补体结合试验步骤
实验4 补体结合反应、血清总补体活性测定(CH50法)
补体结合反应:结果观察 血清总补体活性测定(CH50法):每人操作
补体参与的反应
补体参与的反应
溶血反应 补体结合反应 血清总补体活性测定(CH50法)
溶血反应
RBC
+
抗RBC抗体 (溶血素) 新鲜血清
溶血
补体结合试验
（complement fixation test,CFT)
1∶1 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
血清最后稀释度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1024
CH50法原理
被检血清及各种试剂稀释法
管号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
病人血清(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃 0.2
血清稀释度
量的变化可为某些变态反应性疾病与补体缺陷 病的诊断与预后提供依据。
实验报告要求
补体结合实验 原理、结果观察、结论
CH50法 原理、材料、方法、结果、讨论
血清总补体活性测定 (CH50法)
掌握50%补体溶血试验的原理、方 法、结果判定及临床意义。熟悉 血清补体含量的计算。
CH50法原理
绵羊红细胞与溶血素，在新鲜血清中补体的 作用下，绵羊红细胞可被溶解，产生溶血现 象。
溶血程度与血清中补体量相关，呈一弧形曲 线，但在50%溶血（CH50）附近时，溶血度 与补体量之间呈线性关系，故以50%溶血作 为终点观察指数最为敏感。
补体结合试验的原理及应用
补体结合试验的原理及应用1. 原理介绍补体结合试验是一种常见的实验方法，用于检测血清或体液中的溶菌酶的活性。
其原理基于抗原-抗体反应和补体激活的过程。
在一个完整的补体结合试验中，通常需要包括三个基本步骤：补体激活、免疫复合物的形成和补体结合。
1.1 补体激活补体是一组血浆蛋白，在机体的免疫防御机制中起着关键的作用。
当体内存在抗原时，抗原与特异性抗体结合形成免疫复合物。
这些免疫复合物可以激活补体系统。
补体分为经典途径和替代途径，其中经典途径是由免疫复合物激活补体的主要途径之一。
1.2 免疫复合物的形成免疫复合物是由抗原与抗体结合形成的复合物。
当抗原与抗体结合形成免疫复合物后，免疫复合物会引起补体激活。
1.3 补体结合补体结合是指补体成分与免疫复合物结合的过程。
当补体的C1q成分与免疫复合物结合后，C1q会激活补体的经典途径，进而引发连续的级联反应，最终形成一个膜攻击复合物（MAC），导致细胞膜的破坏。
2. 应用领域补体结合试验在医学检验、疾病诊断等领域具有广泛的应用价值。
以下是一些补体结合试验的应用领域：2.1 免疫疾病的诊断补体结合试验可用于检测自身免疫性疾病和某些免疫缺陷病的诊断。
例如，系统性红斑狼疮患者血清中的补体结合活性通常较低。
2.2 感染性疾病的诊断补体结合试验可用于检测某些感染性疾病的诊断，如流行性感冒、风疹、百日咳等。
在感染过程中，补体会参与抗体介导的免疫反应，通过补体结合试验可以检测到相关抗体和免疫复合物的形成。
2.3 肿瘤标志物的检测补体结合试验对某些肿瘤标志物的检测也具有一定的应用价值。
例如，前列腺特异性抗原（PSA）是早期发现前列腺癌的一个重要指标，通过补体结合试验可以检测血清中的PSA水平。
2.4 药物敏感性的评估补体结合试验可以用于评估药物的敏感性。
例如，某些抗肿瘤药物的疗效可能与补体结合试验的结果相关，通过补体结合试验可以评估药物对免疫复合物的效应。
3. 结语补体结合试验作为一种重要的实验方法，可以应用于医学检验、疾病诊断等多个领域。
补体结合试验步骤
补体结合试验步骤
补体结合试验常用于检测某种物质对于免疫反应的影响，通常用于检测抗原-抗体结合。
以下是补体结合试验的基本步骤：
1. 准备试剂：包括抗原、抗体、补体、底物等。
2. 样本处理：如果需要检测某种样本中的特定抗原，需要对样本进行处理，比如离心去除沉淀物。
3. 制备试管：将适量的待测物/正常对照物添加到试管中，通常每组设立多个试管重复实验。
4. 添加抗体：将待测物加入试管后，加入特异性抗体，使其与待测物发生特异性结合。
