实验3 抗体制备 补体结合 PBMC分离
PBMC提取
PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。
其中淋巴细胞占很大一部分。
分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml 仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。
红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。
吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
注意事项全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。
否则将分层混乱。
步骤：配制所需的溶液：a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；c.将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；d.取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。
然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。
离心完毕将得到如图所示分层；PBMC所在细胞层为白色。
此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml 离心管中。
e.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；f.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；g.细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。
分子医学实验：PBMCs的分离和计数
PBMCs的分离和计数
实验ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的和要求
• 掌握PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)分离的方法 • 掌握细胞计数的方法
实验原理
外周血中细胞种类
细胞密度
红细胞和多核白细胞
1.092-1.093
PBMC(淋巴细胞和单核细胞)
1.074
淋巴细胞分离液：Ficoll-Hypague 1.077
不着色）
活细胞数
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
密度梯度离心法分离PBMCs：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
注意事项
• 稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻轻叠加于分离液上 ，使两者形成一个清晰地界面。
• 细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，切勿打破形 成的细胞层。
数上不数下，数左不数右。
细胞计数板
细胞计数
用100ulHank’s液重悬细胞
取10ul细胞悬液+40ul Hanks'液 +50ul台盼兰, 混匀
取10ul于细胞计数板上
进行细胞计数
实验结果计算
细胞数量：
单个核细胞浓度（细胞数/ml)
= 2个大方格内细胞总数 ×104×稀释倍数
2
细胞活力检测：（台盼兰染色：死细胞被染成蓝色，活细胞
实验步骤
稀释后的 抗凝血
淋巴细胞 分离液
肝素抗凝静脉血1-1.5
ml 加等体积的Hank’s液稀释
置于2ml淋巴细胞分离液上
(交界液面：一定不要打乱)
离心（2000rpm， 25min）
血浆
分层液 红细胞 粒细胞
ficoll分离法分离pbmc
ficoll分离法分离pbmcFicoll分离法分离PBMC的介绍PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell），又称外周血单个核细胞，是人体免疫系统中重要的组成部分。
PBMC中包含淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等，是研究免疫学、血液学和生物学的重要细胞。
对PBMC的分离和纯化对于后续的实验研究有着至关重要的作用。
其中，Ficoll分离法是常用的PBMC分离方法之一，其通过悬浮PBMC在密度梯度上，利用真核细胞和其它细胞在稀释Ficoll溶液中的胶体压差选择性沉降，从而获得纯净的PBMC。
下面，本文将详细介绍Ficoll分离法分离PBMC的步骤和特点。
