麒麟菜中类菌孢素氨基酸(MAAs)提取工艺的优化研究
马齿苋中抗炎活性物质的提取、分离及结构鉴定
马齿苋中抗炎活性物质的提取、分离及结构鉴定张会敏1，邢岩2，仇润慷1，张丽梅2，倪贺3，赵雷1*（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）（2.国珍健康科技（北京）有限公司，北京 100000)（3.华南师范大学生命科学学院，广东广州 510640）摘要：以活性物质示踪为导向，建立脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型对马齿苋中的抗炎物质进行跟踪，采用柱层析提取法、硅胶柱色谱分离法、制备液相色谱法及气相色谱-质谱联用技术对抗炎物质进行提取分离和结构鉴定。
结果表明，石油醚-乙醇、无水乙醇和纯水溶剂依次对马齿苋样品进行提取，三种粗提物将细胞中一氧化氮（Nitric Oxide，NO）的分泌量分别减少至33.13、25.83和20.53 μmol/L，其中石油醚相粗提物的抑制效果最强（P<0.05）。
对石油醚相进一步分离得到四个组分，Fr.1、Fr.2和Fr.3组分具有较强的抗炎效果，但Fr.1和Fr.2组分含有潜在的毒性成分，选择Fr.3组分继续分离。
Fr.3组分经硅胶柱分离得到三个组分，Fr.3.1组分表现出最强的抑制NO的分泌量效果（11.80 μmol/L）。
经制备液相色谱进一步纯化及气质分析，确定Fr.3.1组分的主要成分为硬脂酸（47.09%）、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯（13.21%）和其他成分。
该研究建立了一种从马齿苋中分离纯化出抗炎物质方法，为马齿苋的开发利用提供理论参考。
关键词：马齿苋；抗炎活性；提取分离；鉴定文章编号：1673-9078(2024)03-191-199 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2024.3.0324Extraction, Separation and Structural Identification of Anti-inflammatory Active Substances from Purslane (Portulaca oleracea L.)ZHANG Huimin1, XING Y an2, QIU Runkang1, ZHAGN Limei2, NI He3, ZHAO Lei1*(1.College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)(2.Guozhen Health Technology (Beijing) Co. Ltd., Beijing 100000, China)(3.College of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510640, China)Abstract: To track the anti-inflammatory substances in purslane, the lipopolysaccharide-induced RAW264.7 macrophage inflammation model was established, which was guided by the tracer of active substances. The extraction, separation and structural identification of anti-inflammatory substances in purslane were performed by column chromatography (for extraction), silica gel column chromatography (for separation), and preparative high performance liquid chromatography and gas chromatography-mass spectrometry (for analyses). The results showed that the three crude extracts obtained from purslane through sequential extractions with petroleum ether-ethanol, anhydrous ethanol and pure引文格式：张会敏,邢岩,仇润慷,等.马齿苋中抗炎活性物质的提取、分离及结构鉴定[J] .现代食品科技,2024,40(3):191-199.ZHANG Huimin, XING Yan, QIU Runkang, et al. Extraction, separation and structural identification of anti-inflammatory active substances from purslane (Portulaca oleracea L.) [J] . Modern Food Science and Technology, 2024, 40(3): 191-199.收稿日期：2023-03-16基金项目：国家自然科学基金资助项目（31771980）；广东省自然科学基金（2023A1515012599）作者简介：张会敏（1996-），女，硕士研究生，研究方向：活性物质分离提取，E-mail：；共同第一作者：邢岩（1981-），女，博士，助理研究员，研究方向：抗氧化与抗衰老，E-mail：通讯作者：赵雷（1982-），男，博士，教授，研究方向：天然产物绿色修饰及热带水果加工，E-mail：191water solvents reduced the secretion of nitric oxide (NO) in the cells to 33.13, 25.83 and 20.53 μmol/L, respectively, with the crude petroleum ether extract exhibiting the strongest inhibitory effect (P<0.05). The petroleum ether phase was further separated into four fractions, with the Fr.1, Fr.2 and Fr.3 fractions had stronger anti-inflammatory effects, though the Fr.1 and Fr.2 fractions contained potential toxic components. Therefore, the Fr.3 fraction was selected for further separation. The Fr.3 fraction was separated through a silica gel column to obtain three fractions. The Fr.3.1 subfraction exhibited the strongest inhibitory effect against the NO secretion (11.80 μmol/L). The Fr.3.1 subfraction was further purified by the preparative liquid chromatography and GC-MS analysis, and the main components of the Fr.3.1 subfraction were identified as stearic acid (47.09%), di(2-ethylhexyl)phthalate (13.21%) and other components. This study established a method for separating and purifying anti-inflammatory substances from purslane, and provides a theoretical reference for the development and utilization of purslane.Key words: Portulaca oleracea L.; anti-inflammatory activity; extraction and isolation; identification炎症是机体受到外部刺激时做出的一种保护性生理反应，能够及时清除体内受损或死亡的细胞，帮助机体恢复内部平衡[1] 。
【doc】枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验
枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验吴俊罡张秉胜刘吉华秦贵江王梅雪张红霞庚涛(大连翔大生物技术研究中心有限公司)摘要本文从生产实际出发,针对生产用菌种,通过对培养基碳源,氮源等的选择及配比的正交实验,得出最适培养基.关键词:枯草芽孢杆菌芽孢率活菌数培养基前言枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一.其已被越来越多地研制成饲用微生态制剂.因其制剂是无毒,无残留,无污染的"绿色"添加剂,故具有广阔的发展前景,并已在畜牧业,饲料行业广泛应用,显示了巨大的社会效益和生态效益.枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶,脂肪酶,淀粉酶等活性,能产生抗菌素,在动物肠道内具有较强生物夺氧能力.这些特性对促进动物营养的消化吸收,提高动物的饲料转化率和防病促进生长起到重要作用.现阶段的工业化生产中,常存在着发酵周期长,芽孢形成率低,成本高等问题,对此我们对发酵培养基进行了优化实验,以提高枯草芽孢杆菌的产量并降低生产成本.材料与方法材料菌种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),翔大生物技术研究中心有限公司保存.主要试剂牛肉膏,蛋白胨,氯化钠,葡萄糖,淀粉,硫酸锰,葡萄糖等.主要设备P270普通摇床,303AB一3隔水式培养箱,1600倍微生物显微镜,PHS一25G型酸度计,50升高级发酵罐,电热干燥箱等.检测方法活菌计数采用平皿活菌计数法,芽孢率采用芽孢染色后显微镜下计数比较.检测培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,葡萄糖1%,氯化钠0.5%,琼脂2%菌种处理安培管菌种活化:用无菌吸管吸取0.3--0.5毫升无菌水滴入安培管,轻轻震荡使冻干菌体溶解成悬浮状,取0.1--0.2毫升菌悬液涂于上肉汤培养基平皿上,37℃培养36小时.菌种筛选:挑取少许活化后菌落划线于促芽孢形成培养基(土壤浸出液1000毫升,牛肉膏6可克, 蛋白胨5克,琼脂20克,pH7.0～7.2)平皿上,37℃培养20小时左右取出,选大菌落挑到装有4.5毫升无菌水的试管中,震荡均匀后置120oC干燥箱中加热20分钟,再涂布于促芽孢形成培养基的平皿上培养,反复多次.最后选取平皿上的大菌落转接到促芽孢培养基的试管斜面上,37℃培养箱培养l3～15 小时拿出放入4~C冰箱保存备用.筛选前后种子作对比:从冰箱中拿出筛选前后的种子斜面各1支,分别接入装有肉汤培养基的三角瓶中,在37℃,每分钟195转的摇床上振动培养,每3小时涂片观察一次,培养36小时记录活菌数和芽孢率. 此过程重复3次.培养基选择首先选择四种不同培养基进行摇瓶培养比较,观察菌数和芽孢形成情况.培养基的配制:①号培养基:淀粉0.15%+葡萄糖0.5%+尿素0.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%+碳酸钙0.01%+大豆粕1%;②号培养基:淀粉0.15%+葡萄糖0.5%+尿素0.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%国外畜牧学——猪与禽第23卷第3期2003年5月?31'+碳酸钙0.01%+大豆粕1%+淀粉0.3%+3.08%浓度的硫酸锰溶液0.1%.③号培养基:牛肉膏0.3%+蛋白胨1%+葡萄糖1%+氯化钠0.5%;④号培养基:牛肉膏0.3%+蛋白胨1%+葡萄糖1%+氯化钠0.5%+淀粉0.3%+3.08%浓度的硫酸锰溶液0.1%;以上所有各种培养基的pH均调为7.0～7.2.以上每种培基各做三瓶,装液量100毫升/500毫升三角瓶,用四层纱布和牛皮纸包扎置立式压力蒸汽消毒器中于121℃灭菌20分钟,取出备用.摇瓶种子制备:将在冰箱保存的种子在无菌室内接入肉汤培养基中,在37℃,每分钟195转的摇床上振荡培养12小时.接种和培养:培养好的种子液以10%接种量分别接入四种不同培养基中37℃振荡培养,每隔12小时检测一次,36小时结束培养.此过程重复3 次.正交实验:我们将上述摇瓶结果相对较好的②号培养基作为基本培养基,设计了四个因素,三个水平的正交实验,以进一步优化培养基配比(培养36 小时测活菌数).正交实验设计见表1(所用培养基中其它营养成分不变).表1正交实验设计简表发酵罐实验以摇床正交实验得出的最佳培养基进行50升发酵罐培养,并与肉汤培养基进行对比.发酵罐培养的有关条件如下:定容30升,加消泡剂3‰,用NaOH溶液调pH值到7.5～8.0(注:因为灭菌后pH约下降0.5～1.0),培养121'112灭菌20分钟,培养温度37'112,搅拌转速200转/分钟,起始气流量比1:0.5.当芽孢率达到80%以上时,发酵结束.此实验重复两次.结果和讨论菌种处理结果从菌种优化的三次结果看:经优化后在相同的培养时间内(36小时)芽孢形成率由原先的约38% 提高到约96%,活菌数也由17.7亿/毫升提高到28.6亿/毫升.菌种处理结果见图1.处理前芽孢形成率(%)菌种处理结果处理后臼活菌数(亿/毫升)摇床实验的结果摇床实验所确定的四种培养配方依据是:①号培养基为普遍应用于培养细菌的培养基配方,③号培养基为经验配方,②号和④号培养基配方是在①,③号培养基的基础上分别添加0.3%的淀粉和添加30.8ppm浓度的硫酸锰而成.通过本试验证明锰离子,淀粉对芽孢形成有促进作用.②号培养基配比要明显优于其它三种培养基配比,培养到36小时芽孢率可达到95%以上,活菌数可达到27亿/毫升,故我们选择②号培养基作为基本培养基进行正交实验.摇床实验的结果见表2.表2摇床实验的结果培养基和检测项目培养时间(小时)122436培养基①芽孢率(%)活菌数(亿魔升)培养基②芽孢率(%)活菌数(亿魔升)培养基③芽孢率(%)活菌数(亿魔升)培养基④芽孢率(%)活菌数(亿魔升)个别芽孢约40约8026.2518.615.4个别芽孢约50约10027.1528.4526.2个别芽孢约50约8015.7519.112.25个别芽孢个别芽孢约2514.3619.2511.75正交实验结果表3显示了正交实验的结果.由表可见,影响因素为:MnSO4>豆粕>淀粉>葡萄糖;适宜条件为:葡萄糖1.5%,淀粉0.2%,豆粕3%,Mn-SO40.1%,磷酸氢二钾0.3%,磷酸二氢钾0.15%,.32.国外畜牧学——猪与禽第23卷第3期2003年5月∞∞∞∞加0目硫酸镁0.05%,酵母膏0.02%,氯化铁0.01%,碳酸钙0.01%.表3正交实验的结果发酵罐实验结果以摇床正交实验得出的最佳培养基进行50升发酵罐培养,与肉汤培养基培养的两次比较实验,结果基本稳定.采用优化培养基的培养结果比肉汤培养基有很大提高,主要体现在:①发酵周期缩短了24～26小时,在发酵生产中降低了能耗,且可提高年产量;②最终活菌数提高了约54.7%.芽孢形成比率高,菌体死亡率较优化前低24.7%.图2显示了两种培养基两次培养结果的对比.结论适合该菌株发酵的培养基配比为:葡萄糖1.5%,淀粉0.2%,豆粕3%,MnS040.1%,磷酸氢二钾0.3%,磷酸二氢钾0.15%,硫酸镁0.05%,酵母膏0.02%,氯化铁0.01%,碳酸钙0.01%.(参考文献7篇略)一◆l:了||I::||l:||.一-.一一./'一■——一一'———◆..-,一t一▲v..一.一二'.一一一.～.?:::!::,6l014182226303438424648培养时间,时)注:芽孢率1,活茵数1,芽孢率2,活茵数2代表两次肉汤培养基配方发酵培养结果;芽孢率3,活茵数3,芽孢率4,活茵数4代表优化的培养基配方发酵培养结果.图2两种培养基培养结果的对比代邮:257000鲁东营IZl区河滨路东营力大王农畜产公司于勇510000广州天河广汕路高唐科技产业园廖益平我们已将你们买的书寄出,但被邮局退回了,原因是"原写地址不详",希望你们见此通知后速与《国外畜牧学——猪与禽》编辑部联系.谢谢!国外畜牧学——猪与禽第23卷第3期2003年5月?33?∞舳∞∞∞∞加m0晕。
液相色谱-质谱联用技术分析秦巴硒菇提取物活性成分及其治疗慢性粒细胞白血病的网络药理学研究
网络出版时间：２０２４－０１－１０１０：５８：４０ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２４０１０８．１８３１．０３８◇网络药理学◇液相色谱－质谱联用技术分析秦巴硒菇提取物活性成分及其治疗慢性粒细胞白血病的网络药理学研究王东萍１，４，葛万文２，邵 晶３，孙延庆１，４（１．甘肃中医药大学中西医结合学院，甘肃兰州 ７３００００；２．兰州大学第二医院，甘肃兰州 ７３００３０；３．甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州 ７３００００；４．甘肃省人民医院，甘肃兰州 ７３００００）收稿日期：２０２３－０９－２０，修回日期：２０２３－１１－２１基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８１５６０６７０）；甘肃省自然科学基金资助项目（Ｎｏ２０ＪＲ１０ＲＡ３７６，２１ＪＲ１１ＲＡ１９６）；甘肃省人民医院国家级科研项目培育计划（１９ＳＹＰＹＢ １７）；兰州市科技发展指导性计划项目（Ｎｏ２０２０ ＺＤ ５６）作者简介：王东萍（１９８６－），女，硕士，研究方向：中西医结合血液病，肿瘤药理学，Ｅ ｍａｉｌ：ｗａｎｇｄｐ０８３１＠ｇｓｚｙ．ｅｄｕ．ｃｎ；孙延庆（１９６４－），男，博士，教授，主任医师，博士生导师，研究方向：中西医结合血液病，肿瘤药理学，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：４０ｙａｎｑｉｎｇｆａｎｇ＠ｇｓｚｙ．ｅｄｕ．ｃｎｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０３０２８文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２４）０１－０１３９－０７中国图书分类号：Ｒ２５８ ５；Ｒ３１９；Ｒ４４６ ９；Ｒ７３３ ７摘要：目的 利用液相色谱质谱联用和网络药理学、分子对接技术探讨秦巴硒菇提取物治疗慢性粒细胞白血病（ｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ，ＣＭＬ）的潜在活性靶点及相关信号通路，并通过体外实验进一步验证。
