水洗，弃去含蛋 白质的水层，留下溶有脂质的氯仿层，所提取的脂类 即可以在铺有硅胶G的玻璃板上进行薄层层析。
1. 计算各斑点Rf值 2. 指出各斑点分别应为何种脂质？
生物化学实验5
4、谷丙转氨酶和谷草转氨酶在什么情况下发生异常变化 ？
它们的临床意义是什么？
实验原理：
1、转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内 氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶 催化，此酶催化氨基酸的α-氨基转移到另一 α-酮基上。各 种转氨酶的活性不同，其中肝脏的谷丙转氨酶 （Glutamic Pyruvic Transaminase ,GPT）活性较高，它 催化如下反应： α-酮戊二酸 + 丙氨酸 谷氨酸 + 丙酮酸 本实验以丙氨酸和 α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温 后，在肝细胞的谷丙转氨酶催化下产生丙氨酸，用纸层析 法检查谷氨酸的出现，以证明组织内的转氨基作用。
思考：
本实验层析过程中，哪一种氨基酸距离原点最远？为什么？ 谷氨酸（极性）和丙氨酸（非极性）是理化性质不同的两
种氨基酸，前者为亲水性，后者为疏水性氨基酸，据此二
者在固定相（水）与流动相（酚试剂）中的分配程度不同， 因而流速不同。 3、本实验用圆滤纸进行水平型层析，除待测液外，点加对 照液和标准液，层析后用茚三酮法显色，对此观察色斑， 判定结果。
（3）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取 同样滤纸一条（约1×2.5cm卷成捻如灯芯状 ,上端插入滤纸 中心孔中。 （4）把层析溶剂（酚 ：水= 4 ：1溶液）数ml放入干燥的直径 约5cm的表面皿内。把此皿放在直径10cm的培养皿中。 （5）把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入酚液中，盖 上培养皿盖。可见酚液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周 扩散。当酚液前缘到离滤纸边缘约 1cm时（约 30~50分钟）， 取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，并用吹风机吹干滤纸。
2、纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水 亲合力强，能吸收 20~22% 的水。而且其中 6~7% 的水是 以氢键形式与纤维素的羟基结合，在一般情况下很难脱去， 而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱。
生物化学实验教案(全)
生物化学实验―教案―目录实验一糖的颜色反应 (1)实验二糖的还原作用 (3)实验三多糖的实验 (4)实验四糖的旋光性和变旋现象 (5)实验五血糖的定量测定（葡萄糖氧化酶法） (7)实验六人血清中总胆固醇的测定 (8)实验七牛奶中粗脂肪含量的测定 (9)实验八牛奶中酪蛋白的提取 (11)实验九牛奶中酪蛋白含量的测定 (12)实验十氨基酸的纸层析 (14)实验十一醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 (16)实验十二蛋白质的颜色反应 (18)实验十三蛋白质的沉淀反应 (20)实验十四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量 (22)实验十五双缩脲法测定蛋白质浓度 (23)实验十六考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 (25)实验十七紫外光吸收法测定蛋白质浓度 (26)实验十八血清谷丙转氨酶的测定 (28)实验十九过氧化物酶的作用 (29)实验二十溶菌酶的提纯结晶 (30)实验二十一酵母RNA的提取 (31)实验二十二 RNA的定量测定（苔黑酚法） (32)实验二十三 DNA的提取及含量测定 (33)实验二十四荞麦中总黄酮的定性定量研究 (33)实验一糖的颜色反应[实验目的及要求]1. 掌握莫式（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。
2. 掌握塞式（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。
3. 掌握杜式(Tollen)试验鉴定酮糖的原理和方法。
[实验原理]1．莫式试验：糖经无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与а-萘酚生成紫红色缩合物。
2．塞式试验：酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕红色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。
