实验4 补体结合反应、血清总补体活性测定(CH50法)
实验4 补体结合反应、血清总补体活性测定(CH50法)
补体结合反应:结果观察 血清总补体活性测定(CH50法):每人操作
补体参与的反应
补体参与的反应
溶血反应 补体结合反应 血清总补体活性测定(CH50法)
溶血反应
RBC
+
抗RBC抗体 (溶血素) 新鲜血清
溶血
补体结合试验
（complement fixation test,CFT)
1∶1 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
血清最后稀释度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1024
CH50法原理
被检血清及各种试剂稀释法
管号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
病人血清(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃 0.2
血清稀释度
量的变化可为某些变态反应性疾病与补体缺陷 病的诊断与预后提供依据。
实验报告要求
补体结合实验 原理、结果观察、结论
CH50法 原理、材料、方法、结果、讨论
血清总补体活性测定 (CH50法)
掌握50%补体溶血试验的原理、方 法、结果判定及临床意义。熟悉 血清补体含量的计算。
CH50法原理
绵羊红细胞与溶血素，在新鲜血清中补体的 作用下，绵羊红细胞可被溶解，产生溶血现 象。
溶血程度与血清中补体量相关，呈一弧形曲 线，但在50%溶血（CH50）附近时，溶血度 与补体量之间呈线性关系，故以50%溶血作 为终点观察指数最为敏感。
临床免疫学检验第五版课后题重点(可打印修改)
第四章1.杂交瘤技术原理：以聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫后能产生抗体的小鼠脾细胞与能在体外长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）选择性培养基的作用，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得机能产生所需单克隆抗体又能长期体外繁殖的杂交瘤细胞系。
将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，可从小鼠腹水中得到高效价的单克隆抗体。
2.细胞株冻融的原则：快冻慢融。
目前均采用液氮保存杂交瘤细胞。
细胞放入液氮前需要逐步降温，如果冻存管放置于-80摄氏度低温冰箱过夜后再放入液氮中，可长期保存。
复苏细胞时，冻存管取出后，立即37摄氏度水浴，使之融化。
第五章1.凝集反应：是指细菌和红细胞或红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗体）的颗粒性载体与相应抗体（或抗原）特异性结合后，在适当电解质存在下，出现肉眼可见的凝集现象。
直接凝集反应：在适当电解质参与下，细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原直接与相应抗体结合后出现肉眼可见的凝集现象，称为~。
间接凝集反应：可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体（如正常人O型红细胞、细菌、胶乳颗粒等）的表面，然后与相应抗体（抗原）作用，在适宜的电解质存在条件下出现特异性凝集现象，称为~。
其敏感度高于直接凝集反应和沉淀反应。
正向间接凝集反应：用可溶性抗原致敏载体以检测标本中的待检抗体。
反向间接凝集反应：用特异性抗体致敏载体以检测标本中的待检抗原。
间接凝集抑制反应：用抗原致敏的载体颗粒及相应的抗体作为诊断试剂，检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。
2.抗人球蛋白试验的类型及其原理。
原理：Coombs试验又称抗人球蛋白试验，用于检测红细胞不完全抗体，其原理是：不完全抗体多半是7S的IgG类抗体，能与相应的抗原牢固结合，但因其分子量较小，体积小，不能起到桥联作用，在一般条件下不出现可见反应，利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞表面抗原结合的特异抗体，可使红细胞凝集。
医学检验·检查项目：血清总补体活性(CH50)_课件模板
内容课件模板
医学检验·各论：血清总补体活性（CH50） >>>
别名： 血清总补体测定。
