实时定量PCR技术原理及应用--TIANGEN
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时qPCR的基本原理是利用DNA模板进行PCR扩增，并通过特定荧光探针或抑制剂标记扩增产物，荧光信号的强度与目标模板数量成正比。
PCR扩增过程中，荧光信号逐渐累积，通过荧光检测系统实时监测荧光的强度变化，可以获取PCR扩增曲线，并通过比较样品的荧光信号与标准曲线建立一个浓度与荧光信号的转换关系，从而确定样品中目标物质的数量。
实时qPCR的操作过程通常包括以下几个步骤：1.准备反应体系：根据所需扩增物质选择合适的引物和探针，并根据样品数量和扩增条件计算所需反应体系的配方。
反应体系中通常包括DNA模板、引物、探针、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶等。
2.设定PCR程序：根据不同引物的特性和样品的要求，设置PCR程序。
PCR程序通常包括一个初始变性步骤，多个循环变性/退火/延伸步骤和一个终止步骤。
循环变性/退火/延伸步骤的温度和时间通常根据引物的需求进行设定。
3.反应体系装填：将反应体系装入PCR管或耐热反应板中，确保样品和反应物均匀分布。
4.实时监测：将PCR反应体系置于实时荧光PCR仪中，根据设定的PCR程序进行扩增，并实时监测荧光信号的累积变化。
5.数据分析：根据荧光信号的变化情况，可以绘制PCR扩增曲线，并通过计算荧光信号的阈值周期数（Ct值）来确定样品中目标物质的相对数量。
比较不同样品的Ct值，可以进行定量分析。
实时qPCR具有广泛的应用。
1.基因表达分析：可以通过实时qPCR检测特定基因在不同组织或样品中的表达水平，从而研究基因在生理和病理过程中的作用。
2.病原体检测：实时qPCR可以用于快速、准确地检测和鉴定病原体，如细菌、病毒和寄生虫等，对于临床诊断和流行病学研究具有重要意义。
3.检测基因突变：实时qPCR可以用于检测个体中基因突变的存在与否，并进行基因型分析，从而研究与疾病相关的突变和遗传变异。
4.微生物学研究：可以通过实时qPCR检测微生物的数量和动态变化，了解其在环境中的分布和生物地理学特征，以及其在食品安全、环境保护等方面的应用。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
•理想的PCR反应：
•
X=X0*2n
•非理想的PCR反应：
•
X=X0 (1+Ex)n
• n：扩增反应的循环次数
• X：第n次循环后的产物量
• X0：初始模板量 • Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
在扩增产物达到阈值线时:
设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数
利用TaqMan法
数据分析
检测血液中的HBV
分析结果： HBV DNA的精确copy数为3.7X105
TaqMan法
应用范围
起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 SNP分析
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
3、Molecular Beacon
4、Amplisensor
R
实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法
SYBR Green
SYBR Green 法
工作机理
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
Flourescenc
定量原理
Ck 102
Sample
Ck 104
Cycle number
Cycle number
Log of DNA concentration
SYBR Green 法 ------------PCR反应的建立
反应体系的建立及优化: 1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不
实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用
实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用引言实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种基于PCR技术的分子生物学方法，可用于精确测量目标DNA或RNA的数量。
该技术在许多领域得到了广泛的应用，如医学诊断、基因表达分析、病原体检测以及环境监测等。
一、实时荧光定量PCR技术的原理实时荧光定量PCR技术基于PCR反应过程中，目标DNA（或RNA）序列的指数级扩增特性。
该方法需要引物与目标序列相互结合，合成适量的荧光探针用于监测PCR过程中目标序列的扩增程度。
其中，引物是起始特异性扩增的核酸片段，荧光探针含有荧光染料和荧光阻断剂。
当探针结合至目标序列时，就会被5'→3'外切酶降解，并释放荧光信号，实时监测PCR反应进程。
二、实时荧光定量PCR技术的优势1. 高灵敏度和高精确度：实时荧光定量PCR技术通过荧光信号的动态监测，可准确测量目标序列的扩增数量。
其灵敏度能够达到单个拷贝级别，且可靠性高，消除了传统PCR中间断性的'瓶颈'效应。
2. 快速和高通量：相比传统PCR技术，实时荧光定量PCR所需的时间更短，反应速度快。
通过多重PCR反应孔，可以同时测定多个样品，提高了检测效率。
3. 广泛的应用范围：实时荧光定量PCR技术不仅适用于基因表达、基因突变和SNP（单核苷酸多态性）的检测，还可用于病原体的检测和定量，如病毒感染、细菌感染等。
4. 可靠的检测结果验证：通过内参基因和集成阳性对照，可以消除检测结果偏差，确保检测结果的准确性和可靠性。
三、实时荧光定量PCR技术的应用1. 医学诊断：实时荧光定量PCR技术在临床医学诊断中具有很大的潜力，可用于早期肿瘤标志物、病原体和遗传疾病的检测与定量。
例如，可通过检测突变基因来判断特定癌症患者对某些药物的敏感性，从而为精准化治疗提供依据。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR技术的原理及应用在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。
但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。
但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。
例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。
在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。
1.实时荧光定量PCR技术的基本原理在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。
简述实时荧光定量PCR技术的原理
简述实时荧光定量PCR技术的原理
实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）是一种用于检测和定量DNA或RNA的方法。
它结合了传统的PCR技术和荧光探针技术，可以实时监测PCR反应的进程，并根据荧光信号的强度来确定目标物质的数量。
实时荧光定量PCR的原理如下：
1. PCR反应体系：反应体系中包含目标DNA或RNA模板、引物（一对用于扩增目标序列的寡核苷酸片段）、荧光探针和酶。
荧光探针通常由一个与目标序列互补的序列和一个带有荧光物质和荧光物质猝灭物质的序列构成。
2. 扩增过程：PCR反应通过一系列的温度循环来进行。
首先是变性步骤，将DNA 或RNA模板变性为单链。
然后是退火步骤，引物与目标序列互补结合。
最后是延伸步骤，酶在合适的温度下合成新的DNA链。
3. 荧光信号检测：在PCR反应过程中，荧光探针与目标序列的结合会导致荧光信号的释放。
荧光信号的强度与目标序列的数量成正比。
实时荧光定量PCR系统可以实时监测荧光信号的强度，并记录下来。
4. 分析和定量：通过实时荧光定量PCR系统记录的荧光信号强度曲线，可以确定PCR反应的阈值周期数（CT值）。
CT值表示在达到阈值信号强度时，PCR 反应的循环数。
根据CT值，可以计算出目标序列在初始反应体系中的起始数量。
实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、突变分析等领域。
实时荧光定量PCR的原理及应用
实时荧光定量PCR的原理及应用导读实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光集团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。
其特点有：(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。
