定量PCR
定量pcr的方法
定量pcr的方法定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是一种在实验室中常用的分子生物学技术，旨在定量测定DNA或RNA分子的相对丰度。
本文将详细介绍定量PCR的原理、操作步骤以及应用领域。
一、定量PCR的原理定量PCR的原理基于聚合酶链反应（PCR）技术，该技术通过复制模板DNA 或RNA分子的特定片段来实现特异性扩增，从而产生大量复制产物。
在定量PCR 中，引入一种特定的荧光探针，该荧光探针与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的数量与初始模板分子量成正比，因此可以通过测量荧光信号的强度来定量PCR产物中的特定DNA或RNA分子序列的相对丰度。
二、定量PCR的操作步骤1. 制备PCR反应体系：将反应缓冲液、模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶、核苷酸和水混合制备反应体系。
反应体系中的核苷酸是用来提供DNA 或RNA的基本成分。
2. 热循环条件设置：选择合适的PCR仪，并设置合适的热循环条件。
热循环的三个步骤包括变性、退火和扩增。
3. 变性步骤：将反应体系加热至高温，通常为94-98，使DNA或RNA解性，即DNA双链分离，RNA变性为单链，使模板分子可供扩增。
4. 退火步骤：降低温度到引物特异性结合的温度，引物会与模板分子特异性结合，这通常在50-65之间进行。
5. 扩增步骤：将退火的反应体系加热至合适的温度，通常为72，此时聚合酶开始合成新的DNA链，延伸引物。
该步骤重复多次，每次扩增会产生两倍数量的DNA或RNA分子。
6. 荧光检测：在PCR反应进行过程中，荧光探针会与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的强度与扩增产品的数量成正比。
7. 数据分析：使用特定的软件来分析荧光信号数据，将其转化为反应物的初始模板浓度。
可以通过比较不同样本的荧光信号强度来定量比较DNA或RNA的相对丰度。
定量PCR 简介
定量PCR简介聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是微量核酸扩增的有效工具，由于其灵敏、特异、快速等优点，在医学上已广泛应用与病毒、细菌病原体及遗传病、肿瘤的早期诊断。
随着PCR技术的发展，特别是病毒或肿瘤的治疗监测、疾病的诊断、机体基因表达调控方面，不仅需要检测其存在是否；而且还需要得知扩增前标本中的模板的数量，因而必须对PCR进行定量检测，即定量PCR技术，本文将对定量PCR的定量原理、技术类型以及相关进展方面综述如下：一、定量PCR的基本原理：在PCR实验条件下（Mg++、缓冲液、Taq酶、dNTP、引物、模板），经变性→退火→延伸的一个循环，引物在退火阶段与相应的模板结合，在延伸阶段进行复制，此时产物为：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n个PCR循环后PCR产物的分子数；Yn-1:为n-1个热循环后PCR产物的分子数；Ev:为扩增效率,0≤Ev≤1；若n个热循环中其Ev是一致的话，经n个循环后的扩增产物的分子数（Y）和反应物中原始分子数（X）之间关系，可描述为：Y=x×(1+ Ev)n。
1. 终点法定量原理：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同的前提下，根据扩增产物的量可以计数出反应物中原始分子数，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即：lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数)2. 实时检测法定量原理：在最佳实验、相同Ev以及相同扩增产物的情况下，反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)3. 扩增效率（Ev）的影响因素：以上所述的定量原理均假定反应体系中扩增效率是不变，但是，实际上，Ev在不同的扩增管之间和同一扩增管的不同循环次数之间是不同，如何控制及解决Ev的变异以及标本制备的可靠性是PCR定量的可靠性所在，也是定量PCR的发展方向，那么，Ev的影响因素有：a. 引物和靶序列的结合能力（G+C%及突变），扩增产物的长度，G+C含量。
定量PCR方法及数据分析
定量PCR方法及数据分析定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于测量特定DNA序列的相对数量。
它可以广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因拷贝数和染色体异常等研究领域。
本文将阐述定量PCR的基本原理，实验步骤和数据分析方法。
定量PCR的基本原理是依赖于DNA的扩增过程。