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简介：
补体具有溶解靶细胞、促进吞噬、参 与炎症反应等功能，同时补体还在免疫调 节、清除免疫复合物、稳定机体内环境、 参与变态反应及自身免疫性疾病起关键性 作用。总补体活性和单个补体成分含量的 变化，对某些疾病的诊断和疗效观察具有 重要意义。总补体的测定主要反映补体经 传统途径活化的活性程序。临床上常用试 管法测定。
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相关疾病： 炎、类风湿性关节炎肾损害、链球菌感染 后的急性肾小球肾炎。
谢谢！
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临床意义：
增高见于急性炎症感染、组织损伤、 风湿热急性期、结节性动脉周围炎、皮肌 炎、心肌梗死、伤寒、多发性关节炎、癌 肿等。 降低见于急性肾小球肾炎、膜增 殖性肾小球肾炎、系统性红斑狼疮(SLE) 活动期、类风湿关节炎、病毒性肝炎、慢 性肝病、亚急性细菌性心内膜炎、遗传性 血管神经性水肿等。
医学检验·各论：血清总补体活性（CH50）验·各论：血清总补体活性（CH50） >>>
相关检查： 血清补体C6含量、血清补体C1q、血清补 体旁路途径活性、自身免疫性疾病14项。
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相关症状： 低补体血症、关节疼痛、斑疹、疲劳、发 热、血管性水肿。
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CH50测定(精)
故采用50％溶血作为终点指标要比100％溶 血敏感的多，这一方法称为补体50％溶血 试验（complement hemolysis 50％ assay），简称为CH50。
以引起50%溶血所需的最小补体量为一个 CH50单位，由此可以计算出待测血清中总 的补体溶血活性，以U/ml表示。
主要试剂与器材
成的致敏红细胞可激活补体，从而导致 SRBC溶解。 当致敏红细胞的浓度一定时，在规定的反
应时间内，溶血程度与补体的活性成正相
关，但不是直线关系，为典型的S形曲线。
在轻微溶血和接近完全溶血时，补体量的 变化不能使溶血程度有显著改变，即溶血 对补体量的变化不敏感。
在半溶血（50％溶血）上下时曲线最陡， 即使补体含量仅有较小变动时，溶血程度 也会发生较大的改变，也就是说对补体量 的变化非常敏感。
结果判断方法
将各反应管经2500r/min、5min离心后，先用目
测法观察其溶血程度，并与50％溶血标准管比较， 选择与标准管最接近的两管。
再用分光光度计于波长542nm进行比色测定。以
BBS缓冲液为空白对照，校正零点，找出吸光度
与标准管最接近的一管，根据该管的血清用量，
求出总补体溶血活性。
溶血素 2％SRBC pH7.4 巴比妥缓冲液（BBS） 待测血清、蒸馏水 离心机、试管、吸管、恒温水浴箱、分光 光度计、比色杯等
实验步骤
1.稀释待测血清：吸取待测血清0.2ml，加 BBS3.8ml，将血清1：20稀释（已完成）。
2.正式实验
取10只试管，分别编号，按照下表加入各试剂
血清总补体溶血活性测定
概述
补体是存在于血清中的一组不耐热的具有酶活性 的球蛋白。 补体是抗体发挥溶细胞或溶菌作用的补充条件。 在正常情况下，补体含量相对稳定，但在某些疾 病时可发生变化。
血清总补体实验报告
一、实验目的1. 了解血清总补体活性的检测原理和方法。
2. 掌握血清总补体活性（CH50）测定的操作步骤。
3. 通过实验结果，分析血清总补体活性的临床意义。
二、实验原理血清总补体活性（CH50）是指补体在经典途径中活化的程度。
在CH50测定中，补体通过激活C1～C9等补体成分，使红细胞发生溶血。
通过测定溶血程度，可以评估血清总补体活性。
三、实验材料1. 试剂：溶血素、兔抗羊红细胞抗体、生理盐水、5%羊红细胞悬液、2.5%巴比妥缓冲液、CH50标准品。
2. 仪器：恒温水浴箱、分光光度计、移液器、试管、试管架等。
四、实验方法1. 标准曲线绘制：将CH50标准品用生理盐水稀释成一系列浓度，分别加入5%羊红细胞悬液，37℃水浴30分钟，测定吸光度（A542nm）。
以CH50浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定：取待测血清样本，用生理盐水稀释成一定浓度。
按照标准曲线绘制的方法，测定吸光度（A542nm）。
3. 结果计算：根据标准曲线，计算出待测血清样本的CH50活性。
五、实验结果1. 标准曲线绘制：根据实验数据，绘制标准曲线。