(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。
Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。
实时荧光定量PCR技术的基本原理在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。
仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。
并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。
一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。
通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。
方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R²＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。
实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
实时荧光定量PCR技术的应用1. 基因工程研究领域①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA 水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用引言实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种细胞遗传学和分子生物学研究中常用的分子检测技术。
它能够迅速、准确地进行DNA或RNA的定量测量，并在许多领域中广泛应用，例如基因表达分析、病原微生物检测和病毒定量等。
本文将重点介绍实时荧光定量PCR技术的原理和一些典型应用。
实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是在传统PCR反应的基础上发展而来的一种PCR变体。
其原理可以简单概括为光信号的实时检测和荧光强度的定量分析。
实时荧光定量PCR技术的具体步骤如下：1.引物与探针设计在实时荧光定量PCR反应中，合适的引物和探针设计是至关重要的。
引物用于在反应中特异性地扩增目标DNA或RNA序列，而探针则用于荧光信号的检测。
引物和探针的设计需要确保其与目标序列的亲和力和特异性，以避免非特异性扩增和假阳性结果。
2.标定曲线制备为了进行定量分析，需要事先制备一条标定曲线。
标定曲线通常是通过浓度已知的目标序列的一系列稀释样品制备的。
这些稀释样品经过PCR扩增后，荧光信号的强度与初始浓度呈线性关系。
通过测量待测样品的荧光信号强度，并利用标定曲线进行外推，可以获得目标DNA或RNA的定量结果。
3.PCR反应体系组装PCR反应体系的组装需要考虑到引物和探针的最优浓度，以及反应缓冲液、酶和模板DNA或RNA的最佳配比。
此外，反应体系中还需要加入辅助成分，如酶抑制剂和荧光染料，以提高PCR反应的特异性和灵敏度。
4.实时荧光检测及数据分析在PCR反应进行过程中，荧光信号会随着目标DNA或RNA的扩增而增强。
实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的变化情况，并生成扩增曲线。
通过分析荧光信号的增长速度和荧光信号的峰值，可以确定目标DNA或RNA的起始浓度。
实时荧光定量PCR技术应用1. 基因表达分析实时荧光定量PCR技术在基因表达分析中被广泛应用。
简述实时定量pcr的原理和应用
简述实时定量PCR的原理和应用1. 实时定量PCR简介实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）是一种用于检测和定量DNA 或RNA的技术。
相比传统PCR技术，实时定量PCR可以快速、准确、高灵敏地测量靶分子的数量。
该技术广泛应用于生物医学研究、基因表达、疾病诊断等领域。
2. 实时定量PCR原理实时定量PCR基于传统PCR技术，通过引入荧光探针来实时监测PCR反应的进行。
其基本原理如下：•步骤1：DNA样本的准备与处理。
从待检测的样本中提取DNA，并对其进行纯化和定量。
•步骤2：引物设计和荧光探针制备。
根据目标DNA序列设计特异性引物和荧光探针。
•步骤3：PCR反应的进行。
将DNA模板与引物、荧光探针和PCR反应液混合，通过一系列的温度循环对DNA进行扩增。
•步骤4：荧光信号检测与分析。
在PCR反应过程中，荧光探针与目标DNA结合，并发出荧光信号。
荧光信号的强度与目标DNA的数量成正比，通过荧光信号的实时监测和分析，可以推断出DNA的起始量。
3. 实时定量PCR的应用实时定量PCR广泛应用于许多领域，包括：3.1 基因表达分析实时定量PCR可以定量检测基因在不同组织、不同时期、不同条件下的表达水平变化。
通过相对定量和绝对定量分析，可以研究基因的功能、调控机制及调控因子。
3.2 病原体检测实时定量PCR对病原体的检测具有高度灵敏性和特异性。
通过特异性引物和荧光探针的设计，可以快速、准确地检测病毒、细菌、真菌等病原体。
3.3 疾病诊断实时定量PCR在疾病诊断方面有广泛应用。
例如，它可以检测癌症相关基因的突变、染色体重排等变异，从而为癌症的早期诊断和治疗提供重要参考。
3.4 转基因检测实时定量PCR可以用于转基因生物的快速检测。
利用特异性引物和荧光标记的转基因探针，可以检测食品、农作物中是否存在转基因成分。
3.5 环境监测实时定量PCR可以用于环境中微生物的监测和定量分析。
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一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ℃，45 S，
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM
4、其他与常规PCR相同
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈 值时所经过的扩增循环次数
C(t) value
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实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性
起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP（单核苷酸多态性）分析
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Molecular beacon (分子信标)
优缺点
优点
高特异性：对目标序 列
检测SNP最灵敏的试 剂之一 荧光背景低
缺点
只能用于一个特定 目标 设计困难 价格比较高
实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法
SYBR Green
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SYBR Green 法
工作机理
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
SYBR Green
SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在 此阶段采集荧光信号。
实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析
荧光强度
Tm
温度
Tm值：DNA解链一半时的温度
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实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析
-dI dT
Tm
• 将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)
实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每
一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析
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实时荧光定量PCR原理定量原理
如何对起始模板定量？
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
Log of DNA concen----------PCR反应的建立
反应体系的建立及优化: 1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不
