定量PCR基本原理
荧光定量 pcr 的基本原理和步骤
荧光定量PCR的基本原理和步骤
荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测和定量DNA或RNA分子。
其基本原理是在PCR过程中加入荧光探针，通过监测荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
下面是荧光定量PCR的基本步骤：
1. 样品处理：首先需要从待检测样品中提取DNA或RNA，并进行适当的处理，例如反转录、扩增等。
2. 设计引物：根据待检测的目标序列设计特异性引物。
3. PCR反应体系的制备：将引物、荧光探针、dNTPs、PCR缓冲液等混合，制备PCR反应体系。
4. PCR反应：将样品DNA或RNA与PCR反应体系混合，进行PCR反应。
5. 荧光定量：在PCR反应过程中，荧光探针会结合到目标序列上，并通过荧光信号的产生来检测PCR产物的数量。
在荧光定量PCR中，通常采用SYBR Green或TaqMan探针来检测PCR产物的数量。
6. 数据分析：通过对荧光信号的强度进行分析，计算出样品中目标序列的数量，并进行比较和分析。
需要注意的是，在荧光定量PCR中，需要选择合适的荧光探针和荧光信号检测系统，以确保准确和可靠的结果。
此
外，为了避免PCR过程中的污染和误差，需要严格控制PCR 反应条件和操作流程。
定量pcr的方法
定量pcr的方法定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是一种在实验室中常用的分子生物学技术，旨在定量测定DNA或RNA分子的相对丰度。
本文将详细介绍定量PCR的原理、操作步骤以及应用领域。
一、定量PCR的原理定量PCR的原理基于聚合酶链反应（PCR）技术，该技术通过复制模板DNA 或RNA分子的特定片段来实现特异性扩增，从而产生大量复制产物。
在定量PCR 中，引入一种特定的荧光探针，该荧光探针与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的数量与初始模板分子量成正比，因此可以通过测量荧光信号的强度来定量PCR产物中的特定DNA或RNA分子序列的相对丰度。
二、定量PCR的操作步骤1. 制备PCR反应体系：将反应缓冲液、模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶、核苷酸和水混合制备反应体系。
反应体系中的核苷酸是用来提供DNA 或RNA的基本成分。
2. 热循环条件设置：选择合适的PCR仪，并设置合适的热循环条件。
热循环的三个步骤包括变性、退火和扩增。
3. 变性步骤：将反应体系加热至高温，通常为94-98，使DNA或RNA解性，即DNA双链分离，RNA变性为单链，使模板分子可供扩增。
4. 退火步骤：降低温度到引物特异性结合的温度，引物会与模板分子特异性结合，这通常在50-65之间进行。
5. 扩增步骤：将退火的反应体系加热至合适的温度，通常为72，此时聚合酶开始合成新的DNA链，延伸引物。
该步骤重复多次，每次扩增会产生两倍数量的DNA或RNA分子。
6. 荧光检测：在PCR反应进行过程中，荧光探针会与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的强度与扩增产品的数量成正比。
7. 数据分析：使用特定的软件来分析荧光信号数据，将其转化为反应物的初始模板浓度。
可以通过比较不同样本的荧光信号强度来定量比较DNA或RNA的相对丰度。
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative PCR，qPCR）是一种用荧光信号量化检测PCR产物的方法，用于定量分析目标DNA或RNA的含量。
荧光定量PCR的基本原理如下：
1.引物设计：设计特异性引物，使其能够特异性地扩增目标DNA或RNA序列。
2.模板DNA或RNA的提取：从样品中提取目标DNA或RNA。
3.cDNA合成：对于RNA样品，需要首先将RNA反转录成cDNA，作为PCR 的模板。
4.Real-time PCR扩增反应：将模板DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行实时PCR扩增。
PCR反应体系中还包括核苷酸，聚合酶和缓冲液等。
5.荧光信号检测：随着PCR的进行，荧光探针被解旋成单链，释放出与之配对的荧光染料。
荧光染料产生荧光信号，信号强度与扩增产物的数量成正比。
6.荧光信号检测系统：荧光信号检测系统实时检测PCR反应体系中的荧光信号，并将其转换成数值。
7.标准曲线绘制：通过使用已知浓度的标准品进行一系列稀释，绘制出标准曲线。
标准曲线将荧光信号强度与目标DNA或RNA的初始浓度之间建立了一个标准关系。
8.样品定量：通过对样品的荧光信号强度进行测量，并使用标准曲线进行插值计算，确定样品中目标DNA或RNA的初始浓度。
荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、宽动态范围、低检测限和快速分析等优点，广泛应用于分子生物学和疾病诊断等领域。
概述荧光定量PCR技术的基本原理
概述荧光定量PCR技术的基本原理
荧光定量PCR技术是一种用于定量测量目标DNA序列数量的技术。
它基于普通PCR技术，但在PCR反应中引入了一种荧光探针，以实现对产物扩增过程的实时监测和定量测量。
实现荧光定量PCR的基本原理如下：
1. 选择适当的引物和荧光探针：引物用于特异性扩增目标DNA序列，而荧光探针用于标记并检测PCR产物的存在。
2. 引物和荧光探针的设计：引物的设计要确保特异性扩增目标DNA序列，而荧光探针通常由一个荧光染料和一个荧光淬灭器组成，荧光染料在引物与目标DNA序列结合时发荧光信号，而荧光淬灭器则抑制荧光信号。
3. PCR反应条件的设置：包括扩增温度、循环数等参数的设置，以确保高效的PCR扩增反应。
4. 实时监测PCR反应：在PCR反应过程中，荧光探针与目标DNA序列结合并发荧光信号，荧光信号的增加与PCR产物的扩增过程成正相关。
通过荧光信号的强度可以定量测量目标DNA序列的数量。
5. 分析数据：根据荧光信号的强度和扩增循环数，可以绘制荧光增幅曲线，并通过内部标准物质或标准曲线来计算目标DNA序列的浓度。
荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点，可以用于基因表达分析、突变检测、病原体检测等领域。
定量PCR基本原理及方法
FRET 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析
Ampliflour Probe，LUX 定量分析
➢ 基因型分析
利用扩增信号的种类来分型 —— Taqman 根据熔解曲线的不同来分型 —— FRET, Molecular Beacon
➢ 荧光定量PCR的定量原理
RePaCl-Rti的m理e论C方he程m：isYt=rxie×s(1+ Ev)n
Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数
1. 终点法定量原理 前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同 原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数)
R
3’
3’
3’
5’
QQQ
Q
5’
分子信标（Molecular Beacon Probe）
R ExcitatEiomnission Q
Excitation
荧光共振能量传递（FRET Probe）
Oligo 1: Fluorescein Excitation
Transfer
Oligo 2: LC Red 640 Emission
2. 实时检测法定量原理 前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同 原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比， 由此计算出标本中靶分子的准确含量，即： LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)
✓ n: 扩增循环数的确定
PCR efficiency =[10(-1/slope)]-1 Where slope=1/m
定量PCR 简介
定量PCR简介聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是微量核酸扩增的有效工具，由于其灵敏、特异、快速等优点，在医学上已广泛应用与病毒、细菌病原体及遗传病、肿瘤的早期诊断。
随着PCR技术的发展，特别是病毒或肿瘤的治疗监测、疾病的诊断、机体基因表达调控方面，不仅需要检测其存在是否；而且还需要得知扩增前标本中的模板的数量，因而必须对PCR进行定量检测，即定量PCR技术，本文将对定量PCR的定量原理、技术类型以及相关进展方面综述如下：一、定量PCR的基本原理：在PCR实验条件下（Mg++、缓冲液、Taq酶、dNTP、引物、模板），经变性→退火→延伸的一个循环，引物在退火阶段与相应的模板结合，在延伸阶段进行复制，此时产物为：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n个PCR循环后PCR产物的分子数；Yn-1:为n-1个热循环后PCR产物的分子数；Ev:为扩增效率,0≤Ev≤1；若n个热循环中其Ev是一致的话，经n个循环后的扩增产物的分子数（Y）和反应物中原始分子数（X）之间关系，可描述为：Y=x×(1+ Ev)n。