2. 样品测定：待测血清样本的吸光度为X。
3. 结果计算：根据标准曲线，计算出待测血清样本的CH50活性为Y。
六、讨论与分析1. 血清总补体活性（CH50）测定原理及方法：CH50测定是一种常用的检测补体活性的方法，通过测定红细胞溶血程度，评估血清总补体活性。
2. 实验结果分析：本次实验中，待测血清样本的CH50活性为Y。
与正常值50-100UL相比，该样本的CH50活性处于正常范围内。
3. 血清总补体活性（CH50）的临床意义：血清总补体活性（CH50）在临床上具有重要的诊断意义。
增高见于急性炎症感染、组织损伤、风湿热急性期、结节性动脉周围炎、皮肌炎、心肌梗死、伤寒、多发性关节炎、癌肿等。
降低见于急性肾小球肾炎、膜增殖性肾小球肾炎、系统性红斑狼疮（SLE）活动期、类风湿关节炎、病毒性肝炎、慢性肝病、亚急性细菌性心内膜炎、遗传性血管神经性水肿等。
总补体测定实验报告
总补体测定实验报告1. 引言总补体测定是一种常用的实验方法，用于评估机体免疫系统的功能状况。
该实验通过测定补体活性来确定机体抗体的产生和免疫反应的效果。
本实验旨在探究总补体测定的原理和操作方法，并验证其在评估机体免疫功能方面的应用性。
2. 原理总补体测定依据补体系统的活性来评定机体的免疫功能。
补体是一组由肝脏合成的血浆蛋白酶，与免疫系统密切相关。
在机体受到外界病原体的入侵后，免疫系统会产生相应的抗体。
这些抗体与病原体结合后，会激活补体系统，导致一系列反应，包括细胞溶解、炎症反应等。
通过测定补体系统的活性，可以判断机体免疫功能是否正常。
总补体测定实验通常分为两种方式：CH50（总补体活性）和CH100（补体活化单位）。
CH50的结果表示单位血浆内补体产生溶解半数所需的抗原-抗体复合物；而CH100则表示单位血浆内补体产生溶解100%，即完全活化的能力。
3. 实验方法3.1 实验材料和仪器- 补体测定试剂盒- 96孔板- 微量移液器- 显微镜- 超速离心机3.2 实验步骤1. 取96孔板，标号。
2. 加入不同浓度的抗原和试样血清，包括阳性对照和阴性对照组。
3. 使试样和抗原充分反应，孵育一段时间。
4. 添加适量的试剂盒中的溶剂，停止反应。
5. 加入染色剂，孵育一段时间。
6. 用显微镜观察96孔板中的溶解情况。
7. 通过观察溶解程度和比较阳性对照和阴性对照组的差异，判断补体活性。
4. 实验结果与分析根据实验步骤所述方法操作，观察到阳性对照组的孔溶解程度较大，而阴性对照组的溶解程度较小。
根据比较两者的差异，可以计算出补体活性的数值，确定机体的免疫功能是否正常。
5. 结论本实验通过总补体测定的方法，成功评估了机体的免疫功能。
根据实验结果与分析，可以得出结论：补体活性较高的样本表示机体免疫功能良好，相反，补体活性较低的样本则提示机体免疫功能异常或低下。
总体而言，总补体测定作为一种常用的实验手段，可以通过测定补体系统的活性来评估机体的免疫功能。
(CH50)测定补体实验
50%溶血试验(CH50)测定补体实验溶血CH补体补体实验标题: 50%溶血试验(CH50)测定补体实验摘要: 50%溶血试验即求得能使50%致敏羊红细胞发生溶血的最小量血清，然后计算出每毫升血清中补体含量。
以补体量作为横坐标，溶血百分数作为纵坐标，可得到一个清晰的“S”形曲线。
在50%溶血周围，线段近似一条直线。
因此当补体用量稍有变动，就可对溶血程度发生很大影响。
所以用50%溶血作……关键词:溶血CH补体补体实验50%溶血试验即求得能使50%致敏羊红细胞发生溶血的最小量血清，然后计算出每毫升血清中补体含量。
以补体量作为横坐标，溶血百分数作为纵坐标，可得到一个清晰的“S”形曲线。
在50%溶血周围，线段近似一条直线。
因此当补体用量稍有变动，就可对溶血程度发生很大影响。
所以用50%溶血作为终点要比100%溶血更为敏感。
50%溶血试验定血清中补体含量用以下公式表示：该公式可以从Von Krogh 方程式进一步加以论证：假定X=加入的新鲜血清量y=溶血的百分率，以小数表示V=斜率转变成对数，上述公式就变成材料及器材1．稀释液（磷酸盐缓冲生理盐水）NaCl 17gNa2HPO4 11gKH2PO4 0.27g蒸馏水100ml使用时取此原液50ml，加90ml蒸馏水。
经高压灭菌后即可使用。
加入100%硫酸镁溶液1ml，可增强补体的效能。
2．绵羊红细胞悬液（1×10g/ml）3．溶血素（2U）2．被检血清（新鲜豚鼠血清）3．水平离心机4．水浴箱5．721型分光光度计1．浓度为1×10g/ml的绵羊红细胞配制取经稀释洗涤后的绵羊红细胞配成较5%稍浓的细胞悬液。
取50%细胞悬液1ml，加于14ml蒸馏水中测O.D值为Di按下式求出于一定体积的5%细胞悬液中应加入稀释液的毫升数。