一、操作步骤1、制备样本：以抗凝剂抗凝的外周血为样品。
2、制备Ficoll-Paque溶液：5ml Ficoll-Paque液加5ml PBS进行混合。
3、样本的悬浮液：将5ml抗凝的外周血加入到50ml 耐酸碱离心管内。
缓慢倒入Ficoll-Paque溶液，避免两种溶液混合。
装好离心管盖，以3000r/min离心30min（制备不同量的悬浮液时离心的时间不同），过程中不能震动，最好在无扰动的条件下离心。
4、取上清液：离心结束后，可以清晰地看到上清液、白膜和红血块。
样品中的细胞被Ficoll在稀释液中的胶体压力亲和力离心到离心管的木纹间。
无线假底离心管是离心过程中压力拍打细胞下沉粘连的机会最小的离心材料。
在冰上开盖依次取出，将悬浮液上清液倒在装有PBS的无菌离心管中。
5、PBS的加入：加入PBS，摇匀，离心1800r/min，10min。
取出，弃上清液。
6、PBS的加入和离心：重复上一步2次。
最后一次离心弃掉PBS，留下沉淀细胞。
二、特点1、相对纯净度高：Ficoll-Paque是一种密度梯度介质，利用细胞的沉降速度和浮力进行分离。
使不同密度的细胞分层，从而实现分离。
使用该分离方法分离PBMC，可获得高度纯净的细胞，最大限度减少不同细胞系之间的干扰。
实验三 抗体的制备(胡荣)
5、抗血清保存
4℃保存（3~6M）； 低温保存（3~5Y）； 真空干燥保存（5~10Y）。
（四）、注意事项 1、正确抓握家兔、注意抚摸； 2、做好自我保护，防止抓伤或咬伤； 3、保持安静，不要大声喧哗； 4、有团队合作精神！ 5、整理干净桌面（84消毒液消毒）！！
单克隆抗体的制备（看视频）
过程：1、细胞的选择与制备 2、细胞融合 3、杂交瘤细胞选择培养 4、杂交瘤细胞克隆化培养与冻存 5、单克隆抗体的大量制备 6、单克隆抗体的纯化和鉴定
Ab产生的一般规律，视抗原的性质选择不同的 途径免疫动物，经初、再次免疫后，使动物血 清中产生足量的特异性Ab，继而分离、纯化血 清，得到相应的Ab。（PcAb）
（二）、试剂与器材 1、 抗原与免疫对象
Ag1：伤寒沙门菌“O”抗原； Ag2：混合人全血清； 免疫对象：健康家兔（24只:12只/班）。
（4）加强免疫 免疫途径、剂量、间隔时间见免疫方案。
（5） 试血 末次免疫7天后即试血，耳静脉采血，分离血
清，与伤寒沙门菌"O"抗原作试管凝集试验，凝集 效价在1：600~3200之间时即可放血，若效价较 低可继续加强免疫。
（6）放血 心脏采血（末次免疫后5-7d）。
2、抗人血清的制备
（1）弗氏佐剂的制备 弗氏不完全佐剂： 称取羊毛脂5g，逐滴加入石蜡油20ml（羊毛脂：石 蜡油约为1：1~1：4），高压灭菌后4oC保存备用。 弗氏完全佐剂： 于不完全佐剂中加入2~20mg/ml卡介苗，研钵中乳 化后即成为完全佐剂，冰箱保存备用。
。试血时，双扩试验效价达1：16以上即可收 集血清。如效价不高，可追加免疫。
（6） 抗血清采集 心脏采血。
３、 抗血清的鉴定
内容：效价、特异性、纯度、亲和力 方法：颗粒性抗原效价→凝集试验
pbmc分离注意事项
PBMC分离注意事项一、摘要PBMC（ Peripheral Blood Mononuclear Cells，外周血单个核细胞）分离是生物医学研究中常见的实验操作之一。
PBMC包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞等，在免疫学、肿瘤学、血液学等领域的研究中具有重要意义。
然而，在进行PBMC分离时，需要注意许多细节和操作要点，以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将就PBMC分离的实验准备、操作过程和后续处理等方面的注意事项进行详细讨论，旨在提高实验操作效率和实验结果质量。
二、实验准备注意事项在开始PBMC分离之前，需要进行充分的实验准备工作。
以下是一些需要注意的事项：1.血液样本的采集和处理在进行PBMC分离之前，需要采集血液样本。
采血时应注意以下几点：首先，要选择适当的采血时间，如清晨空腹采血可以提高检测结果的稳定性；其次，应选择适当的采血方式，如静脉采血或动脉采血；最后，应使用适当的抗凝剂来处理血液样本，以避免血液凝固。
在采集血液样本后，应尽快将样本送往实验室进行处理。
2.实验器材和试剂的准备在实验前，需要准备好所需的实验器材和试剂。
应选择适当的离心管、吸管、细胞筛等实验器材，并确保这些器材的清洁度和无菌状态。
此外，需要准备适当的分离介质、洗涤液、培养基等试剂，并确保这些试剂的质量和浓度符合实验要求。
三、操作过程注意事项在PBMC分离的操作过程中，应注意以下事项：1.离心速度和时间的选择离心是PBMC分离的重要步骤之一。
在选择离心速度和时间时，应根据实验要求和实际情况进行权衡。
离心速度过高或时间过长可能导致细胞损伤或失活；离心速度过低或时间过短则可能导致分离不充分。
