HIV抗体检测蛋白印迹实验记录2010
艾滋病抗体检测技术(免疫印迹法)及质量控制(黎俊宏)
实验蓝图
实验原始记录
结果的判定
首先要确定可见到标本质控带.如果标本质 控带是阴性,则检测无效;因为这表示技术上有 错误,如未加样本,酶结合物或底物液。
与强和/或弱阳性对照试剂膜对照,确定检测 试剂膜上每一条带的分子量。 按照试剂盒说明书判定标准，判断待测样 品为阳性、阴性或不确定。
试剂盒说明书
7.1.1 试剂盒内部对照 7.1.2 室内质控品 7.1.3 Levey-Jennings质控图 7.1.4 室内质控其他方式—“即刻法”质控
7.1.3 Levey-Jennings质控图
7.1.3.1 质控图参数 外部质控品的均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对外部质控 品重复测定的基础上。一般采用在不同批次检测取得至少20个数据； 如果仅做少量批次的检测，也至少做5个批次的检测，每个批次中不少 于4个质控血清测定结果，以建立一个临时性的均值和标准差，当达到 20批次数据后，替代临时性的均值和标准差。 （1）算术平均值（ ）：代表一组质控品测定S/CO值的均值。为了统计 学上有显著性意义，应该采用至少20次（天）测得的外部对照质控品 的S/CO值计算平均值。 （2）标准差（s）：是描述样品与均数之间离散程度的一个指标，是与 质控品S/CO值均值有关的预期范围。一组S/CO值的标准差以s表示。 （3）变异系数（cv）：是反映各次S/CO值相对于均值离散程度的一个 指标，可以用来衡量检测的重复性或精密度。 （4）控制限：由实验室根据对外部质控品检测结果的均值和标准差来 确定。例如，按照12S质控规则，控制限为外部质控品S/CO均值加减2 个标准差；按照13S质控规则，控制限为外部质控品S/CO均值加减3个 标准差。
HIV基因组
条带
ENV区 gp160:gp41的聚合体 gp120:外膜蛋白 gp41:跨膜蛋白 POL区 p66:逆转录酶 p51:逆转录酶 p31:核酸内切酶 GAG区 p55:前体蛋白 p39:p55的碎片 p24:核心蛋白 p17:核心蛋白 宽的扩散糖蛋白带 扩散糖蛋白带 扩散糖蛋白带 细窄条带 细窄条带 双重条带 细窄条带 细窄条带 宽阔条带 宽阔条带
(完整版)蛋白免疫印迹(westernblot)实验
蛋白免疫印迹（western blot）实验实验步骤：一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。
【晶莱生物】二、蛋白样品制备1.单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
蛋白质免疫印迹实验
蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。
对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。
经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。
然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。
蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。
所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。
如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。
即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。
转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。
第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。
HIV抗体检测试验原始记录（英科新创试剂）
HIV抗体检测试验原始记录（英科新创试剂）HIV抗体检测试验（ELISA法）原始记录编号:（张疾控）字（原始记录）第（）号第页共页试剂名称：（英科新创）试剂批号：试剂效期：样品状态：样品来源：送检人群：环境温度：检测仪器：1.北京普朗DNM-9602型酶酶标仪 2.北京普朗DNM-9620型洗板机3. 电热恒溫水浴箱4. 移液器检测地点：检测日期：检测份数：检测依据：《全国艾滋病检测技术规范》(2009年修订版)实验步骤：1．实验准备：样品、试剂、酶标条置室温（18-25℃），平衡时间_30_分钟。
按实验室SOP做好试剂准备。
2．温育期间配制洗涤液：按1：19稀释，取20×洗涤液 ml，加蒸馏水 ml。
（）3. 将酶联反应板从密封袋中取出，取下孔板条，放在板架上。
按顺序编号，设一个空白对照孔，两个阳性（1）对照孔，两个阳性（2）对照孔，两个阴性对照孔。
（）4．取阳性对照和阴性对照分别充分混匀后各50μl加入对照孔中，空白孔不加，其余每个孔加待检血清50μl，轻轻振荡，充分混匀。
并填写加样顺序表(见下表)。
（）5．用不干胶封片封盖反应板，置37℃温育60分钟。
（）6．撕去贴膜，用洗涤液洗5次（洗板机洗，程序已编好），然后在吸水纸上拍干。
（）7．除空白孔外每孔加酶标抗原100μl，用不干胶片封盖反应板。