2．致敏绵羊细胞取绵羊红细胞悬液（1×102／ml）加等量的溶血素（2U／ｍｌ）。
充分混合。
置37℃水浴中作用30分钟，每隔10分钟摇动一次以免细胞下降即成5×108／ml致敏羊红细胞。
CH50测定
故采用50％溶血作为终点指标要比100％溶 血敏感的多，这一方法称为补体50％溶血 试验（complement hemolysis 50％ assay），简称为CH50。
以引起50%溶血所需的最小补体量为一个 CH50单位，由此可以计算出待测血清中总 的补体溶血活性，以U/ml表示。
主要试剂与器材
试管号 BBS 1：20稀释血清 2％SRBC 1 2 3 1.40 1.35 1.30 0.10 0.15 0.20 0.5 0.5 0.5 2U溶血素 0.5 0.5 0.5 置 37℃ 水浴 30min 补体溶血活性 200 133 100
4
5 6
1.25
1.20 1.15
0.25
0.30 0.35
总补体活性（U/ml） ＝ 1 血清用量（ml） ×稀释倍数
实验结果
写出标准管和选出的两管的吸光度，判断
哪一管与标准管的透光率接近。
计算总补体活性。
注意事项
待测血清必须新鲜，如放置室温2h以上，可使补体 活性下降。 待测血清还应该无溶血、无污染等。 绵羊红细胞等试剂均应新鲜配制。 实验器材应该清洁，残留的酸碱等化学物质均可使 补体受破坏。
补体的溶血活性可受多种因素的影响，如溶液的酸 碱度变化、钙和镁离子增加等可使补体溶血活性降 低。
应用与评价
本方法快速、简便，但敏感性较低，结果易受多 种因素的影响。
主要用于测定补体经典激活途径的溶血功能，不 能测定补体蛋白的绝对值 参考值：50-100U/ml
增高：可见于急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤
溶血素 2％SRBC pH7.4 巴比妥缓冲液（BBS） 待测血清、蒸馏水 离心机、试管、吸管、恒温水浴箱、分光 光度计、比色杯等
血清总补体溶血活性(CH50)测定
思考题
• 补体C3降低的临床意义？为什么要选用 50%的致敏羊RBC溶血作为试验的终点？
IgG 分 子 结 合 抗 原 前 后 的 构 象 变 化
结合抗原之前
结合抗原之后
Fc段
CH1
C1q 结合
CH2
位点被屏
障
暴露的 C1q结 合位点
IgM CH3区，IgG CH2区
Who are you ?
C1
补体攻膜单位
细胞膜表面的 C3b5b与C6、C7、C8 依次结合形成C5b678 复合物。该复和物诱发 C9在细胞膜表面共聚， 形成膜表面的通道结构 MACs，造成胞膜的穿 孔损伤。
1：20血清ml
0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 --
BB液
溶血素ml（2U/ml）
2%SRBCml
摇匀、37℃水浴30min，取出离心2500r/min×5min
• 6、比色
• 肉眼观察：初步目视比较，找出与标准 管相近的两管
• 比色：在分光光度计上读取OD541值,测 定与50%溶血标准管最近的一管为最高 有效反应管。
按下列公式求50%溶血的总补体值
CH50（U/ml）＝
1 血清用量
X 稀释倍数
总补体活性参考范围： 50~100U/ml
方法学评价
CH50试验测定经典途径总补体溶血活性， 所反应的是补体9种成分的综合水平。
本法敏感性较低，补体的溶血活性除与试验 中反应体积有关外，还与反应所用缓冲液的PH、 离子强度、钙镁浓度、SRBC数量和反应温度有 一定关系故实验时对反应的各个环节应严格控制， 统一步骤。
相应的红细胞混合，当补体存在时，红细胞即被溶解。
CH50测定总结
补体的溶血活性可受多种因素的影响，如溶液的酸 碱度变化、钙和镁离子增加等可使补体溶血活性降 低。
应用与评价
本方法快速、简便，但敏感性较低，结果易受多 种因素的影响。
主要用于测定补体经典激活途径的溶血功能，不 能测定补体蛋白的绝对值 参考值：50-100U/ml
增高：可见于急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤
降低：多见于免疫复合物BC溶解。 当致敏红细胞的浓度一定时，在规定的反
应时间内，溶血程度与补体的活性成正相
关，但不是直线关系，为典型的S形曲线。
在轻微溶血和接近完全溶血时，补体量的 变化不能使溶血程度有显著改变，即溶血 对补体量的变化不敏感。
在半溶血（50％溶血）上下时曲线最陡， 即使补体含量仅有较小变动时，溶血程度 也会发生较大的改变，也就是说对补体量 的变化非常敏感。
结果判断方法