因此，需要根据分离介质的特性和所需细胞类型进行选择和调整。
2.操作过程的无菌化处理在PBMC分离过程中，应保持操作的无菌化处理。
所有实验器材和试剂应保持清洁和无菌状态，以避免污染和交叉感染。
此外，实验操作应在无菌操作台或超净工作台中进行，并穿戴适当的个人防护装备。
PBMC的分离培养及处理步骤
刘凤君实验步骤1.采血：抽取初治(初始抗病毒治疗）之前CHB、CHC患者外周静脉血6ml，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。
2.稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀。
3.加样：取50ml离心管，吸取6ml Ficoll（淋巴细胞分离液）于离心管中，（Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1），管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面。
4.离心：18-20℃,2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。
5.回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。
6.洗涤：加入至少于PBMC（外周血单个核细胞）体积3倍的PBS，18-20℃,2000rpm，10min，两次。
7.细胞计数：弃上清，加1ml RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清），吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。
①专用仪器测定：吸取一定量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2%台盼蓝，吹打混匀后吸取1滴进行细胞浓度测定。
②血细胞计数板：取一滴PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。
细胞数/ml=4个大方格细胞总数/4×104×2（稀释倍数）8.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基，加于6孔板或24孔板中进行培养。
（我们通常是培养过夜后再进行下一步处理）。
9.干扰素处理：加入500IU/ml（培养基的终浓度）的α-IFN（干扰素），同时设对照组，时间为8小时。
（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。
10.细胞收集：将6孔板或24孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将Trizol转入EP管中。
11.细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。
临床免疫学检验智慧树知到答案章节测试2023年山东第一医科大学
第一章测试1.在抗原和抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互的引力，指的是A:疏水作用力B:静电引力C:范德华引力D:氢键答案:B2.以下在抗原抗体的结合力中，作用最强的是A:氢键B:范德华引力C:疏水作用力D:静电引力答案:C3.一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，称为A:affinityB:亲和性C:库伦引力D:亲合力答案:D4.抗原与相应抗体结合反应的专一性是A:比例性B:特异性C:可逆性D:阶段性答案:B5.在抗原与抗体反应中，若抗体过量称为A:后带B:前带C:等价带D:带现象答案:B6.在抗原与抗体反应中，常用做反应液的NaCl浓度是A:1.8%B:0.85%C:0.95%D:0.75%答案:B1.在可溶性抗原的纯化中，以下不属于选择性沉淀法的是A:盐析法B:层析法C:聚合物沉淀法D:有机溶剂沉淀法答案:B2.动物采血法不包括A:动脉采血法B:心脏采血法C:毛细血管采血法D:静脉采血法答案:C3.利用待分离物质与其特异性配体间具有特异的亲和力而达到分离目的的方法是A:凝胶层析法B:亲和层析法C:离子交换层析法D:等电聚焦法答案:B4.沉淀免疫复合物所用的PEG的浓度是A:5-6%B:1-2%C:D．6-10%D:3-4%答案:D5.免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中第一次和第二次免疫的最佳间隔时间为A:15～28天B:7～10天C:10～20天D:5～7天答案:C6.抗血清的鉴定不包括A:效价的鉴定B:纯度的鉴定C:蛋白质分子量测定D:特异性的鉴定答案:C1.