L_异亮氨酸分批发酵动力学模型的研究
L-异亮氨酸发酵工艺条件的研究
L-异亮氨酸发酵工艺条件的研究
浦军平;陈刚;王开国
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2003(029)002
【摘要】研究了L-异亮氨酸产生菌Apsm533128(Brevibacterium flavum)菌体的生长规律.讨论了葡萄糖、玉米浆的浓度对L-异亮氨酸的积累的影响,并且在30t 发酵罐上进行发酵工艺条件的研究,通过对通气量、温度、pH值等外环境发酵条件的控制,在30t发酵罐工业化大生产中,L-异亮氨酸发酵产酸率达2.3～2.5%.并对其发酵动力学进行了初步的研究.
【总页数】4页(P93-96)
【作者】浦军平;陈刚;王开国
【作者单位】江苏亚太氨基酸有限公司,张家港市,215600;江苏亚太氨基酸有限公司,张家港市,215600;江苏亚太氨基酸有限公司,张家港市,215600
【正文语种】中文
【中图分类】TQ92
【相关文献】
1.L-异亮氨酸发酵工艺条件的研究 [J],
2.基因敲除降低L-缬氨酸发酵中亮氨酸和异亮氨酸含量的研究 [J], 胡炎华;朱亚然;宫卫波
3.L-异亮氨酸生产菌发酵水平提高的研究 [J], 黄平
4.微生物发酵法生产L-异亮氨酸的研究进展 [J], 孔帅;方应浩;周航;许鹏飞;杨潇;任
立伟;龚大春
5.代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌促进L-异亮氨酸发酵合成的研究进展 [J], 谭海;顾阳;卢南巡;常景玲;李志刚
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L-异亮氨酸补料分批发酵的研究
ｙｅ ｆＬ ｉ ｌｕ ｉｅａｔｉｅ ｏ２ ． ６ ｇ Ｌ ａ ｄｔｅｃｎ ｅｓｏ ａｅｏ ｌｃ ｓ ｓ１ ． ４ ． ｉｌ ｏ －ｓ ｅｃｎ ｔ ｎ ｄ ｔ １ ９ ／ ｎ ｈ ｏ ｖ ｒｉｎ ｒｔ ｆ ｕ ｏ ｅｗａ ５ ３ ｄ ｏ ａ ｇ
Ｋｅ ｒ ｓ ｙ ｗｏ ｄ ：Ｌ—ｓ ｌｕ ｉ ｅ ｅ — ａ ｃ ｅ ｍｅ ｔ ｔ ｎ ｐ ｉ ｌｃ ｎ ｉ ｏ ｓ ｉｏ ｅ ｃｎ ；ｆ ｄ ｂ ｔ ｈ ｆ ｒ ｎ ａ ｉ ；ｏ ｔ ｏ ｍａ ｏ ｄ ｔ ｎ ｉ
摘
要 ： 究 了不 同初 糖 浓 度 、 萄糖 及 氮 的补 加 方 式在 Ｌ 异 亮 氨 酸 发 酵 过 程 中对 其 产 酸 率 、 化 率 等 参 数 的 影 研 葡 一 转
响 ，确 定 了 Ｌ 异 亮氨 酸 补 料 分 批 发 酵 的 最 佳 条 件 ， 最佳 补 料 分 批 发 酵条 件 下 ， 一 亮 氨 酸 产 量 达 ２ ． ６ｇ Ｌ， 一 在 Ｌ异 １ ９ ／ 糖 酸转 化 率 达 １ ．４ ５ ３ ％． 关键 词 ： 一 亮氨 酸 ；补料 分批 发 酵 ；条 件优 化 Ｌ异 中 图分 类 号 ： １ ； Ｑ９ ２ Ｑ５ ７ Ｔ ２ 文献标识码 ： Ａ
氨 酸为 主要 肝醒灵 口服液 ， 治疗 各种 肝脏 疾病 具 有显 著 疗 对 效， 因此 ， 其用量逐 年增长 Ｌ ］ １ ．据文献 报道 ＿ ］在 发 ｑ ４ ， 酵 中采用较高浓 度 的葡 萄糖 进行 分批 发酵 的转 化 率 很低 ， 主要 原 因是 分批 发 酵方 式使 高 浓度 的初 糖 其
ＡＥ ， Ｃ ） 本实 验室保 藏菌 种． １ ２ 培 养基 ． １ 种子培养基 ： ） 蔗糖 ３ ， Ｏｇ 尿素 ２ｇ Ｃ ３Ｏ Ｎ ， Ｈ Ｃ Ｏ ￣
３ ７ ｇ， ． ＫＨ ２ ＰＯ４・３ ２ ３ ｇ， ｇ Ｈ Ｏ Ｍ ＳＯ４・７ ２ ０ ４ ｇ， Ｈ Ｏ ．
发酵液中L-异亮氨酸提取工艺研究
ｌｍ ｎ 活性 炭 添加量 为 ２ 脱 色温度 为 ６ ℃ 、 色时间 为 ２ ｒｉ、 色 时的最佳 ｐ 为 ４７ 在此 工 艺条 Ｏ ｉ、 ％、 ０ 脱 ５ ｎ脱 ａ Ｈ ．。
件 下 ， 一 亮氨酸提 取 收率 为 ９ ． ， Ｌ 异 ４３ 产品 纯度 高达 ９ ．％ 。 ％ ６５ 关键 词 ： 一 亮氨 酸 Ｌ 异 分 离提 取 工 艺 活性 炭 脱 色
了初 步研 究。 别考察 了蛋 白去 除温 度及 时 间、 分 活性 炭 用量 、 色时 间、 色温度 、 脱 脱 发酵 液 ｐ 值 对 Ｌ 异 Ｈ 一
亮氨 酸 分 离提 取 效 果 的 影 响 。 最 终确 定 了提 取 的 工 艺条 件 ． 即蛋 白去 除 温度 及 时 间 分 别 为 ９ ℃和 ０
１ ％ ００
酸 ， 导致 食 欲不 振 、 质 下 降 、 将 体 贫血 及 其 它功 能 障碍 。因此 ， 其用 量逐 年增 长【， １１ ， 。目前 ， ２ ３ 在工业 生