方法 应用液相色谱质谱分析秦巴硒菇提取物的活性成分，通过ＳｗｉｓｓＴａｒｇｅｔＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ数据库预测药物靶点；从ＧｅｎｅＣａｒｄｓ、ＤｉｓＧｅＮＥＴ数据库获取ＣＭＬ的疾病靶点。
海藻活性物质研究概况及抗辐射研究进展
者消化道内消化酶结合降低其消化能力。目前的研究
对褐藻多酚抗肿瘤活性、抗菌、抗病毒活性、抗氧化活 性、化学防御活性、除臭活性研究较多。
１．５
类菌胞素氨基酸类（ＭＡＡｓ）化合物由于共轭双键
和不同侧链上活性基团的存在，在３１０－３６０ Ｂｉｎ的紫外 光区具有强的吸收能力。由于ＭＡＡｓ对紫外光（Ｕｖ—Ａ 和ＵＶ—Ｂ）具有很高的摩尔吸收率（￡＝２８
防护作用，海带多糖各组能显著调节辐射损伤大鼠的免
疫功能，脾淋巴细胞凋亡率显著低于模型组，并呈明显
的量效关系；海藻多糖怛卜圳对１．射线照射小鼠骨髓、腹
腔巨噬细胞等放射性急性损伤的保护作用，实验结果显 示海藻多糖对辐射所致的免疫功能损伤有明显的保护
作用；琼枝麒麟菜多糖【抛刊对＾ｙ一射线照射小鼠胸腺细
胞、小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾细胞的影响，同样显示其 对辐射损伤具有一定的保护作用。它们的抗辐射作用 的机理可能与以下几个方面有关：首先，多糖是细胞膜
１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８－９９２６．２０１０．０２．０２６
随着核能广泛应用于科技、生产及日常生活，不可 避免地会给人们造成辐射损害。临床上对癌症患者进 行的放疗、职业性受照人员的辐射性损害和航天飞行中 人员受到的空间辐射等受到高度重视。人们一直在探 索有效的防治辐射药物。目前已知的一些具有防治辐 射作用的药物，多数毒性较大，因此，期待开发出毒性较 小、可用于临床的新药。目前国内外海洋生物活性物质 的研究有了长足的进步。许多国家均不同程度地开展 了海洋生物活性物质抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗心脑血 管疾病、抗炎、抗艾滋病以及提高机体免疫功能等方面 的研究，已经发现了大量具有上述作用的具有新颖结构 的化学成分。海藻（Ａｌｇａｅ）是海洋中的低等隐花植 物，全世界约有三万余种，而已被人类广为利用的海藻 主要是褐藻、红藻、绿藻和蓝藻。现在的研究显示藻类 植物含有多种具有抗辐射活性的物质。 １海藻活性物质 通过对海洋生物有效化学成分研究，特别是在 对海藻类植物的研究中找到了许多具有重要生物活 性和药用前景的有机化合物，如：多糖类、蛋白类、萜 类、多酚类、甾醇类、环状多硫化合物、大环内酯类、 微量元素等，成为新型药物研究的重点。
210905796_生物有机肥替代部分化肥对甘蓝生长及产量的影响
宁夏农林科技，Ningxia Journal of Agri.and Fores.Sci.&Tech.2022，63（09）：25-27生物有机肥替代部分化肥对甘蓝生长及产量的影响郭子军，吕海龙*，王姣敏，魏镛频，张旦，谢淑琴，曹力强定西市农业科学研究院，甘肃定西743000摘要：为降低化肥过量施用造成资源浪费和环境污染，提高肥料利用效率，筛选出适宜当地甘蓝栽培的生物有机肥种类，开展3种生物有机肥替代部分化肥试验，探究生物有机肥配施适宜的化肥对甘蓝的生长和产量的影响。
结果表明，氮肥施用量减少30%，配施75kg/hm2中农绿康绿地康生物冲施肥的处理（T8）效果最优，产量较不施肥和农户常规施肥分别增加77.75%、47.92%，适宜在当地甘蓝种植中推广使用。
关键词：甘蓝；生物有机肥；化肥减施中图分类号：S635文献标识码：A文章编号：1002-204X（2022）09-0025-03 doi:10.3969/j.issn.1002-204x.2022.09.008Effects of Bio-Organic Fertilizers Substituting Partial Chemical Fertilizerson the Growth and Yield of CabbageGuo Zijun,Lyu Hailong*,Wang Jiaomin,Wei Yongpin,Zhang Dan,Xie Shuqin,Cao Liqiang (Dingxi Academy of Agricultural Sciences,Dingxi,Gansu743000)Abstract In order to reduce the waste of resources and environmental pollution caused by excessive application of chemical fertilizers,improve the use efficiency,and screen out the suitable types of bio-organic fertilizers for local cabbage cultivation,the experiments were carried out to use three kinds of bio-organic fertilizers to replace part of the chemical fertilizers,in order to study the effects of suitable application of bio-organic fertilizers on growth and yield of cabbage.The results showed that the application of70%nitrogen fertilizer and 75kg/hm2water soluble fertilizer(Sino Green Agri-Biotech T8)could achieve the optimal yield,increasing by 77.75%and47.92%respectively,compared with no fertilization and conventional fertilization,which could be applied in the planting of local cabbage.Key words Cabbage;Bio-organic fertilizer;Chemical fertilizer reduction甘蓝（Brassica oleracea L.var.Capitata L.），是十字花科芸薹属植物，学名结球甘蓝，又名洋白菜、包菜、卷心菜等，起源于地中海沿岸[1]。
国家级大学生创新创业训练计划
刘汉兰
20000
项目编号
项目名称
项目类型
项目负责
人姓名
指导教
师姓名
项目经费
（元）
201610504079
Bi/rGO/Bi2WO6三元复合材料的合成及光催化
性能研究
创新训练项目
刘文成
瞿阳
20000
201610504080
多孔金棒的生物模板合成方法研究
创新训练项目
梁晨楠
鲁哲学
20000
201610504081
20000
201610504050
白斑病毒分子蛋白A的分子研究
创新训练项目
李卓聪
兰江风
20000
201610504051
团头鲂颗粒溶素NK-lysin的生物学活性研究
创新训练项目
黄浩
袁改玲
20000
201610504052
光照和温度对蚤状溞生殖转化的诱导作用研究
创新训练项目
刘思甜
刘香江
20000
201610504053
创新训练项目
耿佩赟
பைடு நூலகம்刘睿
15000
201610504076
基于矩阵理论的亏损系统灵敏度模型
创新训练项目
黄文琳
沈婧芳
15000
201610504077
后基因组时代农药一基因相互作用数据库构建
创新训练项目
徐芳婷
位灯国，
郑芳
20000
201610504078
醚基离子液体的制备及其对纤维素溶解性能的
研究
创新训练项目
刘灵芝
20000
201610504090
大学生参与和使用众筹创业意愿及其影响因素 研究
一种新型磷酰胺吗啉代寡鸟苷酸单体的合成及工艺优化