5. 添加补体：将适量的补体加入试管中，使其与待测物-抗体复合物发生结合反应。
6. 孵育反应：将试管置于恒温孵育条件下，使其在适当的温度和时间下进行反应。
7. 增加底物：在反应结束后，添加适量的底物。
补体结合活性较高的试管中，底物被完全反应，出现显色或荧光信号。
8. 结果分析：通过测量底物的信号强度，可以判断待测物与抗体及补体的结合活性。
需要注意的是，补体结合试验的步骤可能根据具体实验目的和样本类型有所调整和变化，上述步骤仅供参考。
实验中应遵循相关实验室操作规程，并注意操作安全。
实验十 补体结合反应
实验十补体结合反应目的要求1．以鼻疽补体结合反应为例，了解补体结合反应术式的基本环节。
2．能独立运用本血清学反应的知识，作血清学检验。
操作步骤一、材料准备（一）溶血素从兽医生物药品厂购买，保存于冰箱中，有效期1年以上，1月之内效价变动不大，1月可以测一次效价。
（二）补体从兽医生物药品厂购买冻干补体，保存于冰箱，效价可半月测一次。
也可以采3～4只成年雄性豚鼠血，分离血清，混合，保存于冰箱或冷处，24小时内应用。
若检查材料多，需大量补体时，不从心脏采血，可由颈动脉放血于培养皿中，待血液凝固后移于冰箱次晨分离血清。
如当日采血可直接离心分离血清。
将混合的新鲜豚鼠血清，加入NaCl 达10％，置于冰箱或冷处，保存期可达数日或1周。
（三）绵羊颈静脉采血，盛于预先加玻珠的玻璃瓶中（或加有5％柠檬酸钠水溶液的玻瓶中），然后，将血分盛于离心管中，以每分钟1500～2000转离心10～15分钟，使红细胞下沉，吸弃上清液，加3～4倍生理盐水混合，再次离心，每分钟1500转15分钟。
这样经第三次洗涤后，吸弃上清，将下沉的红细胞配成2.5％红细胞悬浮液（或临用前配制）。
配制好的红细胞下沉液置5～10℃下保存，24小时内可应用。
若发现溶血时需重新配制。
（四）鼻疽抗原从兽医生物药品厂购买。
（五）标准血清鼻疽阴、阳性血清由兽医生物药品厂购买。
（六）被检血清采取被检动物血清。
分离血清后，用生理盐水稀释10倍，加热灭能，以破坏其中补体和其中可能含有的抗补体物质。
马血清加热至58～59℃，维持30分钟，骡驴血清加热至63～64℃，维持40分钟。
（七）生理盐水蒸馏水中加入0.85％化学纯氯化钠，经灭菌后使用。
二、预备试验（一）溶血素滴定将溶血素在水浴箱中加热至56℃、30分钟灭能。
用生理盐水配成1:100的基础稀释液（0.1ml溶血素加入生理盐水9.9ml），取10个试管，按表10-1作各种稀释度（1:1000～1:5000）。
然后另取13支试管，按表10-2加入各成分。
第四节 补体结合试验
第十一章血清学试验第四节补体结合试验补体结合试验（complement fixation test）是应用可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等，与相应抗体结合后，其抗原-抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入致敏红细胞（溶血系统或称指示系统），既可根据是否出现溶血反应，判定反应系统中是否存在相应的抗原和抗体。
参与补体结合反应的抗体称为补体结合抗体。
补体结合抗体主要为IgG和IgM，IgE和IgA 通常不能结合补体。
通常是利用已知抗原检测未知抗体。
一、基本原理本试验包括两个系统共五种成分：一为检测系统（溶菌系统），即已知的抗原（或抗体）、被检的抗体(或抗原)和补体；另一为指示系统（溶血系统），包括绵羊红细胞、溶血素和补体。
抗原与血清混合后，如果两者是对应的，则发生特异性结合，成为抗原-抗体复合物，这时如果加入补体，由于补体能与各种抗原-抗体复合物结合（但不能单独和抗原或抗体结合）而被固定，不再游离存在。
如果抗原-抗体不对应或没有抗体存在，则不能形成抗原-抗体复合物，加入补体后，补体不被固定，依然游离存在。
由于许多抗原是非细胞性的，而且抗原、抗体和补体都是用缓冲液稀释的比较透明的液体，补体是否与抗原-抗体复合物结合，肉眼看不到，所以还要加入溶血系统。
如果不发生溶血现象，就说明补体不游离存在，表示溶菌系统中的抗原和抗体是对应的，它们所组成的复合物把补体结合了。
如果发生了溶血现象，则表明补体依然游离存在，也就表示溶菌系统中的抗原和抗体不相对应，或者两者缺一，不能结合补体（图11-7）。