1. 终点法定量原理：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同的前提下，根据扩增产物的量可以计数出反应物中原始分子数，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即：lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数)2. 实时检测法定量原理：在最佳实验、相同Ev以及相同扩增产物的情况下，反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)3. 扩增效率（Ev）的影响因素：以上所述的定量原理均假定反应体系中扩增效率是不变，但是，实际上，Ev在不同的扩增管之间和同一扩增管的不同循环次数之间是不同，如何控制及解决Ev的变异以及标本制备的可靠性是PCR定量的可靠性所在，也是定量PCR的发展方向，那么，Ev的影响因素有：a. 引物和靶序列的结合能力（G+C%及突变），扩增产物的长度，G+C含量。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
1定量PCR基本原理
1定量PCR基本原理定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测和测量DNA或RNA分子数量的分子生物学技术。
它是常用的基因表达和检测技术。
以下是定量PCR的基本原理。
定量PCR的基本原理可以分为三个主要步骤：扩增反应、检测荧光信号和标准曲线计算。
第一步是扩增反应。
PCR反应通常在一个热循环中进行，每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤通过高温将DNA双链分离成两条单链。
然后，在退火步骤中，引物通过与目标DNA序列特异性碱基配对，使其结合到模板DNA上。
最后，在延伸步骤中，DNA聚合酶将新的DNA链合成为与模板DNA相匹配的互补链。
这个循环过程被重复多次，每个循环使得目标序列的数量翻倍，从而进一步扩增目标DNA序列。
第二步是检测荧光信号。
PCR反应中通常会引入一个特定的探针或染料，其结构包括与目标DNA序列特异性结合的引物，并带有一个发光染料和一个参考染料。
扩增反应进行时，DNA聚合酶会催化探针与模板DNA结合，并释放出发光信号。
发光信号的强度与目标DNA序列的数量成正比。
参考染料发出的信号用于校正可能因扩增反应条件变化而引起的信号差异。
第三步是用标准曲线计算目标序列的数量。
标准曲线是通过基于已知浓度的一系列标准样品构建的。
这些标准样品包含与待测样品相同的目标序列，但其浓度已知。
将标准曲线上的荧光信号强度与标准样品的浓度进行比较，可以建立一个线性关系模型。
然后，通过将待测样品的荧光信号强度与标准曲线进行比较，可以计算出待测样品中目标序列的初始浓度。
定量PCR的结果可以用于不同的应用，如基因表达研究、病原体检测、遗传病诊断等。
通过定量PCR，可以准确测量目标序列的数量，并比较不同样品之间的差异。
总结一下，定量PCR通过扩增反应、检测荧光信号和标准曲线计算三个主要步骤来定量测量DNA或RNA分子的数量。
这种技术在许多生物学研究和医学诊断中发挥着重要作用。
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线性图谱
9
指数增长期内扩增曲线具有高度重复性
96 次重复
可变的平台期
荧光信号
指数增长期内重复性好
循环数
10
定量PCR扩增曲线的各种概念
Ct 值
∆Rn
阈值线
基线
Cycles
11
什么是基线？
•基线是扩增曲线的水平部分
基线
对数图谱
基线
线性图谱
12
基线扣除
Rn
Before subtraction
DRn
Module1：实时荧光定量PCR技术原理
陈 涛
Field Application Scientist
Tel: 800 820 8982 / 400 820 8982
The world leader in serving science 1
什么是实时荧光定量PCR?
•一种实时监控核酸扩增的技术
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。
2
定量PCR如何工作?
• PCR反应液加入了
各种类型的荧光标记物
一个PCR循环
3
定量PCR如何工作?
• 在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强
PCR 产物
PCR
PCR
大量PCR产物
4
定量PCR仪如何工作?
• 所有的定量PCR仪器都有三个共同的组成部分 2. 光路系统
3. 检测器
1. 热循环模块
~520
~550 ~620
•StepOnePlus™实时荧光定量PCR系统
Channel 1 2 Dye Examples FAM™, SYBR® VIC®, JOE™ Excitation Wave Lenthgh 455~485nm 510~530nm Emission Wave Lenthgh ~520 ~550
激发光
激发光
能量
荧光共振能量转移，FRET
20
变性 (95º C)
21
退火 (60º 7
?