收稿日期:２０２３Ｇ０９Ｇ１５.基金项目:国家自然科学基金资助项目(２１８６３００６);江西省教育厅科学技术研究项目(G J J ２０８９０３);抚州市科技指导项目(２０２２０９０６).作者简介:欧阳红霞(１９８３ ),女,讲师.㊀∗通信作者:李亮荣(１９８６ ),男,副教授.E Ｇm a i l :n c u r o n g＠１６３．c o m .欧阳红霞,杨小喆,李海峰,等．一种新型磷酰胺吗啉代寡鸟苷酸单体的合成及工艺优化[J ]．南昌大学学报(理科版),２０２４,４８(１):７１Ｇ７６．O U Y A N G H X ,Y A N G XZ ,L IH F ,e t a l ．S y n t h e s i s a n d p r o c e s s o p t i m i z a t i o n f o r an o v e l p h o s p h o r o d i a m i d a t em o r p h o l i n o gu a Ｇn y l i cm o n o m e r [J ]．J o u r n a l o fN a n c h a n g U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e ),２０２４,４８(１):７１Ｇ７６．一种新型磷酰胺吗啉代寡鸟苷酸单体的合成及工艺优化欧阳红霞１,３,杨小喆１,李海峰２,丁永红１,李亮荣１,３∗(１．南昌大学抚州医学院,江西抚州３４４０００;２．江西省肿瘤医院核医学,江西南昌３３００２９;３．抚州市A I 药物技术创新中心,江西抚州３４４０００)㊀㊀摘要:发展了一种以鸟苷为原料的新型磷酰胺吗啉代寡鸟苷酸单体的合成路线.在对碱基上氨基和核糖５＇位羟基进行保护的基础上,将核糖环转变为吗啉环,得到保护的吗啉代鸟苷.在吗啉环上进行三苯甲基化反应,并利用M i t s u n o b u 反应对嘌呤６ＧO 位进行修饰;对脱保护后的羟基进行N ,N Ｇ二甲基氨基磷酰化反应,合成得到目标产物.对M i t s u n o b u 反应和磷酰化反应的条件进行了优化.在优化的条件下,新合成路线的总产率为１４．１％.通过L C ＧM S ㊁１H NM R 和３１PNM R 等技术手段对中间产物和目标产物进行了结构表征.关键词:合成;鸟苷;吗啉代寡鸟苷酸;M i t s u n o b u 反应;磷酰化反应中图分类号:O ６２４．６㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:１００６Ｇ０４６４(２０２４)０１Ｇ００７１Ｇ０６S y n t h e s i s a n d p r o c e s s o p t i m i z a t i o n f o r an o v e l p h o s ph o r o d i a m i d a t e m o r p h o l i n o g u a n yl i cm o n o m e r O U Y A N G H o n g x i a １,３,Y A N G X i a o z h e １,L IH a i f e n g ２,D I N G Y o n g h o n g １,L IL i a n g r o n g１,３∗(１．F u z h o u M e d i c a l C o l l e g e o fN a n c h a n g U n i v e r s i t y ,F u z h o u J i a n gx i ３４４０００,C h i n a ;２．D e p a r t m e n t o fN u c l e a rM e d i c i n e ,J i a n g x i C a n c e rH o s p i t a l ,N a n c h a n g ３３００２９,C h i n a ;３．F u z h o u I n n o v a t i o nC e n t e r f o rA ID r u g ,F u z h o u M e d i c a l C o l l e g e o fN a n C h a n g U n i v e r s i t y ,F u z h o u J i a n gx i ３４４０００,C h i n a )A b s t r a c t :As y n t h e s i s r o u t e o f a n o v e l p h o s p h o r a m i d em o r p h o l i n o l i n e Ｇo l i g o g u a n y l a t em o n o m e r u s i n ggu a n o s i n e a s r a w m a Ｇt e r i a lw a s d e v e l o p e d ．B a s e d o n t h e p r o t e c t i o n o f t h e a m i n o g r o u p o n t h e b a s e a n d ５＇ＧOHi n r i b o s e ,t h e r i b o s e r i n g i s c o n v e r t e d i n Ｇt oam o r p h o l i n e r i n g t o o b t a i n t h e p r o t e c t e dm o r p h o l i n e g u a n o s i n e ．At r i p h e n y l m e t h y l a t i o n r e a c t i o nw a s c a r r i e d o u t o n t h em o r Ｇp h o l i n e r i n g a n d p u r i n e ６ＧO p o s i t i o nw a sm o d i f i e du s i n g t h eM i t s u n o b u r e a c t i o n ．N ,N Ｇd i m e t h y l a m i n o p h o s p h o r yl a t i o n r e a c t i o n i s p e r f o r m e do n t h e d e p r o t e c t e dh y d r o x y l g r o u p t o s y n t h e s i z e t h e t a r g e t p r o d u c t ．I n t h i s s t u d y ,t h e c o n d i t i o n s o f t h eM i t s u n o b u r e Ｇa c t i o na n d p h o s p h o r y l a t i o n r e a c t i o nw e r e o p t i m i z e d ．U n d e r o p t i m i z e dc o n d i t i o n s ,t h e t o t a l y i e l do f t h en e ws yn t h e t i c r o u t ew a s １４．１％．T h e s t r u c t u r e o f i n t e r m e d i a t e p r o d u c t s a n d t a r g e t p r o d u c t sw e r e c h a r a c t e r i z e db y LC ＧM S ,１H NM Ra n d ３１PNM R．K e yw o r d s :s y n t h e s i s ,g u a n o s i n e ,m o r p h o l i n o Ｇo l i g o g u a n y l a t e ,m i t s u n o b u r e a c t i o n ,p h o s p h o r y l a t i o n r e a c t i o n ㊀㊀当前,现代药物研究的焦点之一是开发能够修正致病基因的治疗技术.这些技术可以在体内靶向关闭具有缺陷或突变的基因或m R N A ,或者有效地修复基因或补充m R N A 以产生类似功能的蛋白质,从而治疗包括遗传性疾病在内的各种疾病.通过分子生物技术,合成的核酸药物可以实现对R N A 的关闭㊁补充或修改,展现出潜在的治疗潜力,这一趋势在临床应用中逐渐显现[１,２].为了改善核酸药物的药理活性,对天然寡核苷酸的磷酸二酯键㊁碱基或核糖等进行化学修饰,成为当前药物化学研究的重要领域[３－５].磷酰胺吗啉代寡核苷(p h o s p h o r o d i a m i d a t e m o r p h o l i n oo l i go n u c l e o t i d e ,P MO ,图１)是一种修饰反义寡核苷酸,具有独特的结构.它采用吗啉环第４８卷第１期２０２４年２月㊀㊀㊀㊀㊀㊀南昌大学学报(理科版)J o u r n a l o fN a n c h a n g U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e )V o l ．４８N o ．１F e b ．２０２４㊀替代脱氧核糖或核糖,并使用磷酰二胺结构代替磷酸二酯键连接每个单体.磷酰二胺结构单元的引入减少了P MO与蛋白质之间的相互作用,因此具有较低的毒副作用.最重要的是,P MO能够与D N A 和R N A进行碱基配对,并且不容易被体内核酸酶降解,具有足够的稳定性.