易检测 2. Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3. MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4. 反应Buffer 体系的优化 5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6. 其他与常规PCR相同
实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值
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荧光信号阈值 （threshold ）：
前15个循环信号作为荧光本底信号 （baseline），即样本的荧光背景值和阴 性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的 荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背 景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽 量选择进入指数期的最初阶段，并且保证 回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法
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实时荧光定量PCR 原理
实时原理
常 规 PCR技术：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
SYBR Green 法
优点
对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA
使用方便 -----不必设计复杂探针
非常灵敏 便宜
优缺点
缺点
容易与非特异性双链DNA结 合，产生假阳性
但可以通过融解曲线的分析， 优化反应条件 对引物特异性要求较高
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SYBR Green 法
非特异性产物
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融解曲线分析
融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确
融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧
光，因此定量不准确
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TaqMan法
优缺点
优点
对目标序列的高特异性 ------阴性结果确定
设计相对简单 ------与目标序列某一区域
互补 重复性比较好
缺点
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较
高
不易找到本底低的探针
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实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR)
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讲 座提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量技术的应用
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介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
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实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件 扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度
每个循环进行一次荧光信号的收集
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实时荧光定量PCR原理 绝对定量
确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
Sample
25
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讲 座提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
▪相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；
▪ Ct值则极具重现性
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实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
•理想的PCR反应：
•
X=X0*2n
•非理想的PCR反应：
SYBR Green 法
模板DNA量越多，荧光达到 域值的循环数越少
Log浓度与循环数呈线性关系， 根据样品Ct值，就可以计算出样 品中所含的模板量
Flourescenc
定量原理
Ck 102
Sample
Ck 104
Cycle number
Cycle number
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荧光共振能量转移（FRET） 探针与DNA杂交时产生荧光
-----变性过程：产生非特异性荧光 -----延伸过程：不产生荧光 ------退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号
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Molecular beacon (分子信标) 应用范围
实时荧光定量PCR 方法 3------- Molecular beacon 法(分子信标)
环
➢标记荧光的发夹探针
茎
荧光素 淬灭剂
➢环与目标序列互补 ➢茎由互补配对序列组成
发夹型杂交探针
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Molecular beacon (分子信标) 工作原理
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SYBR Green 法
应用范围
起始模板的测定
基因型的分析
融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一 引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
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实时荧光定量PCR 方法2 -------TaqMan法
TaqMan---水解型杂交探针
与目标序列互补
❖ 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 ❖ 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) ❖ 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 ❖ Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
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实时荧光定量PCR 原理 --------- DNA 产物的荧光标记
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
3、Molecular Beacon
800免费电话：800-810-2177
Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模 板量
800免费电话：800-810-2177
QUALITY CONTROL -EFFICIENCY CURVES
• use pcr baseline subtraction (not curve fitting default option) • set the threshold manually to lab standard • check all melting curves are OK • check slopes are parallel in log view • delete samples if multiple dilutions cross line together (usually