PCR反应需要一对引物，它们特异性地结合在目标DNA序列的两端，通过加热使DNA解旋，然后在适当的温度下引物与目标DNA序列互补结合，在酶的催化下进行扩增。
每一轮的PCR扩增会使目标DNA数量成指数型增加。
由于每一个目标序列的扩增效率可能不同，因此需要标准曲线来进行定量。
定量PCR的实验步骤分为两个阶段：前PCR和qPCR。
前PCR是标准曲线的制备阶段，通过将已知浓度的目标DNA进行PCR扩增，然后根据PCR产物的浓度制备一系列浓度梯度的DNA模板。
qPCR是主要实验阶段，将待测样品与合适的引物和探针（可选）混合，在PCR仪中进行扩增反应。
PCR反应后，根据荧光信号的强度，以及标准曲线计算得出待测样品中目标DNA的相对数量。
对于数据分析，常用的方法有相对定量和绝对定量两种。
相对定量是将待测样品与对照样品进行比较，计算出相对表达量。
这需要选择一个内部参考基因（housekeeping gene），其表达在不同条件下稳定不变。
通过将待测基因和内部参考基因的Ct值（cycle threshold）相减，得出差值。
差值较大表示待测基因表达高，差值较小表示待测基因表达低。
这种方法的优点是操作简单，但存在引物和探针设计的问题，以及内部参考基因选择的问题。
因此，有时候也需要进行多个内部参考基因的选择。
绝对定量是根据标准曲线计算待测样品中目标DNA的绝对数量。
标准曲线可以通过前PCR阶段制备的一系列DNA模板进行构建。
通过将已知浓度的DNA模板进行qPCR测定，得到Ct值和浓度之间的标准曲线。
pcr产物做qpcr定量
pcr产物做qpcr定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
在PCR反应中，目标DNA序列会被扩增成多个复制的DNA分子，形成所谓的PCR产物。
PCR产物的定量是分子生物学研究中的一个重要环节，可以通过qPCR（Quantitative PCR）来实现。
一、qPCR定量原理和步骤qPCR是一种在PCR过程中同时进行扩增和定量的技术。
其基本原理是通过标记DNA分子的荧光信号来测量PCR产物的数量，从而实现对目标DNA序列的定量。
下面是qPCR定量的基本步骤：1. 样本制备：提取待测DNA样本，并进行适当的纯化和稀释。
2. 制备qPCR反应体系：将待测DNA样本与引物（primers）、荧光探针（probe）以及其他反应组分（例如DNA聚合酶）加入到PCR 反应管中。
3. qPCR反应条件设置：设置合适的PCR反应条件，包括温度、时间和循环次数等参数。
4. 扩增反应：在热循环仪中进行PCR扩增反应，使DNA模板得以扩增。
5. 荧光信号检测：在每个循环的末尾，测量PCR反应管中的荧光信号强度。
6. 数据分析：根据荧光信号的强度和PCR循环数，计算并分析PCR产物的起始模板数量。
二、PCR产物提取及纯化在进行qPCR定量前，需要从PCR反应中提取和纯化PCR产物。
这可以通过以下步骤完成：1. 结束PCR反应：根据设定的PCR反应循环数，让PCR反应完成。
2. 加入测序级别水：在PCR反应管中加入等体积的测序级别水，使总体积增加。
3. 酶切引物：加入适当的酶切酶和引物，同时进行酶切反应。
这一步可以去除引物和非特异性扩增产物的多余部分。
4. 纯化PCR产物：通过柱式纯化或其他适当的方法，将目标PCR产物从反应体系中纯化出来。
三、qPCR定量结果分析qPCR定量结果的分析通常基于标准曲线法。
标准曲线由一系列已知浓度的DNA标准样品构建而成。
定量PCR实验要素
定量PCR实验要素定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种用于定量测定DNA或RNA的特定序列的方法。
它是PCR技术的一种变体，主要用于精确测量目标序列的拷贝数目。
定量PCR实验包括一系列要素，下面将详细讨论每个要素的重要性和相关注意事项。
一、试剂和材料准备：在定量PCR实验中，准备好高质量的试剂和材料至关重要。
首先是DNA或RNA样本，要保持其完整性和纯度，避免外源性污染。
其次是引物（primers）和探针（probes），引物是用于扩增特定序列的短DNA片段，探针则通常是带有荧光染料的DNA分子，用于检测扩增产物。
确保引物和探针的设计与目标序列匹配，并优化其工作条件。
此外，还需要合适浓度的dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和聚合酶（polymerase），以及缓冲液、MgCl2等。
所有试剂的保存条件和使用日期要符合要求，避免因质量问题导致实验结果的不可靠性。
二、样本预处理：样本的预处理是定量PCR实验的重要步骤。
DNA样本一般需要提取和纯化，以去除潜在的抑制物质和杂质。
RNA样本则需要进行逆转录反应，将RNA转化为可供PCR扩增的DNA。
在这个步骤中，需要注意确保样本的完整性、纯度和一致性，避免预处理过程中的失误和污染。
三、PCR扩增条件优化：PCR扩增条件的优化对于定量PCR实验至关重要。
