抗体的制备方法与原理
单克隆抗体的制备原理及方法
单克隆抗体的制备原理及方法
单克隆抗体的制备原理及方法是通过以下步骤来实现的：
1. 免疫原的选择：选择一个目标抗原，并将其注入到免疫宿主中，例如小鼠。
2. 免疫应答：免疫宿主的免疫系统会识别并产生抗体来应对免疫原的存在。
3. 融合细胞的制备：从免疫宿主中取得抗体产生的细胞，并与癌细胞（如骨髓瘤细胞）融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞的筛选：采用适当的培养基，筛选出那些能够生存和增殖的杂交瘤细胞。
这些细胞具有与原先抗体产生细胞相同的生长特性。
5. 单克隆抗体的筛选：将培养基中的每个细胞与免疫原进行反应，然后用酶联免疫吸附试验（ELISA）或流式细胞术等方法筛选出特异性抗原结合的细胞。
6. 单克隆抗体的扩增：将特异性抗原结合的细胞分离并培养，使其增殖，形成一个与原始细胞相同的细胞群。
除了以上的制备原理，还可以使用其他的方法来制备单克隆抗体，例如基因工程方法、人源化方法等。
这些方法可以通过人工改造的方式来制备单克隆抗体，以满足特定需求。
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。
单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。
单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。
表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体的制备方法如下。
（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理抗体是一种能够识别和结合特定抗原的蛋白质，广泛应用于医学诊断、治疗和研究领域。
抗体的制备方法包括动物免疫和体外选择性放大两种主要途径。
以下将详细介绍这两种方法及其原理。
一、动物免疫法制备抗体动物免疫法是制备多种特异性抗体的主要方法，常用的动物包括小鼠、兔子、大鼠等。
制备抗体的主要步骤如下：1.抗原选择：首先需要选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、糖蛋白、核酸等。
抗原应具有免疫原性，能在动物体内引起免疫反应。
2.免疫原免疫：将抗原与适当的佐剂混合后注射到动物体内，佐剂可以增强抗原的免疫原性，如完全弗氏佐剂、佐科克佐剂等。
注射的剂量和时间间隔需根据具体实验目的和动物种类进行优化。
3.收集血清和分离抗体：免疫一定时间后，收集动物的全血或血清，离心分离血清，其中包含了目标抗体。
4.抗体纯化：通常使用亲和层析、凝胶过滤层析等方法将血清或血浆中的抗体纯化出来。
亲和层析是最常用的抗体纯化方法，利用特定配体或抗原结合柱将目标抗体捕获，再洗脱得到纯抗体。
二、体外选择性放大法制备抗体体外选择性放大法是指通过技术手段进行人工放大和筛选特定抗体，主要包括以下步骤：1.生成抗体文库：将来自多个个体免疫系统的B细胞或血浆细胞收集起来，提取RNA或DNA，然后利用逆转录酶合成cDNA或文库，得到抗体基因的cDNA文库。
2.构建抗体显示系统：将抗体基因文库插入适当的表达载体中，如噬菌体、酵母、哺乳动物细胞表达系统等。
3.筛选特异性抗体：利用高通量筛选技术，如细胞表面展示、比对深度测序等，可通过抗原结合的特异性来筛选出具有高亲和力的抗原结合片段或全长抗体。
4.抗体表达和纯化：通过选择后的抗体基因进行表达，再经过蛋白纯化和检验等步骤，最终得到目标抗体。
抗体制备的原理主要是基于免疫系统的免疫应答机制。
当机体受到抗原的刺激后，机体会产生一系列免疫应答，其中包括B细胞的活化和分化。
经过抗原的结合和识别，B细胞会分泌具有高亲和力的抗体。
基因工程抗体制备原理
基因工程抗体制备原理
1. 靶抗原选择：根据需要制备的抗体的特定功能和应用领域，选择合适的靶抗原。
靶抗原可以是纯化的蛋白质，细胞表面分子等。
2. 基因克隆：将靶抗原的基因序列克隆到适当的表达载体中，例如质粒或病毒载体。