产上 主要应 用发 酵法 生产 Ｌ 异亮 氨 酸 。 一 生产 上 分 离提 取 氨基 酸 的方法 有 很 多种 ， 如 离 子交换 法 、膜分 离技 术等 。本 文采 用加 热除 蛋 白 、 电点 有机 溶剂 法从 发 酵液 中提 取 Ｌ 异亮 氨 等 一 酸 。确立 了最 适蛋 白去 除温 度及 时 间 、活性 炭 用 量 、 色 时间 、 色温 度 、 酵液 ｐ 脱 脱 发 Ｈ值 对 Ｌ 异 亮 一 氨 酸分离 提取 的影 响 。
的发 酵液 ，分别在 ６ ℃、０ 、０ ９ ℃、Ｏ ￣下 Ｏ ７ ℃ ８ ℃、Ｏ Ｉ０Ｃ 加热 ｌ ｍｉ Ｏ ｎ除蛋 白， 比较结 果如 表 １ 所示
表 １ 加 热 温 度 对 去 除 蛋 白量 的 影 响
黄色短杆菌YILW生产L-异亮氨酸的发酵工艺研究
２１ 年７ ０ ０ 月
发 酵 科 技 通 讯
黄 色短 杆 菌 Ｙ Ｌ 生产 Ｌ 异 亮氨 酸 的发 酵 工 艺研 究 ＩＷ 一
白亚磊 冯 宁 徐 庆 阳 谢 希 贤 陈 宁
（ 天津科 技 大学 生物工 程学 院 天津 ３ ０ ５ ） ０ ４ ７
摘 要 ： 本文 对 Ｌ 异 亮氨 酸产 生 菌 Ｙ Ｌ 的发 酵 工艺条 件做 了研 究 ， 定 了其 积 累 Ｌ 异 亮氨 酸 的 一 ＩＷ 确 一
化率 达到 ２％。 １ 关 键 词 ： 色短 杆 菌 黄 Ｌ ） 一 Ｌ Ｉ 是人 体 八 种 必 需 氨基 酸 ｅ
ｍｇＬ ＶＢ３ ｇＬ ｐ ． ７２ ０１ ａ 湿 热 灭 菌 ／ ， ｌｍ ／ ，Ｈ ７０－ ． ，． Ｍｐ
１ ａｉ ５ｒ ｎ。
之一 ， 又是三 种支 链氨 基 酸之一 ， 因其 特 殊 的结 构
和功 能 ， 因此 ， 人类 生命 代谢 中具 有特 别重要 的 在 地 位 。Ｌ一异 亮氨 酸 除用 于一 般 营养 型复 合 氨基 酸 输液 、要 素膳外 ，还作 为特殊 的支链 氨基 酸之
一
基础发酵 培养基： 萄糖 ８ ， Ｈ ） ｏ４ ，ｅ ． 葡 ０ （ ４２ ．ｏ Ｆ Ｓ Ｎ ｓ
ｍｇ豆饼 水解液 ２ ， ， ０玉米 浆 ２ ，Ｈ７ － ．，． ５ ａ ． ｐ ． ７ ０ ７ Ｍｐ ５ ０ ２ ０ 湿热灭 菌 １ｒｉ。 ５ ｎ ａ
肾安 氨基 酸输 液 ， 特别是 以 Ｌ一异 亮 氨 酸 为主 要
原 料生产 的高支链 氨基 酸输 液 、 肝安糖 浆 、 肝灵 口 服 液 ， 治疗 各 种肝 脏 疾 病具 有 显 著疗 效 ， 对 因此 ，
中 ， 于 旋 转 式 摇 床 上 （８ ｒ ｉ） １ 振 荡 培 养 置 １ ０／ ｎ， ａ ｒ ３
L_异亮氨酸菌种选育及发酵条件优化(1)
21 1 L2异亮氨酸产生菌选育谱系 从野 生 型 谷 氨 酸 产 生 菌 栖 糖 蜜 棒 杆 菌
( Cory nebacteri um mel assecol a ) A TCC17965 为 出 发菌株 ,经硫酸二乙酯和60 Co 诱变处理 ,依次赋予 S Gr 、L eu2M Er 、L eu2 、A HVr 、Sucg 、Et hr 遗传标记 ,得 到一株 L2异亮氨酸产生菌 I3125 ,在适宜的条件下 摇瓶产酸平均为 14～15 g/ L . 选育过程见图 1. 21 2 发酵培养基优化
M Er + L eu2 + A HVr + Sucg + Et hr ) ,在培养基未经优化的情况下产 L2异亮氨酸 14～的影响 ,在优化的培养基和发酵条件下积累 L2异亮氨酸 191 2
g/ L ,最高时可达 211 3 g/ L .
完全培养基 、基本培养基和种子培养基均以 20 %的 NaO H 调至 p H 71 0 , 01 1 M Pa 下 灭菌 20 min ; 发酵培养基以 20 %的 NaO H 调 p H 至 71 0 , 01 07 M Pa 压力灭菌 10 min. 11 3 培养方法 11 31 1 种子培养 接一环生长良好的斜面种子于 装有 40 mL 种子培养基的 250 mL 三角瓶中 ,30 ℃ 于往复式摇床上培养 11 h , 85 r/ min ,振幅 90 mm. 11 31 2 发酵培养 接 1 mL 种子液于装有 15 mL 发酵培养基的 250 mL 三角瓶中 ,30 ℃于往复式摇 床上培养 72 h , 100 r/ min ,振幅 90 mm. 11 4 诱变筛选方法
要[11] . 为此作者考察了在发酵培养基中分别添加不 同氮源 (含氮量以硫酸铵 40 g/ L 的用量的含氮量来 计算其它氮源的添加量) 对 I3125 合成 L2Ile 影响 , 结果见图 3.
L-异亮氨酸产生菌的融合育种选育及其关键酶与发酵条件的研究(1)