3．杜式试验：戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质。
[实验仪器及用品]仪器：水浴锅。
器皿：吸管、试管。
实验药品：蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、а-萘酚、浓硫酸、95%乙醇、间苯二酚、盐酸、间苯三酚。
《生物化学实验》课程大纲
《生物化学实验》课程大纲一、课程概述课程名称（中文）：生物化学实验（英文）：Biochemistry Experiment课程编号：课程学分：1.0课程总学时：30课程性质：科类基础课前修课程：无机化学实验，有机化学实验二、课程内容简介（300字以内）生物化学是农学、畜牧学、生物学等各专业相关课程的重要基础课程，是一门实验性很强的学科，其生物化学实验课在生物化学教学中占据重要地位。
生物化学实验紧密围绕生物化学实验技术的教学需求，主要针对蛋白质、酶、核酸、脂类、糖、维生素等生物分子的分离、提取、分析、鉴定和定量测定技术等内容进行课程实验项目的设计和教学，加强学生对生物化学实验技术的学习，巩固和掌握生物化学实验技术的基本理论、基本知识、实验技能，提高学生创新思维意识、综合分析问题和科学实验的能力，鼓励学生将所学知识运用于实际工作中去。
三、教学目标与要求生物化学实验是农业院校重要的专业基础课程，是培养学生创新精神、实践能力的重要平台，是塑造高层次农业科技专门人才的基本环节之一。
通过该课程的学习后，学生能够掌握生物化学实验的基本原理和操作方法，能够独立进行实验并具有发现问题和解决问题的能力，能够根据实验记录，结合理论知识，合理地分析结果，并学习对实验中出现的问题进行讨论，提出解决方案或改进措施。
总的目标是提高学生综合分析能力，培养学生熟悉科学研究的基本程序和基本思维。
四、学时分配注：生物化学实验课程总计1学分，安排8次实验（不含选修），其中验证性实验占62.5%，综合性、设计性实验占37.5%。
五、教学内容与安排实验一：酶促转氨反应的分析鉴定(3学时)（一）实验目的：通过本实验掌握纸层析的一般原理和方法；掌握利用纸层析研究代谢的基本方法，了解酶促转氨反应在中间代谢中的意义。
（二）实验主要仪器：层析缸；培养皿；电吹风机；烘箱；恒温水浴锅；培养皿；毛细管；研钵；针、线。
（三）实验内容与方法：1. 提取材料的酶液；2. 用纸层析法鉴定酶促转氨反应中转氨基产物丙氨酸的存在与否；3. 通过计算其R f并与标准氨基酸对照，判断反应产物样品的氨基酸组成。
生物化学实验五——醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白 山东大学实验报告
实验五醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白13生物基地 201300140059 刘洋 2015-04-29同组者：张奕一、实验目的掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。
二、实验原理蛋白质是两性电解质。
在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。
血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。
血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。
由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。
也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。
肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。
肾病时α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。
肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。
三、实验器材1.醋酸纤维薄膜（2cm*8cm）2.人血清；3.烧杯及培养皿数只；4.点样器；5.镊子；6.玻璃棒；7.电吹风；8.恒温水浴锅；9.电泳槽；10.直流稳压电泳仪；11.剪刀四、实验试剂1.巴比妥-巴比妥钠缓冲液2.染色液（可重复使用，使用后回收）3.漂洗液（100ml每组）：95%乙醇45ml，冰醋酸5ml，水50ml4.透明液（20ml每组）：无水乙醇14ml，冰醋酸6ml5.健康人血清（新鲜，无溶血现象）五、实验步骤1.薄膜浸泡：提前将醋酸纤维薄膜浸泡30min以上；2.电泳仪检查：水平检查，电源检查；3.电泳槽的准备：在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液。
临床生物化学检验-第5章 常用分析技术
(affinity chromatography)