合适的扩增温度、时间以及引物和探针的浓度，可以最大程度地提高PCR扩增反应的效率和特异性。
温度梯度反应（temperature gradient PCR）是优化PCR条件的一种常用方法，通过在不同温度下进行PCR反应，确定最佳的温度条件。
此外，聚合酶和引物的选取也非常重要，要选择高度特异性的聚合酶和合适的引物。
四、内标和质控：为了准确测量PCR扩增产物的数量，通常需要引入一个内标（internal standard）作为参照物。
内标是一个与目标序列类似的DNA片段，它的拷贝数目已知，并与目标序列一起扩增和检测。
定量pcr的名词解释
定量pcr的名词解释引言：随着科学技术的不断发展，分子生物学领域的研究取得了长足的进展。
其中，定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术作为一种用于快速、敏感和准确测定特定DNA序列数量的方法，成为了该领域中最重要的分子生物学工具之一。
本文将对定量PCR的原理、应用和优势进行阐述，并探讨其在医学、生态学和食品安全等领域中的重要性。
1. 定量PCR的原理定量PCR是基于传统PCR技术的基础上进行改进而成的，它通过不断倍增特定DNA序列来实现对目标DNA的定量测定。
相较于传统PCR，定量PCR引入了一种特殊的荧光探针，这种荧光探针可以结合到PCR反应体系中的目标DNA序列上，并释放出荧光信号。
2. 定量PCR的应用2.1在医学领域中的应用定量PCR技术在医学领域具有广泛的应用价值。
例如，在疾病的早期诊断中，可以利用定量PCR技术快速检测出少量的病原体DNA，从而提高疾病的准确性。
此外，在肿瘤学研究中，定量PCR技术也被用于检测肿瘤标志物的表达水平，既可以评估肿瘤的发展程度，又可以指导治疗方案的制定。
2.2在生态学研究中的应用定量PCR技术在生态学研究中的应用也越来越受到关注。
与传统的实验室方法相比，定量PCR技术可以更快速、准确地测定环境中某一种类的特定基因在不同时期的丰度变化，进一步研究生态系统的结构和功能。
这项技术在生物多样性保护和生态系统健康评估方面有着重要的推动作用。
2.3在食品安全中的应用食品安全一直是人们关注的焦点，定量PCR技术在食品安全中的应用也备受重视。
比如，生产商可以利用定量PCR技术检测食品中的病原微生物，从而确保食品质量的安全性；政府部门也可以通过定量PCR技术对食品中的农药残留、转基因成分和掺杂品等进行快速检测和准确测定。
3. 定量PCR的优势3.1 高度灵敏和快速相比传统的PCR技术，定量PCR具有更高的灵敏度和检测速度。
其可以在短时间内对样本进行高通量的定量检测，且能够有效避免由于实验误差带来的不确定性。
定量pcr标准曲线
定量pcr标准曲线定量PCR标准曲线。
定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）是一种用于测定DNA或RNA在样本中的相对数量的技术。
在定量PCR实验中，标准曲线是非常重要的，它可以用来确定目标DNA或RNA的绝对数量，为实验结果的准确性提供保障。
本文将介绍定量PCR标准曲线的建立方法及相关注意事项。
1. 标准曲线的建立。
建立标准曲线的第一步是准备一系列已知浓度的标准样品。
这些标准样品应该覆盖你感兴趣的浓度范围，并且要有一定的间隔，以便构建出一个完整的曲线。
接下来，将这些标准样品进行PCR扩增，得到相应的Ct值（threshold cycle）。
然后，根据每个标准样品的Ct值和其对应的已知浓度，可以绘制出标准曲线。
一般来说，标准曲线是一个对数线性关系，其斜率和截距可以用来计算未知样品的浓度。
2. 注意事项。
在建立标准曲线的过程中，有一些注意事项需要特别关注。
首先，标准曲线的标准样品要尽量准确地反映出实际样品的特点，包括GC含量、长度等。
其次，PCR扩增的条件要尽量一致，包括反应体系、温度循环程序等。
此外，要注意避免批次效应，即不同批次的实验可能会有一定的差异，需要进行标准化处理。
最后，要保证实验过程中的准确性和重复性，避免实验误差对标准曲线的影响。
3. 应用。
建立了标准曲线之后，就可以用它来对实际样品进行定量PCR分析了。
首先，将待测样品进行PCR扩增，得到其Ct值。
然后，根据标准曲线，可以通过插值的方法计算出待测样品的目标分子浓度。
通过这种方式，可以快速、准确地获得实验样品中目标分子的数量，为后续的实验分析提供可靠的数据支持。
总结。
定量PCR标准曲线的建立是定量PCR实验中的关键步骤，它直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
在建立标准曲线时，需要注意选择合适的标准样品、保证PCR扩增条件的一致性、避免批次效应和实验误差的影响。
建立了标准曲线之后，可以用它来对实际样品进行定量PCR分析，快速、准确地获得目标分子的数量。
定量pcr原理
定量pcr原理定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种利用DNA聚合酶链式反应技术量化检测目标DNA数量的方法。