天津科技大学硕士学位论文L-异亮氨酸产生菌的融合育种选育及其关键酶与发酵条件的研究姓名：王菲申请学位级别：硕士专业：发酵工程指导教师：张克旭20040101摘要本论文根据代谢控制发酵理论，研究了Ｌ－异亮氨酸生产菌的选育及其发酵条件。
主要研究内容和结果如下：（１）建立了发酵液中Ｌ异亮氨酸定量测定的偏最小二乘分光光度法，并对该方法的应用条件进行了研究。
以高速氨基酸分析仪测定结果为参比，用偏最小二乘分光光度法测定结果的准确度比纸层析一色斑洗脱比色法高，且方法较简便。
ｆ２）确定了亲株ＩＳＷ３３０和ＡＳｌ．４９５原生质体形成和再生及进行原生质体融合的最佳条件，采用原生质体融合技术最终筛选出一株带有目的遗传标记的Ｌ，异亮氨酸高产菌ＳＷ０３７０（Ｌｅｕ一＋Ｍｅｔ一＋ＡＥＣ７十ａ．ＡＢｒ）。
该菌株在未优化条件下可产Ｌ异亮氨酸１４．２７９／Ｌ。
经验证，菌株ＳＷ０３７０的遗传性能稳定。
（３）初步研究了菌株ＳＷ０３７０发酵过程中关键酶苏氨酸脱氨酶的提取、测定方法与调节性质。
在得到的酶活测定与提取方法的最佳条件的基础上，分别考察了不同Ｌ异亮氨酸浓度和不同氨基酸对酶活力的影响。
（４）研究了菌株ＳＷ０３７０的摇瓶分批发酵条件。
应用二次回归正交旋转组合设计获得该菌株优化的发酵培养基配比，并对分批发酵和补料分批发酵培养条件进行了研究。
在优化条件下，菌株ＳＷ０３７０摇瓶补料分批发酵９６ｈ，可产Ｌ，异亮氨酸２１．９６ｇ／Ｌ。
本论文在Ｌ异亮氨酸代谢控制发酵研究领域韵创新之处在于，成功地利用原生质体融合技术选育出一株带有双缺标记的Ｌ－异亮氨酸高产菌ＳＷ０３７０，并研究了菌株ＳＷ０３７０发酵过程中关键酶苏氨酸脱氨酶的酶活测定与纯化方法和反馈调节性质。
对以后继续进行Ｌ广异亮氨酸的育种工作有指导性意义。
菌株ｓｗ０３７０，采用补料分批发酵工艺，在摇瓶上发酵９６ｈ可产Ｌ一异亮氨酸２１．９６９／Ｌ，具备了在发酵罐上生产的潜力，达到国内先进水平。
关键词：Ｉ，异亮氨酸，黄色短秆菌，原生质体融合，苏氨酸脱氨酶，补料分批发酵ＡｂｓｔｒａｃｔＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｔｈｅｏｒｙｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｃｏｎｔｒｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅｔｈｅｓｉｓｆｏｃｕｓｅｓｏｎｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆＬ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｈｉｇｈ—ｙｉｅｌｄｉｎｇｓｔｒａｉｎａｎｄｉｔｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｒｅｓｕｌｔｓａｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：（１）Ｌ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｂｒｏｔｈｗａｓｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｗｉｔｈＰａｒｔｉａｌＬｅａｓｔ．Ｓｑｕａｒｅｓｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｃｏｍｐｕｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｄｅｃｉｄｅｄ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｈｉＥｈ，ｓｐｅｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄａｎａｌｙｚｅｒ，ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｖａｌＨｅｏｆＬ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗｉｔｈＰａｒｔｉａｌＬｅａｓｔ．Ｓｑｕａｒｅｓｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙｍｅｔｈｏｄｗａｓｍｏｒｅａｃｃｕｒａｔｅｔｈａｎｗｉｔｈｐａｐｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ￡Ｉｐｈｙ－ｍｏｔｔｌｅｅｌｕｔｉｏｎｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ．（２）ＴｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｆｕｓｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｓｔｒａｉｎＩＳＷ３３０ａｎｄＡＳｌ．４９５ｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｉｎｔｈｉｓｔｈｅｓｉｓ．０ｎｅＬ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｈｉｇｈ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎＳＷ０３７０ｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｕｓｉｏｎ，ｓｈａｋｅｆｌａｓｋｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｔｅｓｔａｎｄｓｉｎｇｌｅｃｌｏｎｅｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｆｏｒｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ．ＴｈｉｓｓｔｒａｉｎｃｏｕｌｄｐｒｏｄｕｃｅＬ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ１４．２７∥Ｌａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｕｎｄｅｒｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗｉｔｈｏｕｔｂｅｉｎｇｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．ＧｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｏｆｓｔｒａｉｎＳＷ０３７０ｗａｓｖｅｒｙｓｔａｂｌｅ．（３）ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｎｇａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｎｇａｎｄａｄｊｕｓｔｉｎｇｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｋｅｙｅｎｚｙｍｅＴｈｒｅｏｎｉｎｅＤｅｈｙｄｒａｔａｓｅｉｎｓｔｒａｉｎＳＷ０３７０ｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｏｎｔｈｅｂａｓｅｏｆｔｈｏｓｅ，ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｉｅｒｅｎｔＬ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｍｉｎｏａｃｉｄｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈａｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅａｌｓｏｒｅｖｉｅｗｅｄ．（４）ＴｈｅｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｓｔｒａｉｎＳｗ０３７０ｊｎｓｈａｋｅｆｌａｓｋｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｉｎｔｈｉｓｔｈｅｓｉｓ．Ｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｒｏｔａｔｉｏｎｃｏｍｐｏｓｉｔｅｄｅｓｉｇｎｏｆｑｕａｄｒａｔｉｃｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｆｅｄｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｅｒｅａｌｓｏｓｔｕｄｉｅｄ．ＵｎｄｅｒｔｈｅＯｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｓｔｒａｉｎＳＷ０３７０ｃｏｕｌｄｐｒｏｄｕｃｅＬ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｆｏｒ９６ｈｏｕｒｓｂｙｆｌａｓｋ—ｓｈａｋｉｎｇｆｅｄｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．２１．９６９／ＬａｆｔｅｒＴｈｅｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｉｓｔｈｅｓｉｓｉｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｆｉｅｌｄｏｆＬ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｃｏｎｔｒｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗａｓｔｈａｔｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｕｓｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｈａｄｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｐｐｌｉｅｄｔｏｂｒｅｅｄａｎＬ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｈｉｇｈ—ｙｉｅｌｄｉｎｇｓｔｒａｉｎＳＷ０３７０，ｗｈｏｓｅｋｅｙｅｎｚｙｍｅＴｈｒｅｏｎｉｎｅＤｅｈｙｄｒａｔａｓｅ’Ｓａｄｊｕｓｔｉｎｇｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ，ｗｈｉｃｈｗｏｕｌｄｂｅｇｏｏｄａｔｍｏｒｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｓＯＮＬ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｂｒｅｅｄｉｎｇ．ＴｈｅｓｔｒａｉｎＳＷ０３７０ｃｏｕｌｄｐｒｏｄｕｃｅＬ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ２１．９６∥Ｌａｆｔｅｒｆｅｄｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｙｆｌａｓｋ—ｓｈａｋｉｎｇｆｏｒ９６ｈｏｕｒｓ，ｗｈｉｃｈｈａｄｒｅａｃｈｅｄｔｈｅａｄｖａｎｃｅｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｌｅｖｅｌｏｆｔｈｅｓａｍｅｒｅｓｅａｒｃｈｉｎＣｈｉｎａ．ＴｈｅｓｔｒａｉｎＳＷ０３７０ｈａｄｈａｄａｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｐｒｏｄｕｃｉｎｇｉｎｆｅｒｍｅｎｔｏｒ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ，ＰｒｏｔｏｐｌａｓｔＦｕｓｉｏｎ，ＴｈｒｅｏｎｉｎｅＤｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｆｅｄｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．ＩＩ．天津科技大学硕士学位论文１．前言１．１引言Ｌ一异亮氨酸系在１９０４年经Ｅｈｒｌｉｃｈ首先从甜菜糖浆分离出来，以后又从多种蛋白质的胰酶水解物所制得【１］ｏＬ－异亮氨酸（Ｌ．Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ），化学名为Ｂ一甲基一ａ．氨基戊酸，其结构式与立体结构式分别见图１－１和图１．２。
发酵法生产L_异亮氨酸的研究进展
发酵法生产L 2异亮氨酸的研究进展3李光霞 李宗伟 陈林海 汪杏莉 李宗义 秦广雍(郑州大学离子束生物工程省重点实验室,郑州,450052)摘 要 L 2异亮氨酸作为必需氨基酸之一,广泛应用于医药、食品和饲料等领域。
发酵法是目前生产L 2异亮氨酸最主要的方法。
文中分别从L 2异亮氨酸的生产方法、生物合成及其代谢调控、代谢调控育种、发酵工艺的控制、提取精制方法、国内外生产现状等6个方面,对发酵法生产L 2异亮氨酸的研究进展进行了综述。
关键词 发酵法,L 2异亮氨酸,生物合成,代谢调控,工艺控制 第一作者:硕士研究生(陈林海为通讯作者)。
3国家973课题(2004C B719604)资助 收稿日期:2005-09-30 异亮氨酸(22amino 232methylvaleric acid )由Ehrlich于1904年首次从甜菜糖浆中分离出来,其化学组成虽与亮氨酸相同,但理化性质各异,故命名为异亮氨酸。