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离子交换层析 (ion exchange chromatography, IEC)：是依据各种离子或离子 化合物与固定相离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的方法。
色谱技术 ，发现了液-液即分配色谱法
固定相-
流动相-
20世纪60年代高效液相色谱，high performance liquid chromatography即HPLC
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1. 按流动相种类分类
气相层析
液相层析
超临界流体 层析 电层析
气体
液体
超临界流体 缓冲溶液、 电场
挥发性有机物
可以溶于水或 有机溶剂中的 各种物资
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高效液相层析法 (high performance liquid chromatography，HPLC)： 是在经 典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。 由于高效固定相填料颗粒小而 均匀（1.7~10μm） ，会引起高阻力（小颗粒具有高柱效），因此采用高压输液泵输送 流动相 ，可大大加快分析速度 ，故又称高压液相层析法。
临床应用：作为参考方法测定钙、镁定值或建立新常规方法作比较试验。 优点： 灵敏度高、选择性好、分析速度快。 缺点：需校准物、分析条件要求高、操作较复杂、测定每一种元素需特 定的空心阴极灯、有些反应的显色剂本身的颜色会影响测定的专一性。
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1. 校准曲线法：以校准物浓度（系列浓度）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线 ，在相同条件 下测定待测样品 ，然后在标准曲线上查找待测物质浓度。影响因素较多 ，每次需绘制新标准曲线。
实验5 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
生物化学实验之－－
实验五 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
山东师范大学生命科学学院
【实验目的】
了解丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 作用。
【实验原理】
由于丙二酸与琥珀酸结构相似，可以竞争性 地抑制琥珀酸脱氢酶对于琥珀酸的脱氢作用。 在生物体内，肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶， 能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸，同时放出大 量能量供肌体利用。
【思考题】
1. 为什么酶液的提取要在冰浴中进行？ 2. 各管中美蓝的褪色情况有何不同？为什么？
氧化型（蓝色）
【器材与试剂】
（一）器材 1. 恒温水浴锅 3. 研钵 5. 试管架 7. 漏斗 9. 脱脂棉 2. 手术剪 4. 试管 6. 刻度吸管 8. 小白鼠的肌肉 10. 吸水纸
（二）试剂 1. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4） 2. 0.02mol/L丙二酸钠溶液 3. 0.02mol/L琥珀酸钠溶液 4. 0.01%美蓝溶液 5. 生理盐水 6. 液体石蜡
—
1 2 5
1
— 2 5
—
1 2 5
3. 将各试管摇匀，倾斜试管，沿管壁滴加 液体石蜡5滴，盖在液面，以隔绝空气。置于 370C水浴中保温，随时观察各管中美蓝的褪色 情况，并记录时间，解释结果。
【要点提示】
1. 提取酶液需在冰浴中进行，以防酶失活。 2. 实验过程中，需快速加入试剂，摇匀后迅 速加入液体石蜡。 3. 加液体石蜡的目的是为了使反应液与空气 隔绝，因此加液体石蜡时需斜执试管，沿管壁 加入，不要产生气泡。 4. 加完液体石蜡后，在观察结果的过程中， 不要摇动试管，以免溶液与空气接触而使美蓝 重新氧化变蓝。
生物化学--实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳定量分析
实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳定量分析【目的要求】1.掌握血清蛋白电泳及其比色定量的基本原理、操作程序、技术要领和影响定量结果的主要因素及其排除2.熟悉血清蛋白醋纤膜电泳图谱的含义及临床意义。
3.了解血清蛋白醋纤膜电泳图谱的透明和扫描定量分析。
【实验原理】血清中各组分蛋白质的等电点均低于pH8.6，将其放在醋纤薄膜载体上，置于有pH8.6的电极缓冲液通过的电场中作电泳时都带负电荷、向正极移动。