这使得P MO能以立体位阻的方式干扰靶向R N A的下游活动,如前信使R N A(p r eＧm R N A)的剪切㊁m R N A的翻译㊁微小R N A(m i R N A)的加工或与其他分子的结合,导致相关蛋白质的合成受到阻断,从而实现在R N A水平上纠正蛋白质功能的治疗目标,或者用于研究特定基因或R N A的功能[６－７].此外,以P MO 为基础图１㊀P M O的结构F i g．１㊀t h e s t r u c t u r e o fP M O 的反义寡核苷酸在抗病毒[８－９]㊁抗菌[１０]以及生物发育系统[１１]等领域研究应用上也取得了一定成果. P MO的单体构建[１２]和链合成方法[１３－１４]的不断改进是推动P MO应用研究的前提.研究表明,对碱基的化学修饰可显著改善核酸的化学性质及生物活性[１５],在吗啉代寡核苷酸结构中亦是如此.引用保护基团来保护碱基上的氨基㊁羟基㊁酰胺基团,不仅对吗啉代寡核苷单体缩合成核苷酸起着至关重要的作用,还能得到功能多样的吗啉基修饰核苷单体[１６],如在嘧啶碱基的C－５位引入丙炔基,可以增强其双螺旋稳定性,在嘌呤C－８位引入芳环或取代芳环可以进一步扩展P MO在分子生物学中的研究和应用.然而,对于嘌呤６ＧO的修饰仅在核苷及核酸结构中曾经报道过[１７],而在P MO单体结构中,碱基嘌呤６ＧO位上的结构修饰及研究未曾见过报道.本文以鸟苷为起始原料,参照文献[１２,１８－１９]的方法合成了中间体ＧN２Ｇ异丁酰基Ｇ７ ＧOＧ叔丁基二苯基硅基ＧNＧ三苯甲基吗啉代鸟苷(５).随后,通过M i tＧs u n o b u反应在鸟嘌呤６ＧO位引入４Ｇ硝基苯乙基对其进行修饰.最后,经羟基脱保护和羟基磷酰化反应,成功合成了一种新型磷酰胺吗啉代寡鸟苷酸单体(P MOＧG),并对反应条件进行了优化.该结构增强了单体分子的稳定性,降低了分子极性.因此,在聚合成磷酰胺吗啉代寡核苷酸后,将可能会增强其脂溶性并改善其生物活性.合成路线如下:图２㊀目标分子(P M OＧG)的合成路线F i g．２㊀S y n t h e s i s r o u t e o f t a r g e tm o l e c u l e(P M OＧG)１㊀实验部分１．１㊀仪器与试剂A v a n c e４００MH z核磁共振仪(瑞士B r u c k公司);U P L CＧS QＧD E T E C T O R液质联用仪(美国W a t e r s公司);R E５２ＧA型真空旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂).鸟苷(９９％,北京百灵威科技有限公司);N,NＧ ２７ 南昌大学学报(理科版)２０２４年㊀二甲基氨基磷酰二氯(S i g m aＧA l d r i c h);三甲基氯硅烷(９８％)㊁异丁酰氯(９８％)㊁叔丁基二苯基氯硅烷(T B D P S C l,９８％)㊁高碘酸钠(N a I O４,９９％)(国药集团化学试剂有限公司);硼酸铵四水合物((N H４)２B２O７ ４H２O,９９％)㊁氰基硼氢化钠(N a B H３C N,９５％)㊁三苯基氯甲烷(T r t C l,９７％)㊁偶氮二甲酸二异丙酯(D I A D,９５％)㊁四丁基氟化铵(T B A F,９８％)㊁二氮杂二环(D B U,９９％)㊁对硝基苯乙醇(９８％)㊁溴化锂(L i B r,９８％)㊁N,NＧ二甲基甲酰胺㊁四氢呋喃,二氯甲烷㊁甲醇㊁乙酸乙酯㊁乙腈㊁异丙醇(I P A)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司).１．２㊀实验方法１．２．１㊀N２Ｇ异丁酰基鸟苷(２)的合成将鸟苷５．００g(１７．７mm o l)溶于吡啶,加入２３．０７g三甲基氯硅烷(２１２．４mm o l),在室温下搅拌２h,然后冷却至０ħ.随后滴加５．６５g异丁酰氯(５３．１mm o l),滴加完毕后,在室温下继续搅拌３h.冷却至０ħ后,用１５０m L水淬灭反应,搅拌约１０m i n后,加入９５m L浓氨水,继续在室温下搅拌约１５m i n.将反应液稀释至５００m L,使用C H２C l２(３００m Lˑ３)进行萃取,通过减压旋蒸除去溶剂,得到粗产物.通过柱层析(V(C H２C l２) V(M e O H)＝８ １)纯化得到４．８４g白色固体２,收率７５％, L C M S纯度９６．９％(R T＝１．１５０m i n).E S IＧM S,C１４H１９N５O６,实测值(理论值),m/Z:３５４．１(３５４．１)[M ＋H]＋.１．２．２㊀N２Ｇ异丁酰基Ｇ５ ＧOＧ叔丁基二苯基硅基鸟苷(３)的合成将１０．０３g化合物２(２８．４mm o l)溶于１５０m L 二甲基甲酰胺(D M F)中,并加入４．８３g(７１．０２mm o l)咪唑.然后将反应液冷却至０ħ,并滴加含有８．５９g(３１．２mm o l)叔丁基二苯基氯硅烷的D M F (１６m L)溶液,反应混合物在室温下搅拌反应６h.反应完成后,使用３００m L H２O淬灭反应,随后用乙酸乙酯(２００m Lˑ３)萃取,将有机层合并,使用饱和食盐水(１５０m Lˑ２次)进行洗涤,继而经无水N a２S O４干燥㊁过滤,通过减压蒸干溶剂,得到粗产品.通过用１０００m L乙酸乙酯打浆,获得１２．５１g 化合物３,收率７９％,L C M S纯度９４％(R T＝１．８７０m i n).E S IＧM S,C３０H３７N５O６S i,实测值(理论值), m/Z:５９２．４(５９２．３)[M＋H]＋.１．２．３㊀N２Ｇ异丁酰基Ｇ７ ＧOＧ叔丁基二苯基硅基吗啉代鸟苷(４)的合成将４．１４g(６．９９mm o l)化合物３溶于５０m L甲醇中,稍加热以溶解,然后加入１．６４g(７．７１mm o l) N a I O４水溶液(３０m L),室温下搅拌反应２h.反应完成后,通过减压蒸馏将溶剂除去,得到残留物.将残留物用３０m L水稀释,然后用乙酸乙酯(３０m Lˑ３)进行萃取,将有机层合并,用饱和食盐水洗涤有机层,经无水N a２S O４干燥㊁过滤㊁减压蒸干溶剂得白色固体粗产物４．３８g.将此粗产物溶于５０m L甲醇,加入硼酸铵四水合物３．１２g(１６．３５mm o l),在室温下搅拌反应过夜.随后加入４．３８g(７２．９９mm o l)４A分子筛,０．８９g(１４．８５mm o l)醋酸和０．９３g (１４．８５mm o l)N a B H３C N,继续在室温下反应２h,然后用１０m L甲醇淬灭反应,将大部分溶剂蒸干,所得油状物用５０m L乙酸乙酯溶解,用水萃取(５０m Lˑ３),随后经５０m L饱和食盐水洗涤㊁无水N a２S O４干燥㊁过滤㊁减压蒸干溶剂等过程,得到３．５４g白色固体４,此粗产品无需纯化可直接用于下步反应.E S IＧM S,C３０H３８N６O４S i,实测值(理论值),m/ Z:５７５．６(５７５．３)[M＋H]＋.１．２．４㊀N２Ｇ异丁酰基Ｇ７ ＧOＧ叔丁基二苯基硅基ＧNＧ三苯甲基吗啉代鸟苷(５)的合成将２．９４g(５．１２mm o l)化合物４溶于３０m L D M F中,然后加入１．０３g(１０．２４mm o l)E t３N和１．５７g(５．６３mm o l)三苯基氯甲烷,室温搅拌２h,然后用２m L甲醇淬灭反应,用３０m L水稀释反应液,用乙酸乙酯(１００m Lˑ３)萃取,随后经１００m L饱和食盐水洗涤㊁无水N a２S O４干燥㊁过滤,通过减压蒸干溶剂,所得粗产品用柱色谱(V(M e O H) V (C H２C l２)＝１ ２０~１ １０)梯度洗脱纯化得到２．７４g化合物５,收率６１％,L C M S纯度９３％(R T＝２．４４m i n).E S IＧM S,C４９H５２N６O４S i,实测值(理论值), m/Z:８１７．４(８１７．４)[M＋H]＋.１H NM R(４００MH z, C D C l３,ˑ１０－６),δ:１１．８９(s,１H),８．０７(s,１H),７．５７~７．３８(m,１２H),７．３３~７．１９(m,１３H),５．９７(d d,J＝２．０,１０．０H z,１H),４．３０~４．２４(m,１H),３．７４(d d,J＝４．８,１０．４H z,１H),３．５８(d d,J＝４．８,１０．４H z,１H),３．４０(d,J＝１１．２H z,１H),３．３０(d, J＝１２．０H z,１H),２．６２(t,J＝６．８H z,１H),１．７６(s,１H),１．７０(d,J＝１０．０H z,１H),１．５５(t,J＝１１．２H z,１H),１．３０(d,J＝７．２H z,６H),０．９５(s,９H).１．２．５㊀N２Ｇ异丁酰基ＧO６Ｇ对硝基苯乙基Ｇ７ ＧOＧ叔丁基二苯基硅基ＧNＧ三苯甲基吗啉代鸟苷(６)的合成将５．００g(６．１３mm o l)化合物５和２．０５g(１２．２６mm o l)对硝基苯乙醇溶于１００m L四氢呋喃(T H F)中,然后加入２．０９g(７．９７mm o l)P P h３和１．６１g３７第１期㊀㊀㊀㊀㊀欧阳红霞等:一种新型磷酰胺吗啉代寡鸟苷酸单体的合成及工艺优化(７．９７mm o l)偶氮二甲酸二异丙酯(D I A D),室温搅拌４h,反应完成后用１５０m L水稀释反应液,经乙酸乙酯萃取(１５０m Lˑ３),合并有机层,有机层用１５０m L饱和食盐水洗涤㊁无水N a２S O４干燥㊁过滤,减压蒸干溶剂,所得粗产品用柱色谱(V(石油醚) V(乙酸乙酯)＝１ ２)得到５．２９g白色固体６,收率８５．２％,L C M S纯度９５％(R T＝２．３９７m i n).E S IＧM S,C５７H５９N７O６S i,实测值(理论值),m/Z:９８８．７(９８８．４)[M＋N a]＋.