异亮氨酸有4种光学异构体,自然界中存在的仅为L 2异亮氨酸。
哺乳动物体本身不能合成L 2异亮氨酸,所以,作为人体必需的8种氨基酸之一,成年人每天需要从外界摄取20mg/kg (体重)的L 2异亮氨酸。
L 2异亮氨酸是合成人体激素、酶类的原料,具有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果,在人体生命活动中起着重要作用,因此,在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。
食品方面,主要用于食品强化,使各种氨基酸平衡,提高食品的营养价值。
在医药方面,3种支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)组成的复合氨基酸输液以及大量用于配置治疗型特种氨基酸的药物,如肝安、肝灵口服液,对治疗脑昏迷、肝昏迷、肾病等具有显著疗效,并可取代糖代谢而提供能量,是比较昂贵的氨基酸原料药之一[1]。
近年来的研究表明,L 2异亮氨酸是一种高效的β2防御素表达的诱导物,在诱导上皮防御素表达上起着重要作用,作为一种免疫刺激物,对粘膜表面的防御屏障在临床上将起到重要的支持作用[2]。
L-异亮氨酸发酵的研究
L-异亮氨酸发酵的研究何家骏1材料及设备斜面培养基、摇瓶种子培养基(略)。
1.1一级种子培养基(%)葡萄糖6.5，碳酸钙5.0，玉米油0.4，硫酸铵2.5，硫酸亚铁0.004g/100ml，硫酸锰0.004g/100ml，磷酸二氢钾0.35，灭菌后pH值为6.5～6.8。
1.2二级发酵培养基(%)葡萄糖15，硫酸铵5.0，碳酸钙5.0，硫酸锰0.008g/100ml，硫酸亚铁0.004g/100ml，硫胺素240μg/100ml，生物素30μg/10ml灭菌后pH值6.0至6.5。
1.3设备摇瓶机2台，一级种子罐600L2台，补糖罐2000吨2台，油罐150L1台，发酵罐2000L2台，氨水计量罐200L1台。
721分光光度计1台，旋光计1台，分析天平1台，25型酸度计2台。
2种子罐代谢考察在无菌室内，取少许菌种接入摇瓶中，放在摇瓶机上，培养20～24h，并瓶，接入种子罐。
步骤如下：2.1罐温33～35℃。
2.2通气通入40～50℃无菌空气，流量用进气阀门调节，开始稍为小开，8h后全开。
又可以用进气与排气阀门调节，(因没装流量计)。
2.3培养周期种子罐培养周期20～24h。
2.3.1种子罐内菌体代谢变化(1)pH值培养24h后，pH稍有下降，然后再稍有回升。
(2)糖代谢培养过程中，糖逐渐消耗，24h稍有回升。
(3)氨基氮培养24h后，氨基氮稍有回升。
2.3.2菌体外观变化摇瓶培养液接入种子罐后进行培养，开始种子液为乳白色，培养20h，转乳黄色，24h后逐渐转为浅黄色。
即可移入发酵罐。
3发酵的代谢变化利用压差法，将种子液无菌移入发酵罐，发酵按下列条件掌握。
3.1罐温32～33℃。
3.2通气通入40～50℃无菌空气，用进、排气阀门根据菌种生长情况，随时调节。
3.3发酵周期44～48h。
3.4补糖培养12h后，开始第1次补糖，全发酵过程补7～8次糖，每次补入100L。
3.5pH值发酵过程中，用氨水调解，12h，开始通入氨水，每8h通入15～25L，培养30h后，氨水用量下降，36h后，停止通入氨水，L-异亮氨酸发酵代谢曲线如附图：附图L-异亮氨酸发酵代谢曲线4小结从代谢曲线可知，全程用氨水调解，掌握pH值与氨基氮变化，开始通入氨水时，发酵液pH值即上升，但很快被菌体吸收及利用，pH值迅速下降。
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第31卷第4期 2001年12月工业微生物Industrial Microbiology Vol.31No.4 Dec.2001作者简介:张伟国(1963～),男,博士,副研究员。
L -异亮氨酸分批发酵动力学模型的研究张伟国, 陈 坚, 伦世仪(江南大学生物工程学院,江苏无锡214036)摘 要 对黄色短杆菌L -异亮氨酸高产菌XQ -4(AHV r AEC r Suc g SG r Eth r α-AB r IleHx r )分批发酵动力学模型进行了研究。
建立了比较合理的L -异亮氨酸分批发酵动力学模型,为L -异亮氨酸补料分批发酵最优化的研究奠定基础。
关键词:L -异亮氨酸; 分批发酵; 动力学模型; 黄色短杆菌 目前,国内外L -异亮氨酸全部采用发酵法生产,因而发酵水平的高低基本决定了其产品的成本。
提高发酵水平有两条途径:一是选育优良的生产菌种;二是采用与生产菌种相匹配的最佳培养条件和控制手段。
前者是建立在代谢控制理论上的菌种选育技术;后者是建立在生化工程基础上的发酵过程控制技术。