由于它们等电点不同，荷电量不等，分子大小各异，在电场中移动速度不同而被彼此分离。
电泳膜经染色、漂洗后，便呈现出五条不连续的区带蛋白电泳图谱，从正极端起，依次为：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。
由于蛋白质含量与吸附的染料有一定正比关系，据此，剪下各条谱带，用碱液洗下蛋白质吸附的染料，进行比色分析，即可求出血清样品中各区带蛋白质的百分含量。
此外，也可对透明处理过的电泳图谱进行扫描分析，依据扫描曲线中各区带的面积与总面积之比，亦可求算出各区带蛋白质的百分含量。
【实验准备】一、器材1.电泳仪和醋酸纤维薄膜电泳槽2.醋酸纤维薄膜（8.0×2.0 cm）3.721分光光度计4.万用电表5.加样器、无损伤薄膜镊、铅笔、滤纸、染液缸、漂洗缸、载玻片等6.试管（10cc）及试管架二、试剂1.pH为8.6，离子强度0.06的巴比妥电极缓冲液称取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，加水溶解并定容至1000ml即成。
2.氨基黑10B染色液取氨基黑10B 0.5g溶于50ml甲醇中，再加入冰醋酸10ml，蒸馏水40ml。
3.漂洗液用95%乙醇45ml加冰醋酸5ml、蒸馏水50ml混匀，室温贮存。
4.0.4mol/L NaOH溶液5.透明液：A液：15ml冰醋酸+85ml 95%乙醇；B液：25 ml冰醋酸+75ml 95%乙醇。
【实验操作】一、电泳详细操作步骤及要求见Ⅰ-03常规电泳技术训练。
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生物化学实验讲义化学工程与技术学院基础部实验一酪蛋白的制备一、目的学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
二、原理．牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为 35g/L 。
酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7 。
利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH 调至4.7 时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。
三、器材1 、离心机2 、．抽滤装置3 、精密 pH 试纸或酸度计4 、电炉5 、烧杯6 、温度计．四、试剂与材料1 、牛奶 2500mL2 、 95 ％乙醇 1200mL3 、无水乙醚 1200mL4 、 0.2mol ／ L pH 4.7 醋酸—醋酸钠缓冲液 3000mL5 、．乙醇—乙醚混合液 2000mL五、操作1、将 100mL 牛奶加热至 40 ℃。
在搅拌下慢慢加入预热至 40 ℃、 pH 4.7 的醋酸缓冲液 100 mL 。
用精密 pH 试纸或酸度计调 pH 至 4.7 。
将上述悬浮液冷却至室温。
离心 15 分钟 (3 000r ／ min) 。
弃去清液，得酪蛋白粗制品。
2、用水洗沉淀 3 次，离心 10 分钟 (3000r ／ min) ，弃去上清液。
3、在沉淀中加入30mL 乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
用乙醇—乙醚混合液洗沉淀 2 次。
最后用乙醚洗沉淀 2 次，抽干。
4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。
5、准确称重，计算含量和得率。
含量：酪蛋白 g ／ 100mL 牛乳 (g ％ )得率：思考题1 、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？实验二小麦萌发前后淀粉酶活力的比较一、目的1. 学习分光光度计的原理和使用方法。
2. 学习测定淀粉酶活力的方法。
3 . 了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。
二、原理种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。
淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。
2 （ C 6 H 10 O 5 ） n +nH 2 O nC 12 H 22 O 11麦芽糖有还原性，能使 3 ， 5--- 二硝基水杨酸还原成棕色的 3- 氨基 -5- 硝基水扬酸。
后者可用分光光度计测定。
休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数增加而增加。
本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。