37℃温育30分钟。
（）8. 撕去贴膜，用洗涤液洗5次（洗板机洗，程序已编好），然后在吸水纸上拍干。
（）9．每孔加显色剂A 50μl ，显色剂B 50μl，轻轻振荡后置37℃避光暗处显色30分钟。
（）10. 每孔加终止剂50μl。
混匀。
（）11．选择酶标仪450nm或630 nm双波长测定，空白孔调零点，测定各孔的吸光度。
并打印结果。
（）12. 加样顺序表：ABCDEFGH1314.判定公式：Cut off值=阴性对照平均值+0.10 当阴性对照平均值≤0.05时，按0.05计算。
本次检测临界值为：____________。
两种方法检测HIV抗体与免疫印迹法确诊结果分析
两种方法检测HIV抗体与免疫印迹法确诊结果分析发表时间：2016-02-16T15:23:32.783Z 来源：《中国耳鼻咽喉头颈外科》2015年12月第12期供稿作者：师毅杜娟花[导读] 延安大学附属医院检验科艾滋病（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒引起的一种严重的传染性疾病.（延安大学附属医院检验科，陕西，延安，716000）【摘要】目的通过调查医院就诊患者HIV抗体阳性情况，为医院院内感染与医护人员防护工作提供重要依据，分别用北京科美生物，北京万泰，采用化学发光法(CLIA)与胶体金法对2013年~2015年入院患者输血前HIV抗体筛查检测，筛查阳性标本送陕西省疾病控制中心用重组免疫印迹法（WB法）进行确诊，结果，化学发光法HIV筛查阳性标本85例，胶体金法筛查阳性标本47例，经重组免疫印迹法最终确证59例，CLIA法阳性符合率69.4%（59/85）胶体金法的阳性符合率79.6%（47/59），用CLIA法，样本测定值/临界值（S/CO）在1.1~5.0之间的标本13例，经WB法确证1例，不确定5例，S/CO在5.1~10.0之间的23例，确证9例，不确定4例，S/CO值在10.1~29.5的49例，则经过WB法确证49例，研究发现随着S/CO值的升高胶体金法的阳性率随之升高反之阳性率越低。
【关键词】 HIV 抗体 CLIA法胶体金法免疫印迹艾滋病（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒引起的一种严重的传染性疾病，该病毒是以性传播、血液传播和母婴传播为主要传播途径，病死率极高，是当前严重威胁人类生命和健康的重要疾病之一，早期发现诊断是有效预防的首要环节【1】，其病毒传播速度逐年递增【2】同时现在大部分AIDS患者都是由医院就诊初筛检出阳性，而这类患者日益增多，给医务工作者在接触患者时带来院内感染的风险日益增加，血清HIV抗体的实验室检测是诊断AIDS的主要依据，根据《全国艾滋病检测技术规范》要求，初筛检测呈阳性后，需要两种不同原理不同厂家生产的筛查试剂进行复检。
蛋白印迹实验报告
蛋白印迹实验报告篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验目的1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法；2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。
实验原理Western印迹法简称蛋白质印迹法。
蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。
试剂与器材试剂1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL；2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中；3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL；洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20；5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。
6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。
高压灭菌20 分钟，室温保存。
用前稀释至1x 。
7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。
器材电泳装置一套;2.电转移膜装置3.抗体-酶反应摇床操作方法〈一〉电转移1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。
2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。
在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。
蛋白质印迹法实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质印迹法的基本原理和操作步骤。
2. 学习如何利用蛋白质印迹法检测目标蛋白的表达水平。
3. 掌握蛋白质印迹法的实验操作技巧，为后续相关实验奠定基础。
二、实验原理蛋白质印迹法（Western Blot）是一种常用的蛋白质检测技术，通过特异性抗体与待测蛋白结合，实现对目标蛋白的高灵敏度和高特异性检测。