国内长期以来把氨基酸发酵的研究重点放在菌种选育上,对其发酵动力学模型的研究较少,从而影响了对发酵过程的控制,以至于目前基本上还完全依赖于手工控制。
本研究在对L -异亮氨酸高产菌XQ -4菌体生长和产物形成不同阶段动力学和发酵数据进行分析的基础上,建立了比较合理的分批发酵动力学模型,为补料分批发酵最优化的研究奠定了基础。
1 材料与方法1.1 供试菌种 L -异亮氨酸高产菌XQ -4(AHV r AEC r Suc g SG r Eth r α-AB r IleHx r )[1]。
1.2 培养基 种子培养基(g/L ):葡萄糖,25;(N H 4)2SO 4,5;KH 2PO 4,1;MgSO 4・7H 2O ,0.5;玉米浆,40mL/L ;CaCO 3,10。
发酵培养基(g/L ):葡萄糖,50～170;(N H 4)2SO 4,5;KH 2PO 4,1;MgSO 4・7H 2O ,0.5;玉米浆,21mL/L 。
1.3 培养条件 斜面活化24h ;种子在31±1℃下振荡培养12～13h 。
2L 发酵罐中装液量为1.2L ,接种量为10%,温度控制在31～32℃,通风比1:1～3,流加氨水控制p H 值,搅拌转速根据要求而定。
1.4 分析方法 菌体浓度:吸取0.2mL 菌液到5mL 0.25mol/L HCl 溶液中,摇匀,采用721分光光度计,1cm 光程,562nm 测定OD 值。
所得的OD 值与吸光度———菌体干重曲线对照,计算出菌体浓度。
还原糖:菲林试剂滴定法。
L -异亮氨酸:纸上层析法、比色定量法及氨基酸自动分析仪测定。
1.5 发酵设备 瑞士INFOR 2L 台式发酵罐,发酵液溶氧自动显示、温度和p H 自动控制。
2 结果与讨论2.1 L -异亮氨酸分批发酵动力学模型2.1.1 菌体生长模型 目前应用最广泛、形式较为简单的微生物生长动力学模型仍然是Monod 提出的经验模型[2]:μ=d X d t =μmax XSK s +S(1) 对XQ -4菌株的动力学特性进行了研究,结果表明在底物(葡萄糖)限制的条件下,菌体生长符合Monod 方程,并且计算出μmax =0.265h -1,K s =0.789g/L 。
很明显,Monod 方程是对菌体生长的简单化描—31—述。
菌体生长过程中存在高浓度底物的抑制、代谢产物的反馈抑制和阻遏、营养物扩散限制而导致菌体生长迟缓等现象[3]。
在分批发酵过程开始时,底物浓度均维持在较高水平,当残糖浓度<8～10g/L 时意味着发酵结束,可见在分批发酵中葡萄糖对菌体生长的限制作用不可忽略不计,故不宜用Monod 方程来描述分批发酵的菌体生长模型。
μ=μmax (1-X X m ax)X(2) 式(2)为逻辑(logistic )模型,能很好地反映分批发酵过程中因菌体浓度的增加对自身生长存在的抑制作用,这在分批发酵中是普遍存在的。
当菌体浓度很低即发酵刚开始时,X 比X max 小得多,X/X max 项可忽略不计,表示菌体呈指数生长;当X =X max 时,表示菌体停止生长。
在对XQ -4进行分批发酵研究时,发现菌体生长有一最大饱和浓度;提高初糖浓度将造成菌体的比生长速率下降,这就证明了当底物浓度较高时,底物对菌体生长存在抑制作用。
关于底物对菌体生长的抑制作用可用Andrews 模型[4]来表达:μ=μmax11+K s /S +S /K iX ≈μmaxS K s +S 11+S /K iX(3) 一般在分批发酵中S >>K s ,故式(3)可简化如下:μ=μmax11+S /K iX(4) 抑制物的积累而引起菌体比生长速率下降可用下式来表示:μ=μmax (1-aI )(5) 式(5)中I 表示抑制物的浓度。
结合(4)和(5)两式,得菌体的生长模型如下:μ=μmax11+S /K i(1-aI )X(6) 假定抑制物的浓度与菌体比生长速率的下降呈线性关系,即a ≌常数,又假定抑制物的生成速率与菌体的生长速率成正比,则:d I d t =b d Xd t(7) 若以t =0时,I =0为初始条件进行积分,得I=b (X -X 0),将其代入式(6)得式(8):μ=μmax11+S/K i{1-ab (X -X 0)}X=μm ax11+S/K i(1+abX 0)(1-abX1+abX 0)X (8) 假定μmax (1+abX 0)≌K ,(1+abX 0)/ab ≌X max ,则式(8)可简化为:μ=KX (1-XX max )11+S /K i(9) 假定K ≈μ3max ,代入上式(9),得分批发酵中菌体生长模型如下[5]:μ=μ3max X (1-XX max )11+S /K i(10)2.1.2 产物生成模型 产物形成动力学模型中较为通用的模型是由Luedeking &Piret 在描述乳酸发酵所提出的数学表达式[6]:π=d P d t=αμ+βX(11) 虽然上述模型是为乳酸发酵生产而提出来的,但Ollis 等证明这一模型同样对胞外多糖及其它多种产物的发酵都适用[7]。