关于凝集反应，说法正确的是A:IgM类抗体常出现不完全反应B:反应的发生可分为4个阶段C:可进行定量检测D:IgG类抗体不易出现不完全反应E:IgM类抗体的作用比IgG类抗体要强答案:E2.玻片凝集试验A:不能用于ABO血型鉴定B:只能检测抗体不能检测抗原C:只能检测抗原不能检测抗体D:为半定量试验E:既能检测抗原又能检测抗体答案:E3.外斐反应属于下面哪种免疫技术A:沉淀试验B:间接血凝试验C:直接凝集技术玻片法D:直接凝集技术试管法E:协同凝集试验答案:D4.关于正向间接凝集试验，说法错误的是A:用于检测标本中的抗体B:特异性强C:抗原致敏载体D:敏感性高E:出现凝集为阴性答案:E5.关于反向间接凝集试验说法错误的是A:出现凝集为阴性B:敏感性高C:特异性强D:用于检测标本中抗原E:抗体致敏载体答案:A第四章测试1.下列哪项不是沉淀反应的特点A:需一定电解质B:抗原是可溶性抗原C:反应可分为两个阶段D:抗体是McAbE:其特性与经典抗原抗体反应相同答案:D2.单向琼脂扩散法可用于A:抗体定性和定量B:抗体定性C:抗体定量D:抗原定性E:抗原定量答案:E3.单向琼脂扩散试验出现多条沉淀线的原因是A:抗原过剩B:抗体过剩C:抗原、抗体缺乏D:抗原、抗体不纯E:抗原、抗体相等答案:D4.双向琼脂扩散试验中沉淀环弯向抗原一方是因为A:抗原抗体分子量相等B:抗原分子量大C:抗体分子量大D:抗体扩散慢E:抗原扩散快答案:B5.对流免疫电泳中，抗体向负极移动的原因是A:电泳作用B:抗体带负电C:抗体不带电荷D:抗体带正电E:电渗作用答案:E第五章测试1.最常用的放射免疫技术标记物是A:3HB:14CC:131ID:125I答案:D2.关于放射免疫分析方法，以下不正确的是A:Ab总结合位点数小于Ag和Ag量的总和B:用已知的不同浓度的抗原为标准品C:分为单位点和双位点两种类型D:Ag和Ag具有等同的与Ab结合能力答案:C3.关于放射免疫分析与免疫放射分析，说法正确是A:前者是基于非竞争性结合反应原理，后者是基于竞争性结合反应原理B:前者是基于竞争性结合反应原理，后者是基于非竞争性结合反应原理C:两者均基于非竞争性结合反应原理D:两者均基于竞争性结合反应原理答案:B4.免疫放射分析以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。
pbmc分离步骤
pbmc分离步骤
PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的缩写，通常包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。
以下是从外周血中分离PBMC的一般步骤，主要采用密度梯度离心法：
1.材料准备：
•外周血样本
•无菌PBS（磷酸盐缓冲液）
•密度梯度分离液（如Ficoll-Paque）
2.密度梯度分离：
•将外周血与相同体积的PBS混合均匀。
•将混合物缓慢地倒在密度梯度分离液上，确保形成一个清晰的界面。
•用无菌技术，将样本与PBS和分离液的混合物轻轻地分层到离心管中。
3.离心：
•使用无菌技术将离心管放入离心机，进行离心。
•设置适当的离心参数，通常是低速度离心，以避免细胞破裂。
•离心结束后，PBMC会沉积在分离液的界面上。
4.PBMC收集：
•使用无菌技术，将PBMC小心地从离心管的界面上吸取出来，放入新的离心管中。
5.洗涤：
•使用PBS或细胞培养基等缓冲液洗涤PBMC，以去除密度梯度分离液的残留。
6.计数和保存：
•使用血细胞计数板或血细胞计数仪等设备，计数PBMC的细胞数。
•根据需要，将PBMC冻存或直接用于后续实验。
注意事项：
•所有步骤应在无菌条件下进行，以避免细菌和其他污染物的引入。
•使用离心管和仪器前后要进行严格的消毒。
•密度梯度分离液的选择要根据实验需要，通常使用Ficoll-Paque 等离子浓度梯度离心介质。
这些步骤是标准的PBMC分离方法，但可能需要根据具体实验的需求进行微调。
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Ag + Ab
Binding to Complement
Ag + Ab + C
Activation of Complement
Lysis of target cells
概念：
补体结合反应： 是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（
SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示 系统的抗原抗体反应。
原理：
…… 0.2mL
摇匀，37℃，水浴15min
预期结果：
1．管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透 明呈红色为溶血。
2.