１．２．６㊀N２Ｇ异丁酰基ＧO６Ｇ对硝基苯乙基Ｇ７ Ｇ羟基ＧNＧ三苯甲基吗啉代鸟苷(７)的合成将７．４０g(７．６５mm o l)化合物６溶于８０m L T H F中,然后加入四丁基氟化铵(T B A F)(１m o l L－１,７．１６m L)的醋酸溶液,调节溶液p H至中性,室温搅拌２h,反应完成后用１００m L水稀释反应液,然后用乙酸乙酯(１００m Lˑ３)萃取,合并有机层,经饱和食盐水洗涤㊁无水N a２S O４干燥㊁过滤,减压蒸干溶剂,所得的粗产品用柱色谱(V(C H２C l２) V (I P A)＝１０ １)得到４．６９g化合物７,收率８６．４％, L C M S纯度９６％(R T＝３．９１３m i n).E S IＧM S,C４１H４１N７O６,实测值(理论值),m/Z:７５０．４(７５０．３) [M＋N a]＋.１H NM R(４００MH z,C D C l３,ˑ１０－６),δ:８．１７~８．１０(m,３H),７．７９(s,１H),７．５２~７．４３(m,６H),７．２８(t,J＝７．６H z,６H),７．２６~７．０８(m,３H),６．２２(d d,J＝２．０,１０．０H z,１H),４．８２~４．７３(m,２H),４．３４~４．２４(m,１H),４．０５~４．００(m,２H),３．６０~３．５６(m,２H),３．４０(d,J＝１１．２H,１H),３．２４~３．１２(m,４H),２．０８(s,１H),１．８０(t,J＝１０．６H z,１H),１．５７(t,J＝１１．２H z,１H),１．３５~１．２４(m,６H).１３C NM R(１００MH z,C D C l３),δ:１９．９,３５．０,３５．６,５０．５,５７．８,６２．６,６７．１,８１．２,８３．５,９１．２,１１５．３,１２３．８,１２６．７,１２７．０,１２９．４,１３０．６,１４０．３,１４５．３,１４５．８,１４６．２,１５２．３,１５３．２,１６１．２,１７８．５.１．２．７㊀N２Ｇ异丁酰基ＧO６Ｇ对硝基苯乙基Ｇ７ Ｇ(N,NＧ二甲基氨基)磷酰氯ＧNＧ三苯甲基吗啉代鸟苷(P MOＧG)的合成将４．３５g(５．９７mm o l)化合物７溶于５０m L C H２C l２和５０m LC H３C N的混合溶剂中,加入１．０３g(１１．９４mm o l)L i B r,搅拌２m i n,然后加入１．８２g (１１．９４mm o l)二氮杂二环(D B U),１．４５g(８．９７mm o l)N,NＧ二甲基氨基磷酰二氯的C H２C l２(５m L)溶液,０ħ下搅拌２h,反应完成后减压蒸干溶剂,用冷却的乙酸乙酯(１５０m L)稀释,用预冷至０ħ~５ħ的水(１００m Lˑ２)萃取,合并有机层,用无水N a２S O４干燥㊁过滤㊁减压蒸干溶剂,粗产品经柱层析(V(C H２C l２) V(I P A)＝８ １)得到３．３g 油状物(P MOＧG),收率６１％,L C M S纯度９５％(R T＝４．３７０m i n).E S IＧM S,C４３H４６C l N８O７,实测值(理论值),m/Z:８７５．３(８７５．３)[M＋N a]＋.１H NM R(４００MH z,C D C l３,ˑ１０－６),δ:８．１８~８．０４(m,２H),７．８１~７．６８(m,２H),７．５１~７．３９(m,７H),７．３２~７．１３(m,１０H),６．２０(d,J＝９．７H z,１H),４．７６(t,J＝６．６H z,２H),４．４４(d,J＝５．２H z,１H),４．１６~３．９８(m,２H),３．４４(d,J＝１１．２H z,１H),３．３０~３．１６(m,３H),２．６１~２．５７(m,６H),１．７９~１．６５(m,２H),１．５６(t,J＝１１．２H z,１H),１．３８~１．２６(m,６H).１３C NM R(１００MH z,C D C l３),δ:１９．７,３５．２,３５．５,３６．０,５０．５,５８．０,６７．３,６９．２,７７．８,８４．０,９１．２,１１５．３,１２３．８,１２６．７,１２７．０,１２９．４,１３０．５,１４０．６,１４５．０,１４５．９,１４６．２,１５２．６,１５３．２,１６１．２,１７７．６３１P NMR(１６２MH z,C D C l３,ˑ１０－６)δ:１８．４５,１８．１２.２㊀结果与讨论㊀㊀本文使用鸟苷为起始原料,通过七个反应步骤,成功合成了一种新型的磷酰胺吗啉代寡鸟苷酸单体(P MOＧG).本工作首次在碱基鸟嘌呤的６ＧO位上引入了对硝基苯乙基,该基团在酸碱条件下表现较为稳定.整个合成路线主要涉及到碱基氨基的保护㊁M i t s u n o b u反应㊁羟基磷酰化等多个关键工艺步骤.２．１㊀碱基氨基的保护碱基氨基的保护是寡核苷酸单体缩合成过程中必不可少的一步.常见的氨基保护方式有两种:其中一种方法是在吗啉环形成后,以三乙胺为碱,分批加入异丁酸酐,并在１４０ħ下加热反应,以异丁酰基对氨基进行保护,类似于S A N K HA P[１２]等报道的方法;另外一种方法则是在吗啉环形成前对氨基进行保护,类似于文献[１９]中采用的方法.本文尝试采用后一种方式进行氨基保护:首先,使用三甲基氯硅烷对鸟苷的羟基进行保护,然后使用异丁酰氯对氨基进行保护,最后,使用浓氨水脱三甲基硅烷基.整个保护过程在室温下进行,工艺简单㊁温和,收率高达７５％.相比之下,方式一使用异丁酸酐为保护试剂,其活性较弱,需高温反应.因此,本文选择了后一种方式进行碱基氨基的保护.２．２㊀M i t s u n o b u反应三苯基膦的用量优化化合物５经M i t s u n o b u反应以对硝基苯乙醇４７ 南昌大学学报(理科版)２０２４年㊀修饰６ＧO 位时,三苯基膦和D I A D 在反应过程形成中间体,用于夺取质子并形成亲核试剂.然而,三苯基膦会产生三苯氧磷副产物,在柱层析过程中容易导致拖尾现象,增加纯化的难度,降低反应收率.因此,我们需要优化三苯基膦的用量,以尽量减少三苯氧磷的产生.实验结果表明,当三苯基膦和D I A D 与化合物５的物质的量之比为１．３时,反应收率达到最高值.表１㊀P P h ３用量的优化T a b ．１㊀O p t i m i z a t i o no f t h e a m o u n t o fP P h ３E n t r y n (P P h ３):n (C o m p o u n d５)Y i e l d /％１１．１４３２１．２５５３１．３８５４１．５７３５２．０６１㊀㊀注:n (对硝基苯乙醇) n (化合物５)＝２ １,n (D I A D ) n (P P h ３)＝１ １.２．３㊀７’ＧO H 磷酰化反应条件的优化在化合物７的７ ＧO H 位置接入N ,N Ｇ二甲基氨基磷酰二氯是合成目标化合物P MO ＧG 重要反应步骤.反应中需使用L i B r 做催化剂,二氮杂二环(D B U )做碱,L i B r 的作用可能是通过L i ＋与７ ＧO 和吗啉环上的N 配位形成一个六元环过渡态,从而增强７ ＧO H 的酸性,使之更容易被碱进攻;同时L i ＧB r 的另一个作用是帮助N ,N Ｇ二甲基氨基磷酰二氯中P ＧC l 的断裂,因此反应过程中L i B r 和D B U 的用量对反应产率至关重要.本文在参考文献[１８]的基础上对D B U 和L i B r 的用量以及反应温度㊁时间等变量进行了探索和优化,其结果见表２.研究结果表明,D B U 和L i B r 与化合物７的物质的量之比为３．２时,在混合溶剂C H ３C N 和C H ２C l ２中,０ħ下反应１h ,收率达到最高,为５５％;延长反应时间并不会提高产物的收率,反而会稍微降低,可能是因为随着时间的延长,会生成少量的二聚副产物.当在室温下反应１h 时,收率为４３％,主要是由于终产物的磷酰氯基团在室温下容易发生水解.我们还尝试改变D B U 和L i B r 的用量,发现当D B U 和L i B r 与化合物７的物质的量之比为２．０时,在０ħ下反应２h ,收率高达６１％.相比文献中的工艺条件,虽然本工艺时间略微延长,但收率显著提高,并降低了原料成本.在大规模生产中,聚合物P MO 及其活性筛选研究需要大量的单体提供物质基础,因而成本控制尤为重要.因此,本研究选择了如实验方法１．２．７中序号６的工艺条件.表２㊀磷酰化反应条件的优化T a b ．２㊀O p t i m i z a t i o no fP h o s p h o r yl a t i o n r e a c t i o n c o n d i t i o n E n t r y n (D B U ):n (C o m p o u n d７)n (L i B r):n (C o m po u n d７)S o l v e n t T e m pe r a t u r e /ħt /h Y i e l do fC o m po u n d８/％１３．２３．２C H ３C N ＧC H ２C l ２００．５４９２３．２３．２C H ３C N ＧC H ２C l ２０１５５３３．２３．２C H ３C N ＧC H ２C l ２０２４７４３．２３．２C H ３C N ＧC H ２C l ２r ．t １４３５２．０２．０C H ３C N ＧC H ２C l ２０１４５６２．０２．０C H ３C N ＧC H ２C l ２０２６１７２．０２．０C H ３C N ＧC H ２C l ２０３５０㊀㊀㊀㊀㊀注:n (N ,N Ｇ二甲基氨基磷酰二氯):n (化合物７)＝１．