三、器材1.25mL 刻度试管2. 吸管3. 离心管4. 乳钵5. 分光光度计6. 恒温水浴7. 离心机四、试剂和材料1 、小麦种子2 、 o.1 ％标准麦芽糖溶液精确称量 100mg 麦芽糖，用少量水溶解后，移入 100mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度。
3.pH6.9 ， 0.02mol/L 磷酸缓冲液0.2mol/L 磷酸二氢钾 67.5mL 与 0.2mol/L 磷酸氢二钾 82.5 混合，稀释 10 倍。
4 、 1 ％淀粉溶液1g 可溶性淀粉溶于 100mL0.02mol/L 磷酸缓冲液中，其中含有 0.0067mol/L 氯化钠。
5 、 1 ％ 3 ， 5—二硝基水杨酸试剂将 1.00g3 ， 5—二硝基水扬酸溶于 20ml 2M L 1 NaOH 溶液和 50ml 水中，加入30g 酒石酸钾钠定容至 100ml 。
6 、 1 ％氯化钠溶液五、实验操作1 、种子发芽小麦种子浸泡 2.5 小时后，放入 25 ℃恒温箱内或在、室温下发芽。
2 、酶液提取取发芽第3 或第4 天的幼苗 15 株，放入乳钵内，加入 1% 氯化钠溶液 10mL ，用力磨碎。
在室温下放置 20 分钟，搅拌几次。
然后将提取液离心（ 1500r/min ） 6—7 分钟。
将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。
进行酶活力测定时，用缓冲液将发芽第 3 或第 4 天的幼苗稀释 10 倍。
取干燥种子 15 粒作对照（提取步骤同上）。
3 、酶活力测定（ 1 ）取 25mL 刻度试管 4 支，编号。
按下表要求加入各试剂（各试剂须在 25 ℃预热 10 分钟）试管标号试剂1 2 3 4干燥种子的酶提取液发芽第 3 或第 4 天的幼苗的酶提取液标准管空白管酶液（ mL ）0.5 0.5 ——标准麦芽糖溶液（ mL ）——0.5 —1 ％淀粉溶液（ mL ） 1 1 1 1 水（ mL ）———0.5将各管混匀，放在 25 ℃水浴中，保温 3 分钟后，立即向各管加入 1 ％ 3 ， 5—二硝基水杨酸溶液 2mL 。
（ 2 ）取出各试管，放入沸水浴加热 5 分钟。
冷却至室温，加水稀释至 25mL 。
并混匀。
在 A 500nm 处测定各管的吸光度。
填入表中试管号干燥种子的酶提取液发芽第 3 或第 4 天的幼苗的酶提取液标准管空白管A 500nm 吸光度4 、计算根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，本实验规定： 25 ℃时 3min 内水解淀粉释放 1mg 麦芽糖所需的酶量为 1 个酶活力单位（ u ）。
酶活力计算公式为：式中： C 酶酶液麦芽糖的浓度， V 酶提取酶液的总体积， n 酶酶液稀释倍数。
思考题1、为什么此酶提纯整个过程在 0—5 条件下进行？而测酶的活力时要在 25 预保温？反应后又放入沸水浴中？2、实验结果说明什么？实验三纸层析法分离鉴定氨基酸一、目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用 R f 值 ( 比移 ) 来表示的：…在一定的条件下某种物质的只 R f 值是常数。
R f 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
本实验利用纸层析法分离氨基酸。
三、器材1. 层析缸2. 毛细管3. 喷雾器4. 培养皿5. 层析滤纸 ( 新华一号 )四、试剂1 、扩展剂 650mL4 份水饱和的正丁醇和 1 份醋酸的混合物。
将 20mL 正丁醇和 5mL 冰醋酸放入分液漏斗中，与 15mL 水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。
取漏斗内的扩展剂约 5mL 置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。
2 、氨基酸溶液 0.5 ％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液 ( 各组份浓度均为 0.5 ％ ) 。
各 5mL3 、显色剂 50 ～ 100mL1. 1 ％水合茚三酮正丁醇溶液。
1. 将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
2. 取层析滤纸 ( 长 22cm 、宽 14 cm) 一张。
在纸的—端距边缘 2 ～ 3cm 处用用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔 2cm 作一记号如图。
3. 点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这 6 个位置上，干后再点一次。
每点在纸上扩散的直径最大不超过 3 mm 。
4. 扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。