实验原理如下：1. 蛋白质提取：从组织、细胞或体液中提取总蛋白质，避免蛋白质的降解和失活。
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上。
4. 免疫反应：用特异性抗体与转移至固相载体上的目标蛋白结合，然后与酶或同位素标记的第二抗体发生反应。
5. 显色或放射自显影：通过底物显色或放射自显影等手段，实现对目标蛋白的检测和定量。
三、实验材料1. 细胞株：大鼠原代脊髓星形胶质细胞2. 主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清、裂解液、PBS、NaCl、SDS、聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜、PVDF膜、特异性抗体、酶联第二抗体、底物、显影液等。
3. 仪器：玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、-20低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床等。
四、实验步骤1. 细胞培养：将大鼠原代脊髓星形胶质细胞在DMEM/F12培养基和胎牛血清的条件下培养，直至达到实验所需状态。
2. 蛋白质提取：用裂解液提取细胞总蛋白质，并进行蛋白质浓度测定。
3. SDS-PAGE：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
4. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。
5. 免疫反应：将转膜后的膜与特异性抗体进行孵育，然后用酶联第二抗体进行孵育。
6. 显色：加入底物，观察目标蛋白条带的出现，并通过扫描成像系统进行定量分析。
蛋白质免疫印记技术实验报告
蛋白质免疫印迹技术曹学敏郭晓华谷中如古泽江河北大学生命科学学院2010生物技术河北保定071002摘要：目的：学习掌握动物抗血清的制备原理及技术，通过实际操作学会动物抗血清的制备，掌握Western－blotting的基本原理，熟悉Western－blotting的实验操作。
方法：，使用鸡卵类粘蛋白对小白鼠进行常规免疫，获得抗血清，然后利用Western－blotting 检测抗血清。
结果：纯化的鸡卵类粘蛋白能引起小鼠的免疫反应关键词：常规免疫抗血清免疫印记Abstract：objective：learn to master the theory and technology of preparing animals’ antiserum by operating the experiment in person ,learn to prepare the animals’antiserum , mastering the basic principles of Western－blotting, and being familiar with the experiment operation of Western－blotting. Methods : using chicken ovomucoid operating the routine immunization of laboratory rat, and obtain the antiserum, then detecting the antiserum through Western－blotting. Result: purified chicken ovomucoid can lead to the immunization of laboratory rat Keywords: routine immunization antiserum Western－blotting前言免疫印迹(Western blotting)是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学方法该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种常规技术，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
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HIV抗体检测蛋白印迹（WB）实验记录
一、检验目的：对初筛HIV抗体阳性的样品进行确认
二、试剂厂家：
三、试剂批号：效期：
四、样品来源：
五、检测日期：检测人：复核人：
实验室温度：℃实验室湿度： %
六、检测方法（快速）（过夜）：
七、实验步骤：
液ml，加入条带后每槽加2 ml工作洗液，室温置摇床孵
育5分钟。
3、按照实验用量将保存液ml，以倍稀释成工作液ml，
每ml加入克脱脂奶粉，共克脱脂奶配制成封闭液ml。
4、吸去孵育洗液。
5、每槽加入2 ml封闭液后加入待检样品μl，室温
孵育小时。
6、吸去封闭液，注意不要交叉污染。
每槽加入洗液2ml，置于摇床
洗5分钟，如此共洗3 遍。
7、按照实验用量用封闭液ml按：的比例稀释酶结合物
μL配成酶工作液ml。
8、每槽加入 2 ml酶工作液，室温置于摇床孵育0.5 小时。
9、洗涤步骤同步骤6。
10、每槽加入2 ml底物液，室温置于摇床显色15分钟。
11、用蒸馏水终止反应。
检测人：复核人：年月日。