５ １,V (C H ３C N ) V (C H ２C l ２)＝１ １.３㊀结论㊀㊀本研究通过７个反应步骤,并对关键步骤中M i t s u n o b u 反应㊁磷酰化反应进行了工艺优化,成功合成了一种新型磷酰胺吗啉代寡鸟苷酸单体,总收率为１４．１％.作为反义核酸药物,寡核苷酸P MO５７ 第１期㊀㊀㊀㊀㊀欧阳红霞等:一种新型磷酰胺吗啉代寡鸟苷酸单体的合成及工艺优化具有广泛的应用领域,可用于抗病毒㊁抗菌及基因治疗等.已上市的依利替生和抗埃博拉病毒药物A V IＧ７５３７的研究证明了P MO作为药物的可行性.本研究中合成的新型单体具有稳定的结构,并且具有增强的脂溶性,这有望提高其生物活性.下一步,研究小组将目标化合物聚合成寡核苷酸,再进行生物活性研究,同时将其用于抗病毒药物的筛选工作.参考文献:[１]㊀张文洁,魏霞,何军林．吗啉代寡核苷酸的应用研究进展[J]．国际药学研究杂志,２０２０,４７(４):２５１Ｇ２５７,２６２．[２]周海燕．反义寡核苷酸药物在精准治疗中的应用进展及其作用机制[J]．精准医学杂志,２０２０,３５(４):２８３Ｇ２９１．[３]WA N W B,S E T H P P．T h e m e d i c i n a lc h e m i s t r y o f t h e r a p e u t i co l i g o n u c l e o t i d e s[J]．J o u r n a lo f M e d i c i n a lC h e m i s t r y,２０１６,５９(２１):９６４５Ｇ９６６７．[４]S HA R MA V K,S HA R MA R K,S I N G H S K．A n t iＧs e n s e o l i g o n u c l e o t i d e s:m o d i f i c a t i o n sa n dc l i n i c a l t r i a l s[J]．M e d．C h e m i c a l．C o mm u n i c a t i o n．,２０１４,５(１０):１４５４Ｇ１４７１．[５]何军林．核酸药物的研究进展[J]．国际药学研究杂志,２０１７,４４(１１):１０２８Ｇ１０５１．[６]G E R E T YSS,W I L K I N S O NDG．M o r p h o l i n o a r t i f a c t s p r o v i d e p i t f a l l s a n d r e v e a l a n o v e l r o l e f o r p r oＧa p o p t o tＧi c g e n e s i nh i n d b r a i nb o u n d a r y d e v e l o p m e n t[J]．D e v e lＧo p m e n t a l B i o l o g y,２０１１,３５０(２):２７９Ｇ２８９．[７]E I S E NJ S,S M I T HJC．C o n t r o l l i n g m o r p h o l i n o e x p e rＧi m e n t s:d o n t s t o p m a k i n g a n t i s e n s e[J]．D e v e l o p m e n t,２００８,１３５(１０):１７３５Ｇ１７４３．[８]H E A L D AE,I V E R S E NPL,S A O U DJ B,e t a l．S a f e t ya n d p h a r m a c o k i n e t i c p r o f i l e s o f p h o s p h o r o d i a m i d a t em o r p h o l i n oo l i g o m e r sw i t ha c t i v i t y a g a i n s t e b o l av i r u sa n d m a rb u r g v i r u s:r e s u l t s o ft w o s i n g l e a sc e nd i n gd o se s t u d i e s[J]．A n t i m i c r o b i a lA g e n t s a n dC h e m o t h e rＧa p y[J]．２０１４,５８(１１):６６３９Ｇ６６４７．[９]P O P I K W,K HA T U A A,H I L D R E T HJEK,e t a l．A lＧc e nd o r p h o s p h o r o d iＧa m i d a te m o r p h o l i n o t a r g e t i n g t h e５ᶄu n t r a n s l a t e dr e g i o no ft h eZ I K V R N Ai n h i b i t sv i r u sr e p l i c a t i o n[J]．V i r o l o g y,２０１８,５１９(７):７７Ｇ８５．[１０]G E L L E R BL,G R E E N B E R G D E．P e p t i d eＧc o n j u g a t e d p h o s p h o r o d i a m i d a t e m o r p h o l i n o o l i g o m e r s:a n e ws t r a t e g y f o r t a c k l i n g a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e[J]．T h e r a p e uＧt i cD e l i v e r y,２０１４,５(３):２４３Ｇ２４５．[１１]刘丰,黄慧敏,王志华,等．利用吗啉代寡核苷酸技术下调早期斑马鱼胚胎l m n a基因的初步研究[J]．中国比较医学杂志,２０１６,２６(８):８５Ｇ９０．[１２]P A T T A N A Y A K S,P A U L S,N A N D IB,e ta l．I mＧp r o v e d p r o t o c o l f o r t h e s y n t h e s i so f f l e x i b l yp r o t e c t e dm o r p h o l i n o m o n o m e r sf r o m u n p r o t e c t e d r i b o n u c l e oＧs i d e s[J]N u c l e o s i d e s,N u c l e o t i d e s&N u c l e i c A c i d s,２０１２,３１(１１):７６３Ｇ７８２．[１３]M 卡鲁瑟斯,S 保罗．使用亚磷酰胺化学法合成主链修饰的吗啉代寡核苷酸和嵌合体:C N１１６８０４０３１A[P]．２０２３Ｇ０９Ｇ２６．[１４]O U Y A N G X H,S H E S T O P A L O VIA,S I N HA S,e ta l．V e r s a t i l e s y n t h e s i s a n d r a t i o n a ld e s i g n o fc a g e dm o r p h o l i n o s[J]．J o u r n a l A m e r i c a C h e m i c a lS o c i e t y,２００９,１３１(３７):１３２５５Ｇ１３２６９．[１５]贾磊,朱财盛,麦曦,等．２,６,９Ｇ三取代嘌呤衍生物三维定量构效关系和靶点相互作用[J]．南昌大学学报(理科版),２０２１,４５(３):２７３Ｇ２７８,３０６．[１６]N A N D IB,P A T T A N A Y A KS,P A U LS,e t a l．S y n t h eＧs i s o f n u c l e o b a s eＧf u n c t i o n a l i z e d m o r p h o l i n oＧm o d i f i e dn u c l e o s i d e m o n o m e r s t h r o u g h P a l l a d i u mＧC a t a l y z e dC r o s sＧC o u p l i n g R e a c t i o n s[J]．E u r o p e a n J o u r n a lO r g a nＧi cC h e m i s t r y,２０１３,１２(７):１２７１Ｇ１２８６．[１７]L A N G H,G O T T L I E B M,S C HWA R Z M,e ta l．N e w ２Ｇ(４ＧN i t r o p h e n y l)e t h y l(N p e)Ｇa n d２Ｇ(４ＧN i t r o p h e n y l)e t h o x y c a r b o n y l(N p e o c)Ｇp r o t e c t e d２ Ｇd e o x y r i b o n u c l e oＧs i d e s a n d t h e i r３ Ｇp h o s p h o r a m i d i t e sＧv e r s a t i l eb u i l d i n gb l oc k s f o r o l i g o n u c l e o t ide s y n t h e s i s[J]．H e l v e t i c aC h i m i c aA c t a,１９９９,８２(１２):２１７２Ｇ２１８５．[１８]P A T T A N A Y A K S,S I N HA S．L i t h i u m b r o m i d eＧD B U m e d i a t e d s y n t h e s i s o f c h l o r o p h o s p h o r a m i d a t eＧa c t i v a t e dm o r p h o l i n on u c l e o s i d es u b u n i t s[J]．T e t r a h e d r o n L e tＧt e r s,２０１２,５３(４９):６７１４Ｇ６７１７．[１９]陈晓睿,郭永建,宋亚彬,等．磷酰胺吗啉代寡核苷酸关键中间产物的合成方法探索与工艺优化[J]．军事医学,２０１７,４１(８):６６２Ｇ６６６．(责任编辑:杜珍珍)６７ 南昌大学学报(理科版)２０２４年㊀。