28
5′-3′外切酶活性 水解探针，使报告基团和淬 灭基团分离
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
53
SYBR® Green I 染料
54
SYBR® Green I作用机理
55
SYBR® Green I作用机理
56
SYBR® Green I作用机理
57
实时记录每个循环后荧光信号的变化
荧光 循环数
58
SYBR® Green I 方法的局限性
任何双链，非特异结合
非特异产物信号
不准确结果
59
•ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统
Channel 1 2 3 4 5 6 Dye Examples FAM™, SYBR®, SYTO®9 (MeltDoctor™), Fluorescein, SYPRO® Orange VIC®, JOE™, TET™, HEX™ NED™, BODIPY® TMR-X，TAMRA™ ROX™, Texas Red® LIZ™ Alexa Fluor®, Joda-4 Excitation Wave Lenthgh 455~485nm 510~530nm 540~550nm 570~590nm 630~650nm 650~670nm Emission Wave Lenthgh ~520nm ~550nm ~580nm ~620nm ~680nm ~710nm
After subtraction
13
什么是阈值？
•阈值是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线
阈值 阈值线 阈值 阈值线
对数图谱
线性图谱
14
什么是Ct值？
•Ct值是阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴上的值
对数图谱
Ct
Ct
线性图谱
15
如何使用Ct值计算结果?
绝对定量 相对定量
Ct values 0 1 2 3 4 5 6 7 Log copy number
46
47
48
Burp !
49
实时记录每个循环后荧光信号的变化
荧光
循环数
50
荧光标记组合
报告荧光: 6-FAM、JOE、VIC、NED、CY3、Texas Red、CY5 淬灭荧光: MGB-NFQ、TAMRA、BHQ 参比荧光: ROX
常用的荧光组合： FAM VIC NED ROX
目的基因1 目的基因2/内对照 目的基因3 参比荧光
51
荧光染料组合
•StepOne™实时荧光定量PCR系统
Channel Dye Examples Excitation Wave Lenthgh Emission Wave Lenthgh
1
2 3
FAM™, SYBR®
VIC®, JOE™ ROX™, Texas Red®
455~485nm
510~530nm 570~590nm
16
定量PCR的化学原理
17
两种化学方法
TaqMan探针法 染料法
18
TaqMan探针法
•TaqMan水解探针：5′ 端 荧光报告基团 与靶基因特异性结合的序列
3′ 端 荧光淬灭基团
报告基团
淬灭基团
19
TaqMan水解探针作用机理
•完整的探针： 检测不到报告荧光 •切断的探针： 检测到报告荧光
通过熔解曲线检查产物特异性
• Tm值： DNA的双螺旋结构打开一半时的温度。
荧光
温度
60
单一PCR产物的熔解曲线
荧光
温度
61
多个PCR产物的熔解曲线
非特异扩增 引物二聚体
62
Questions ?
63
3
4
NED™，TAMRA™
ROX™, Texas Red®
540~550nm
570~590nm
~580
~620
52
荧光染料组合
•7500实时荧光定量PCR系统
Channel 1 2 3 4 5 Dye Examples FAM™, SYBR® VIC®, JOE™ NED™, Cy3，TAMRA™ ROX™, Texas Red® CY5 Dye™ Excitation Wave Lenthgh 455~485nm 510~530nm 540~550nm 570~590nm 630~650nm Emission Wave Lenthgh ~520 ~550 ~580 ~610 ~650
5
定量PCR如何工作?
• 每个循环结束后,定量PCR仪器通过光学系统记录荧光信号的增
加
循环1 滤光片 A 样品 1 Level:
6
定量PCR如何工作?
• 最后,定量PCR软件计算出数据，用于实验结果的分析
7
定量PCR的数学原理
8
PCR动力学曲线和四个阶段
平台期
线性增长期 指数增长期 基线期
对数图谱