将盛有约 20mL 扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中 ( 点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线 1cm) 。
待溶剂上升 15—20 cm 时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
5. 显色用喷雾器均匀喷上 O.1 ％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤 5 分钟(100 ℃ ) 或用热风吹干即可显出各层析斑点。
6. 计算各种氨基酸的只 R f 值。
思考题1 、何谓纸层析法 ?2 、何谓片 R f 值 ? 影响 R f 值的主要因素是什么 ?3 、怎样制备扩展剂 ?3、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？实验四酶的特性一、目的加深对酶的性质的认识。
二、内容本实验由温度对酶活力的影响； pH 对酶活力的影响；酶的激活剂及抑制剂；酶的专—性 4 组实验组成。
( 一 ) 温度对酶活力的影响酶的催化作用受温度的影响。
在最适温度下，酶的反应速度最高。
大多数动物酶的最适温度为 37-40 ℃，植物酶的最适温度为 50 ～ 60 ℃。
酶对温度的稳定性与其存在形式有关。
有些酶的干燥制剂，虽加热到 100 ℃，其活性井无明显改变，但在 100 ℃的溶液中却很快地完全失去活性。
低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。
2 、器材(1) 试管及试管架 (2) 恒温水浴 (3) 冰浴 (4) 沸水浴3 、试剂和材料(1)0.2 ％淀粉的 0.3 ％氯化钠溶液 150mL 需新鲜配制(2) 稀释 200 倍的唾液 50mL用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量筒并稀释 200 倍 ( 稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整 ) ，混匀备用。
(3) 碘化钾—碘溶液 50mL将碘化钾 20g 及碘 l0g 溶于 100mL 水中。
使用前稀释 10 倍。
4 、操作淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。
糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。
最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。
在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。
取 3 支试管，编号后按下表加入试剂：管号 1 2 3淀粉溶液 (mL) 1.5 1.5 1.5稀释唾液 (mL) 1 1 —煮拂过的稀释唾液 (mL) —— 1摇匀后，将 1 、 3 号两试管放入 37 ℃恒温水浴中， 2 号试管放人冰水中。
10 分钟后取出 ( 将 2 号管内液体分为两半 ) ，用碘化钾—碘溶液来检验 1 、 2 、 3 号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。
记录并解释结果，将 2 号管剩下的一半溶液放人 37 ℃水浴中继续保温 10 分钟后，再用碘液实验，结果如何 ?( 二 )pH 对酶活性的影响1 、原理酶的恬力受环境 pH 的影响极为显著。
不同酶的最适 pH 值不同。
本实验观察 pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适 pH 约为 6.8 。
2 ．器材(1) 试管及试管架 (2) 吸管 (3) 滴管 (4)50mL 锥形瓶 5) 恒温水浴 3 、试剂和材料(1) 新配制的溶于 0.3 ％氯化钠的 0.5 ％淀粉溶液 250 mL(2) 稀释 200 倍的新鲜唾液 100mL(3)0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 600mL(4)0.1 mol/L 柠檬酸溶液 400Ml(5) 碘化钾—碘溶液 50mL(6)pH 试纸 pH=5 、 pH=5.8 、 pH=6.8 、 pH=8 四种4 、操作取 4 个标有号码的 50mL 锥形瓶。
用吸管按下表添加 0.2mol ／ L 磷酸氢二钠溶液和 0.1 mol/L 柠檬酸溶液以制备 pH5.0 ～ 8.0 的 4 种缓冲液。
锥形瓶号码0.2mol ／ L 磷酸氢二钠0.1 mol/L 柠檬酸pH1 5.15 4.85 5.02 6.05 3.95 5.83 7.72 2.28 6.84 9.72 0.28 8.0从 4 个锥形瓶中各取缓冲液 3mL ，分别注入 4 支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加 0.5 ％淀粉溶液 2 mL 和稀释 200 倍的唾液 2mL 。