L -异亮氨酸发酵属于二类发酵,但从Luedeking &Piret 方程中反映不出底物葡萄糖对产物形成的影响。
Bajpai 曾提出一个底物非竞争抑制模型用来描述青霉素发酵的产物形成,该模型能很好地解释了高浓度底物对青霉素形成的抑制作用[8]。
宫衡在其赖氨酸发酵中提出如下产物形成模型[5]:π=K (S S +K sp )(11+S /K ipX(12) 本文将其进一步简化,得如下产物形成模型:π=KSK sp +S (1+S /K ip)X(13) L -异亮氨酸发酵不同于青霉素发酵,但高浓度葡萄糖对产物形成的抑制作用确实是存在的。
研究表明,发酵中后期维持较低的葡萄糖浓度有利于L -异亮氨酸的高产和稳产。
因此为了能反映出底物葡萄糖对L -异亮氨酸发酵的抑制作用,结合Ba 2jpai 方程和Luedeking &Piret 方程,建立如下的产物形成动力学模型:—41— 第4期 工 业 微 生 物第31卷 π=K 1μ+K 2SK sp +S (1+S /K ip)X (14)2.1.3 底物消耗模型 在分批发酵时,如果限制性底物是碳源,则消耗掉的碳源中一部分生成细胞物质,一部分形成产物,一部分产生能量供细胞维持生命活动之用。
σ=-d S d t =1Y x μ+1Y pπ+m X(15)2.1.4 分批发酵动力学模型参数 以(10)、(14)和(15)式分别对分批发酵菌体生长曲线、产物生成曲线和底物消耗曲线进行拟合。
根据实际测得的数据,采用Mathematica 软件和SAS 统计软件,进行非线性规划,求得各个参数,结果见表1。
Y x 、Y p 为底物转化为菌体和产物的真实转化率,对于XQ -4菌株而言其值分别为0.499g/g 和0.379g/g ,经拟合计算出m 值为0.112。
表1 L -异亮氨酸分批发酵动力学模型参数取值参数μ3max X max K i K 1K 2K spK ip Y x Y p m数值0.35017.71500.1600.2009.9024.20.4990.3790.112 表2为初糖浓度138g/L 时动力学模型计算值与实验值的比较。
从表2可看出,用动力学模型拟合L -异亮氨酸分批发酵过程除极个别点外,一般误差均小于5%。
表2 动力学模型计算值与实验值的比较培养时间(h )菌体浓度(g/L )实验值 计算值产物浓度(g/L )实验值 计算值底物浓度(g/L )实验值 计算值0 2.0 2.1001381388 3.6 3.50.20.313413516 6.6 6.4 1.1 1.3127127249.89.7 3.1 3.21161183213.413.2 6.5 6.3991014016.115.89.79.881824816.917.013.713.659615617.617.718.317.640396417.717.821.521.023217217.617.723.523.488 2.2 分批发酵动力学模型的适用范围 在建立分批发酵动力学模型的过程中,参数的求解和模型的验证是基于初糖浓度为138g/L 条件下进行的,因此有必要在更广的初糖浓度范围内对模型的适用性进行考察。
图1不同初糖浓度时L -异亮氨酸分批发酵的实验值与模型计算值比较(图中虑线表示实验值,实线表示模型计算值)。
从图中可看出该模型对初糖浓度100～150g/L 时L -异亮氨酸分批发酵拟合较好;当初糖浓度50g/L 、170g/L 时,该模型计算值与实验值除个别点有较大的偏差外,其余也不太大。
因此,在不同底物浓度范围内该模型有良好的适应性。
图1 不同初糖条件下实验值与模型计算值比较—51— 第4期张伟国,等:L -异亮氨酸分批发酵动力学模型的研究第31卷 2.3 分批发酵动力学模型分析2.3.1 初糖浓度对产物形成速率的影响 综合式(10)和(13),产物形成速率如下:d P d t ={K 1μmax 11+S /K i+K 2SK sp +S (1+S /K ip )}X =KX(16) 由式(16)可看出,维持较高的菌体浓度对产物形成是有利的。
菌体生长,大约需要35.5g/L 的葡萄糖(以X max =17.7g/L ,Y x =0.499g/g 计)。
实际发酵中,由于产物合成和菌体生长需要,获得高浓度菌体的初糖浓度要大于这个值。
初糖浓度过低,会造成菌体浓度X 下降,使得产物形成速率下降;但初糖浓度过高又会造成K 的下降,使得产物形成速率下降。