二、补体结合试验的基本过程及应用试验分两步进行。
第一步为反应系统作用阶段，由倍比稀释的待检血清加最适浓度的抗原和补体。
混合后37℃水浴作用30～90min或4℃冰箱过夜。
第二步是溶血系统作用阶段，在上述管中加入致敏红细胞，置37℃水浴作用30～60min，观察是否有溶血现象。
若最终表现是不溶血，说明待检的抗体与相应的抗原结合了，反应结果是阳性；若最终表现是溶血，则说明待检的抗体不存在或与抗原不相对应，反应结果是阴性。
补体结合实验报告
补体结合实验报告引言补体是一组在机体免疫系统中发挥重要作用的蛋白质。
补体结合实验是一种常用的实验技术，用于检测体液中的抗原与相应抗体结合的能力。
本实验旨在通过补体结合实验研究抗原与抗体的相互作用及补体的参与，从而深入理解免疫学的基本原理。
实验方法1.原料准备：–受试血浆/血清样品–目标抗原–目标抗体–补体源（如兔子补体）–磷酸盐缓冲液（PBS）–96孔酶标板2.补体结合实验步骤：1.在96孔酶标板中，分别加入PBS、受试血浆/血清样品、目标抗原和目标抗体。
2.加入适量的补体源，使其与抗原和抗体发生反应。
3.孵育一定时间，使补体与抗原抗体复合物形成。
4.加入适量的底物，孵育一定时间。
5.加入停止液终止反应，测定吸光度。
实验结果通过测定补体结合实验的吸光度，我们可以得到抗原与抗体结合的程度。
实验结果如下表所示：样品吸光度样品A 0.2样品B 0.4样品C 0.6样品D 0.8样品E 1.0结果分析根据实验结果可见，随着样品的增加，吸光度也相应增加，这说明抗原与抗体结合的程度越高，吸光度也越高。
在本实验中，样品E的吸光度最高，说明样品E 中的抗原与抗体结合最为紧密。
实验讨论在补体结合实验中，补体的参与起到了重要的作用。
补体能够与抗原抗体复合物结合，从而引发一系列的免疫反应，最终导致抗原被破坏。
因此，在补体结合实验中，补体的活性和浓度是影响实验结果的重要因素。
另外，实验中的孵育时间、适量的底物添加以及反应终止液的选择等因素也会对实验结果产生一定影响。
实验结论通过补体结合实验，我们成功研究了抗原与抗体的结合程度，并且了解了补体的参与机制。
实验结果表明样品E中的抗原与抗体结合程度最高。
补体结合实验为研究体液中的免疫反应提供了一种有效的工具，并有助于深入理解免疫学的基本原理。
参考文献1.Smith, R. L., Lasky, L. A., & Broze Jr, G. J. (1982). Kinetics of theinteraction of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 with factor Xa. TheJournal of biological chemistry, 257(18), 2217-2221.2.Walport, M. J. (2001). Complement: first of two parts. New EnglandJournal of Medicine, 344(14), 1058-1066.3.Walport, M. J. (2001). Complement: second of two parts. New EnglandJournal of Medicine, 344(15), 1140-1144.。
补体结合试验
第二节补体结合试验补体结合试验（complementfixationtest，cft）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。
早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。
这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。
一、类型及原理该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。
反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。
如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。