该方法基于DNA的反链合成原理，通过多次反复复制目标DNA序列，将其扩增到可检测范围。
定量PCR主要包括准备试剂、反应体系的构建、PCR扩增条件的优化和PCR产物的检测四个步骤。
首先，准备试剂包括模板DNA、引物（前向引物和反向引物）、DNA聚合酶、dNTP（即四种脱氧核苷酸）、缓冲液和MgCl2等。
其次，构建反应体系。
通过将模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和MgCl2混合，得到PCR反应液。
引物是特异性序列，可与目标DNA的两个端点互补结合，成为PCR反应的开始和结束点。
然后，优化PCR扩增条件。
这涉及到温度条件和PCR循环数的调整。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，PCR反应液在高温下使目标DNA双链解离为两条单链；在退火步骤中，引物与目标DNA的单链以互补碱基配对的方式结合；在延伸步骤中，DNA聚合酶将dNTP加入到引物的5'端扩增产物的3'端，从而合成一个新的DNA链。
最后，检测PCR产物。
这可以通过凝胶电泳、荧光定量PCR或实时定量PCR等方法进行。
实时定量PCR是一种通过荧光信号实时监测PCR反应进程的方法，可以准确地测量PCR产物的数量。
根据荧光信号的增加，可以定量计算出起始DNA 模板的数量。
总的来说，定量PCR是一种可靠且高敏感的方法，可以准确地测量目标DNA的数量。
它在医学诊断、基因表达研究、遗传学分析等领域具有广泛的应用价值。
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。通常由5个点组成，模板的浓度分别为107/ml、106/ml、105/ml、 104/ml、103/ml。
• 相对定量
各样本间表达倍数差异分析
绝对定量分析
标准曲线 未 知 样 品 的 C(t) 值 定量
斜率与扩增效率
• SYBR Green I
Donor dye (Reporter)
TaqMan® Probes
Acceptor dye (Quencher)
Unbound probe free in solution
Light Energy transfer Taq Light Emission or Heat
荧光定量PCR常用概念
• Dissociation curve(融解曲线)：在使用SYBR Green染料进行实验， 需要分析融解曲线，以识别不同的产物。 原始数据：
SYBR染料的热淬灭 染料的热淬灭
SYBR染料从双链产物解离 染料从双链产物解离
基线
Tm(融解温度 ：此温度有 融解温度)：此温度有50%的双链产物解链 融解温度 的双链产物解链
Calibrator：
将各未知样本与对照样本进行比较， 将各未知样本与对照样本进行比较，得出目的 基因（ 基因（GOI）在各样本的相对表达水平。 ）在各样本的相对表达水平。 对照样本多取用未经处理的样本或是时间零点 的样本。 的样本。
相对定量分析
Calibrator Sample Ct
目的基因
Ct
荧光定量PCR常用概念
• Dissociation curve(融解曲线) 求导数据
目的产物
Tm(融解温度 融解温度) 融解温度
荧光定量PCR常用概念
• Dissociation curve(融解曲线) 引物二聚体和非特异性扩增
目的产物 引物二聚体/ 引物二聚体 非特异性扩增
常见定量分析方法光定量PCR常用概念
Baseline（基线） （基线）
Threshold（阈值） （阈值）
C(t)
荧光定量PCR常用概念
• Baseline(基线)：在PCR开始几个循环内所发散的 荧光信号，这段时间内定量PCR仪器还未能检测 到PCR产物的扩增，缺省设置为3-15个循环的荧 光信号。 （背景荧光信号) • Threshold(阈值)：用来确定Ct的荧光强度。是在 荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定 在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光 域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差 的 10 倍。 • Ct：到达阈值荧光信号所需要的循环数。
荧光化学原理
染料法：SYBR Green I
探针法：taqman
分子信标 FRET
SYBR Green I dye
ssDNA + free dye (weak fluorophore)
非特异性结合， 非特异性结合，包括引物二聚 体、非异性扩增片断 进行融解曲线分析
dsDNA = Binds minor groove (intense fluorophore)