采用“中医农业”理念生产有机蔬菜关键技术初探——基于陕西丰岭园“中医农业”有机蔬菜种植管理实践
2023.11中医农业【编者按】“中医原理技术方法农业应用(中医农业)”是中国传统农耕文化的载体,是中华民族数千年勤劳和智慧的结晶,是农耕文化和中医文化的融合传承和创新发展,是中国特色的生态农业,渗透着中国哲学的精髓,意味深远,博大精深。
近年来,“中医农业”理念及各种投入品在生产实践中表现出显著成效。
大量农业生产实践表明,利用中医农业技术生产出来的农产品,具有明确的产品品质区分度,其所具备的“差异化”特点,有助于打造地方知名农产品品牌。
而且,中医农业农产品的概念也更容易被消费者所采信。
本着边研究、边示范、边推广,逐步系统化、标准化的原则,我们与咸阳秦原中医农业研究院合作,以专栏方式,分期择优刊登咸阳中医农业科技特派员从事中医农业理论研究、试验示范取得的阶段性成果,供业内人士参考交流。
同时,期待今后有更多相关研究者、生产实践者展现自己的科研成果和应用案例。
采用“中医农业”理念生产有机蔬菜关键技术初探———基于陕西丰岭园“中医农业”有机蔬菜种植管理实践郭建挺摘要有机蔬菜生产基地认证要求严格,生产过程技术标准高。
实践表明,“中医农业”理念和现有技术措施完全能够解决有机蔬菜生产过程中肥药使用等关键问题,而且产量可控、质量更优。
关键词中医农业;有机蔬菜;关键技物;前景展望郭建挺,咸阳秦原中医农业研究院,邮编712000。
收稿日期:2023-08-181“中医农业”原理与方法1.1“中医农业”原理中医是具有中国特色的医疗哲学、医疗原理和技术的医学理论体系,是人类迈向大健康时代的理论精髓。
“大医精诚”是中医从业者职业道德标准,“大医治未病”是中医保健养生预防治疗的原则,“整体观念、辩证论治”是中医诊治的基本方针,“导引推拿针灸药”“中药学”“方剂学”等治疗手段为综合治疗提供了全面的解决方案。
中医不仅为人类健康提供保障,其原理和方法对农业生产亦具有重大意义。
“中医农业”将中医原理和方法应用于农业领域,实现现代农业与传统中医的跨界融合、优势互补和集成创新,产生“1+1>2”的效应。
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文 章编 号 ：１ ６ ７ １ — ９ ６ ４ ６（ ２ ０ １ ４ ）０ ７ ａ 一 ０ ０ ４ ２ — ０ ４
麒 麟菜 中类菌孢素氨基酸 （ ＭＡ Ａ ｓ ） 提取工艺 的优化研 究
牛 美英 ， 张朝辉 ，高 明 ，步 琳 ，张苗苗
（ 中国海洋大学 食品科学 与工程学 院 ，山东 青 岛 ２ ６ ６ ０ ０ ０ ） 摘要 ：确定 Ｍ Ａ Ａ ｓ的最优提取工艺 。在单 因素试 验的基础上 ，采用正交试验 确定水浴提取 的最佳工艺 。在 水浴提取 工艺最佳条件的基 础上 ，引进超声波辅助提取 ，通过正交试验确定超声波辅 助提取的最佳工艺 。对 ２种方法 的比较 ， 确定 ＭＡ Ａ ｓ 最佳的提取 ｌ Ｔ艺 为超声时 间 ２ ５ ａｉ ｒ ｎ ，料液 比 ｌ： ３ ０ ，甲醇体积分数 １ ０ ％，提取温度 ４ Ｊ ０℃，提取时间 ２ ｈ 。
ｓ ｏ ｌ ｉ ｄ—ｌ ｉ ｑｕ ｉ ｄ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ １ ：３ ０， ｍｅ ｔ ｈａ ｎ ｏ ｌ ｃ ｎｃ ｅ ｎｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ １ ０ ％ ，ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕｒ ｅ ４ ０ ｏ Ｃ， ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ｉ ｍｅ ２ ｈ．
第 ７期 （ 总第 ３ ５ ８期） ２ ０ １ ４年 ７月
农产品加工 （ 学 刊） Ａ ｃ ａ ｄ ｅ ｍｉ ｃ Ｐ ｅ ｒ ｉ ｏ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ ｏ ｆ Ｆ ａ ｒ ｍ Ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｓ Ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ ｇ
Ｎｏ ． ７
Ｊ ｕ １ ．
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Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｄｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ｅ ｔ ｈ ｅ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍａ ｌ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｏ ｆ ＭＡＡｓ ． Ｏｎ ｔ ｈ ｅ ｂ ａ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｓ ｉ ｎ ｇ ｌ ｅ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ｓ ，ｄ ｅ ｔ ｅ ｍ ｉ ｒ ｎ ｅ ｔ ｈ ｅ ｂ ｅ ｓ ｔ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｙ ｇ ｏ ｆ ｗ ａ ｔ ｅ ｒ ｂ ａ ｔ ｈ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｂ ｙ ｏ ｒ ｔ ｈ ｏ ｇ ｏ ｎ ａ ｌ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ．Ｏ ｎ ｈｅ ｔ ｂ ａ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍｕ ｍ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ｏ ｒ ｗａ ｔ ｅ ｒ ｂ ａ ｔ ｈ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ，
关键词 ：麒麟菜 ；类菌孢素氨基酸 （ Ｍ Ａ Ａ ｓ ） ；工艺优化 中 图 分 类 号 ：Ｔ Ｓ ２ ５ ５ ． １ 文 献标 志码 ：Ａ ｄ ｏ ｉ ：１ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ １ — ９ ６ ４ ６ （ Ｘ） ． ２ ０ １ ４ ． ０ ７ ． ０ １ ３
Ｋ ｅ ｙ ｗ ｏ ｒ ｄ ｓ ：ｅ ｕ ｅ ｈ ｅ ｕ ｍａ ；ｍｙ ｃ ｏ ｓ ｐ ｏ ｒ ｉ ｎ ｅ ａ ｍ ｉ ｎ ｏ ａ ｃ ｉ ｄ ｓ（ ＭＡ Ａ ｓ ） ；ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
０ 引言
基 团的存 在 ，在 ３ ２ ０ ～ ３ ６ ０ ｎ ｍ 的紫 外 光 区具 有 强 的 吸
（ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ，Ｏ ｃ ｅ ａ ｎ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ，Ｑ ｉ ｎ ｇ ｄ ａ ｏ ，Ｓ ｈ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇ ２ ６ ６ ０ ０ ０ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
麒 麟 菜 属 红 藻 门 、红 翎 菜 科 ，是 一 种 热 带 大 型 海 洋 藻 类 ，主 要 分 布 于 我 国海 南 、广 东 、广 西 ， 以 及东南亚等热带沿海地 区［ ，但是麒麟菜 因藻体粗 糙 、腥 味大 等 原 因而 不 被食 用 ，只作 为 提 取 卡 拉 胶 的原 料 ｆ ３ １ ，所 以提 高麒 麟菜 的利 用率 成 为今 后 研究 趋