将各反应管经2500r/min、5min离心后，先用目
测法观察其溶血程度，并与50％溶血标准管比较， 选择与标准管最接近的两管。
再用分光光度计于波长542nm进行比色测定。以
BBS缓冲液为空白对照，校正零点，找出吸光度
与标准管最接近的一管，根据该管的血清用量，
求出总补体溶血活性。
总补体活性（U/ml） ＝ 1 血清用量（ml） ×稀释倍数
实验结果
写出标准管和选出的两管的吸光度，判断
哪一管与标准管的透光率接近。
计算总补体活性。
注意事项
待测血清必须新鲜，如放置室温2h以上，可使补体 活性下降。 待测血清还应该无溶血、无污染等。 绵羊红细胞等试剂均应新鲜配制。 实验器材应该清洁，残留的酸碱等化学物质均可使 补体受破坏。
试管号 BBS 1：20稀释血清 2％SRBC 1 2 3 1.40 1.35 1.30 0.10 0.15 0.20 0.5 0.5 0.5 2U溶血素 0.5 0.5 0.5 置 37℃ 水浴 30min 补体溶血活性 200 133 100
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补体结合反应:结果观察 血清总补体活性测定(CH50法):每人操作
补体参与的反应
补体参与的反应
溶血反应 补体结合反应 血清总补体活性测定(CH50法)
溶血反应
RBC
+
抗RBC抗体 (溶血素) 新鲜血清
溶血
补体结合试验
（complement fixation test,CFT)
CH50法原理
被检血清及各种试剂稀释法
管号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
病人血清(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃 0.2
血清稀释度
取上述混悬液0.1毫升加pH7.4巴比妥缓冲液 0.5毫升，与标本同置37℃ 30min。
结果判断及意义
将50%溶血标准管与各稀释度试管用肉眼比色， 颜色与标准管相同者即为终点。
此管的稀释度乘以5即是标本的每毫升补体含 量。
血清总补体量的正常值为80-160单位/毫升。 正常人血清中的总补体量保持一定范围，补体
补体结合试验原理:
是根据抗原和抗体反应所形成的复合物吸附并激活 补体的原理所设计的一种血清学反应。
有5种成分参与，分属于3个系统： ①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗 体（或抗原） ②补体系统 ③指示系统，即SRBC与相应溶血素。
补体结合试验原理
受检系统
指示系统
1、仅有抗原或抗体
红
细
补
胞
抗原/抗体
体
溶血素
溶血反应 阳性
2、抗原抗体反应
抗原 补 体
抗体
红细胞 溶血素
阴性
补体结合试验 阴性
阳性
补体结合试验原理
补体 待检系统
指示系统
补体结合试验原理（结果阳性）
补体消耗
待检系统
指示系统（不溶血）
补体结合试验原理（结果阴性）
补体未消耗
待检系统
指示系统（溶血）
•液体混浊呈浅红色为不溶血，液体透明呈红色为溶血。 •第2、3、4管为对照管应溶血，第5管为SRBC对照不应溶血。 •凡第1管红细胞发生溶血者为补体结合反应阴性，而不溶血 者为阳性。
量的变化可为某些变态反应性疾病与补体缺陷 病的诊断与预后提供依据。
实验报告要求
补体结合实验 原理、结果观察、结论
CH50（ml）
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
5%SRBC（ml）
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
置37℃水浴, 30min
50%溶血标准管的配制：
取5%羊红细胞1毫升，1000转/分离心10分钟， 弃去上清，加入蒸馏水0.5毫升溶解后加入 1.8%NaCl 0.5毫升，充分混匀后再加5%羊红细 胞悬液1毫升，充分混匀。
1∶1 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
血清最后稀释度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1024
血清总补体活性测定 (CH50法)
掌握50%补体溶血试验的原理、方 法、结果判定及临床意义。熟悉 血清补体含量的计算。
CH50法原理
绵羊红细胞与溶血素，在新鲜血清中补体的 作用下，绵羊红细胞可被溶解，产生溶血现 象。
溶血程度与血清中补体量相关，呈一弧形曲 线，但在50%溶血（CH50）附近时，溶血度 与补体量之间呈线性关系，故以50%溶血作 为终点观察指数最为敏感。