试验管
？
溶血 不溶血
血清对照管 抗原对照管 补体对照管 SRBC对照管
溶血
溶血
溶血
不溶血
注意事项：
• 绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧 烈震荡。
• 各种试剂的吸管不可混用。
Test 2 人外周血单个核细胞分离
实验原理：
1.密度梯度离心法
淋巴细胞分离液
外周血
离心
2.淋巴细胞分离液：聚蔗糖-泛影葡胺
血浆层
淋巴细胞 单核细胞 1.070g/l
分离液 (1.077±0.002g/l)
粒细胞和红细胞 (1.092g/l)
实验方法： 抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml Hank’s液
混匀
取3ml稀释血，沿试管壁缓慢加入到2ml分 离液中
弃上清 加入3ml 生理盐水，混匀 2000rpm, 离心，5min
弃上清
制备绵羊红细胞溶液30%、 35%、40%、50%
取0.1ml 皮下注射 免疫小鼠
实验三 1.补体结合反应 2.人外周血单个核细胞分离 3.抗体制备(3)
Test 1 补体结合反应 （Complement fixation Test, CFT）
补体结合位点
结合抗原之前
结合抗原之后
Fc段
CH1
C1q 结合
CH2
位点被屏
障
IgM CH3区，IgG CH2区
暴露的 C1q结 合位点
结果
E-花环形成率
形成花环的淋巴细胞数
=
淋巴细胞总数(形成和未形成花环的细胞总数)
正常范围:60-80%
X 100%
淋巴细胞增殖实验
外周血或分离 PHA 涂片染色
的淋巴细胞
共培养
形态学观察 计算转化率
Test 3 抗体制备
方法:
脱纤维绵羊红细胞（SRBC） 加入3ml 生理盐水，混匀 2000rpm, 离心，5min
2000rpm，离心20min
小心吸取淋巴细胞层，加入2ml Hank’s液
2000rpm，离心10min
弃上清，加入2ml Hank’s液 2000rpm，离心10min
弃上清，加入2ml Hank’s液
细胞计数
WBC
1mm WBC 1mm
WBC
WBC
Cell concentration/ml = Total cell count in 4 squares /4 x 104
1
2
Step 3 SRBC的裂解
Ab 阳性
Ag
Ag
待测血清
No Ab 阴性
Ag Ag
材料：
✓ 抗原：伤寒菌裂解产物 ✓ 待测血清：56℃，30min ✓ 补体：豚鼠血清 ✓ 2%绵羊红细胞 ✓ 溶血素
方法： 试验管
1
（1份/2人）
血清 对照管
2
抗原 对照管
3
补体 对照管
4
SRBC 对照管
5
待测血清 抗原 补体 N.S
0.2mL 0.2mL
……
0.2mL … …
0.2mL
0.2mL 0.2mL
0.2mL
……
0.2mL
0Байду номын сангаас2mL
摇匀，37℃，水浴15min
…… …… 0.2mL 0.4mL
…… …… …… 0.8mL
溶血素 SRBC
0.2mL 0.2mL
0.2mL 0.2mL
0.2mL 0.2mL
0.2mL 0.2mL
补反中包括两个系统五种成分：
✓ 待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及 仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。
✓ 指示系统：绵羊红细胞和溶血素。
1：No Ab； 2：Ab
待测系统 抗原+未知血清
补体
指示系统 SRBC+抗SRBC抗体
1
2
12
Step 1
Step 2
抗原抗体复合物的形成 补体的结合和耗竭
RBC
Cell concentration/ml = Total cell count in 5 squares x 5 x 104
注意
• 无菌操作. • 注意血制品污染. • 控制操作时间，保持细胞存活. • 应用水平离心机.
SRBC CD2
E-花环形成实验
T
B
• 用于检测外周血T细胞的数量和比例.