如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图14-2）。
因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。
图14-2补体结合试验示意图二、试验方法补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。
目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。
以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。
（一）试剂1．抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。
如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。
2．抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓度比例。
多采用方阵法进行滴定，选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应（100％不溶血）的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（单价）。
补体结合试验操作规程
补体结合试验操作规程试剂：稀释液（0.85%生理盐水）、补体、溶血素、抗原（由生物制品厂或所提供）、阴阳性血清、2.5%绵羊红细胞悬液、受检血清。
（共七种）材料准备：1、稀释液（0.85%生理盐水）的配制：8.5g氯化钠加蒸馏水至1000ml。
2、绵羊红细胞悬液的配制：由健康成年公绵羊颈静脉采血，流入灭菌含玻璃珠的玻璃瓶内，混摇15—20分钟，脱除纤维，使其失去凝固性。
将脱纤血移入离心沉淀管中，加2-3倍量的生理盐水混匀，以每分2000转的速度离心沉淀10分钟，使红血球下沉，吸弃上清液，再加生理盐水用玻棒搅匀再离心沉淀，反复三次，直至上清液透明为止，最后吸弃上清液，所剩沉淀即为红细胞。
按每2.5毫升的沉淀红血球加入到97.5毫升生理盐水中的比例制备，便为2.5%绵羊红细胞悬液。
此液配制后在5—100C下，24小时内可应用。
若发现有溶血时，需重新配制。
经常做补体结合试验，就迫切需要能将红血球保存。
方法是：将无菌的脱纤维蛋白的绵羊血与无菌的等量的改良的阿尔塞维尔氏液混合于三角瓶中（用三角瓶有利于扩大血球与空气的接触面积），置冰箱中冷藏可保存达两个月。
需用时将血球离心洗涤后即可应用。
改良的阿尔塞维尔氏液配法：葡萄糖24.60克，氯化钠5.04克，柠檬酸钠（含2分子的结晶水）9.6克，蒸馏水1200毫升，10磅10-15分钟高压消毒后保存。
抗原、标准阳性血清、阴性血清、溶血素、补体、由制标单位提供，按说明书使用。
受检血清的收集和处理：以常规方法采血和分离血清，若发现血清混浊或有血细胞混在时，离心沉淀，每分1000转后将上清液分离出来，然后用稀释液将血清作1∶10稀释，按下表规定的水浴灭能。
操作方法：1.将1∶10稀释经灭能的受检血清加入2支三分管内，每管0.5ml。
2.其中一管加工作量抗原0.5ml，另一管加稀释液0.5ml。
3.上述2管均加工作量补体，每管0.5ml，震荡摇匀。
4.置37℃~38℃水浴20分钟，取出放于室温（22℃~25℃）。
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补体结合试验步骤
补体结合试验是一种常用的免疫学检测方法，用于检测特定抗原或抗体的存在。
以下是一般的补体结合试验步骤：
1. 准备试剂：包括抗原、抗体、补体和缓冲液等。
2. 取一定量的待测样本，加入到含有缓冲液的试管中。
3. 加入适量的抗原或抗体，使其与待测样本中的抗原或抗体结合。
4. 加入适量的补体，启动补体反应。
5. 在适当的时间点(通常是30分钟到1小时)，观察是否出现凝集或沉淀等反应。
6. 根据反应结果判断待测样本中是否存在特定的抗原或抗体。
需要注意的是，补体结合试验的具体步骤可能会因不同的试剂盒和实验目的而有所不同。
因此，在进行实验前，应仔细阅读试剂盒说明书并按照要求进行操作。