• 为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和5个 标准品，每个样品都平行做2个复孔。 在做荧光定量实验时要注意些什么呢？ • 在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替 换）、一次性移液器吸头（带滤嘴自卸式），并不能用手 直接触摸毛细管、离心管吗底部。 • 操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常 用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。每次实验前后用10% 次氯酸和70%乙醇擦拭移液器、操作台。 • 配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体 都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用 振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低 速离心数秒，避免产生气泡。
绝对定量分析
R very close to 1(≥0.985)
Eff.应介于 应介于90%～110%； 应介于 ～ ； Eff.过小：抑制因素、引物条件 过小： 过小 抑制因素、 Eff.过大：加样错误、探针降解 过大： 过大 加样错误、
相对定量分析
Normalizer（看）：
纠正因取样量、 抽提、 纠正因取样量、RNA抽提、逆转录效率的不同 抽提 引起的误差 一般选用看家基因
Probe and primer bind target
特异性强，只结合靶位置 特异性强，
Light Light Emission
可进行等位基因分型、 可进行等位基因分型、多 重反应
Taq
Taq extends and hydrolyzes probe, donor dye free to emit fluorescence --> accumulation of --> signal
GOI与Normalizer扩增效率相当 与 扩增效率相当 (∆Eff. ≤5%) ∆
Relative Quantity = 2- ∆ ∆ CT
相对定量分析方法
目的基因与内参基因的扩增效率是否相近 (≤5%)?
NO YES
标准曲线法
∆∆Ct method ∆∆
相对定量分析
标准曲线法
• 计算目在对照样本和各未知样本的Ct • 计算看在对照样本和各未知样本的Ct • 目的相对表达水平 =目的倍数差异(未知样本/对照样本) 看的倍数差异(未知样本/对照样本)
1ul 12.5ul 0.375ul 2.5ul 8.625ul 25ul 56度30S 40循环 72度30s 做溶解曲线 上机
95度10min，95度30S
实时荧光定量PCR原理及应用 原理及应用 实时荧光定量
普通PCR 普通
普通PCR 普通
Time consuming PCR, 制胶, 上样, 泡胶, 染色, 软件分析 Endpoint detection 终产量不能反映起始浓度的大小，i.e. 小量模板+过量的 i.e. + Taq和dNTPs在平台期的量与大量模板+不足量的Taq和 dNTPs相差无几。
Real time PCR
定义
传统PCR基础上加入荧光基团，利用荧光信号积累对PCR反应的过程 基础上加入荧光基团，利用荧光信号积累对 传统 基础上加入荧光基团 反应的过程 进行实时监控
目的
对起始模板进行精确定量
优点
灵敏度, 精确度, 重复性, 灵敏度 精确度 重复性 动态范围
应用
基因定量, 病原微生物侦测, 检测， 基因定量 病原微生物侦测 GMO检测，SNP分型等 检测 分型等
实时荧光定量PCR定义 定义： 定义
在PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号累积实现了实时监测 整个PCR进程，对起始模板进行定 量分析的方法。
与普通PCR的区别 的区别 与普通
• 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
• 实时定量PCR技术：
实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起 始模板进行定量。
看家基因
Ct
Ct
相对定量分析
• ∆ ∆ CT 法
目相对表达水平 = 目与看的倍数差异(未知样本) 目与看的倍数差异(对照样本)
∆CT(sample) = CT (目) - CT (看) ) (目 (看 ∆CT(calibrator) = CT (目) - CT (看) (目 (看 ∆∆ CT = ∆ CT (Sample) - ∆ CT (Calibrator) ∆
实验步骤
• 1.6 ng/ul质粒DNA
依次4倍稀释成 0.4 ng/ul 0.1 ng/ul 0.015625 ng/ul 5个浓度 质粒DNA 2xbuffer 参比荧光 GAPDH引物（2uM) dd H20 0.25 ng/ul 0.0625 ng/ul
Strategene Brilliant II QPCR试剂盒