这个过程通常涉及使用限制性内切酶切割目标基因和载体，并通过DNA连接酶将它们连接起来。
3. 转染宿主细胞：将重组载体导入宿主细胞，使其表达靶抗原基因。
可以使用多种方法进行转染，包括电穿孔、高压转染或病毒介导的转染。
4. 细胞培养与表达：培养被转染的宿主细胞，在适当的培养基中表达靶抗原。
这些细胞通常是哺乳动物细胞，如CHO细胞。
5. 抗体纯化：通过多种分离技术将抗体从培养物中纯化出来。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
6. 抗体测试和鉴定：通过各种实验方法，如ELISA、Western blot等，验证所制备的抗体的特异性和相关功能。
基因工程抗体制备利用了基因重组技术和细胞工程技术，能够高效、精确地制备特定的抗体，具有广泛的应用前景。
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体是一种由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体，能够识别并结合多个抗原表位。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原的选择：选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面蛋白等。
2. 免疫动物的选择：根据抗原的物种来源，选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子、山羊等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，激发免疫反应。
通常采用多次免疫，间隔一定时间进行。
4. 细胞融合：从免疫动物体内提取免疫细胞，通常采用脾细胞或骨髓细胞。
与骨髓或脾细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：采用筛选培养基，筛选出杂交瘤细胞，一般是通过对杂交瘤细胞进行限稀稀释培养，进行单克隆细胞的筛选。
6. 克隆抗体的生产：将单克隆细胞进行扩增，并进行细胞培养，使其产生大量的抗体。
多克隆抗体制备的原理是利用免疫动物的免疫系统产生多个克隆的抗体。
当免疫
原进入免疫动物体内时，会激发免疫细胞产生对应的免疫反应，形成多个不同的克隆细胞。
这些克隆细胞会产生具有不同的抗体结构的抗体分子。
通过细胞融合和杂交瘤筛选的步骤，可以筛选出产生目标抗原特异性抗体的单克隆细胞，并进行大规模生产。
这样就获得了能够结合多个抗原表位的多克隆抗体。
简述单克隆抗体的制备原理
简述单克隆抗体的制备原理
单克隆抗体是指由单个B细胞克隆所产生的同一种抗体分子，具有高度特异性和亲和力。
制备单克隆抗体的方法有多种，其中最常用的是杂交瘤技术。
制备单克隆抗体的过程主要分为以下几个步骤：
1. 免疫动物
首先需要选取与目标抗原相关的免疫原来免疫动物，一般常用的免疫原包括蛋白质、多肽、糖类、细胞表面分子等。
免疫动物可以选择小鼠、大鼠、兔子等。
2. 分离B细胞
将免疫动物的脾脏取出，制备成单细胞悬液，然后通过离心、梯度离心等方法分离出B细胞。
B细胞是免疫系统中产生抗体的主要细胞类型。
3. 杂交瘤的制备
将B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
骨髓瘤细胞是一种白血病细胞，具有无限增殖的能力，但不产生抗体。
通过融合，可以将B细胞的抗体产生能力与骨髓瘤细胞的无限增殖能力结合在一起，形成具有两种细胞的特点的杂交瘤细胞。
4. 筛选单克隆抗体
将杂交瘤细胞进行分离和培养，筛选出产生特定抗原的单克隆抗体。
可以通过酶联免疫吸附试验、流式细胞术等方法鉴定和筛选出单克隆抗体。
5. 大规模制备和纯化
通过大规模培养杂交瘤细胞，可以得到足够数量的单克隆抗体，然后通过柱层析、电泳等方法对单克隆抗体进行纯化，得到高纯度的单克隆抗体。
总的来说，单克隆抗体的制备过程需要经过免疫动物、分离B细胞、杂交瘤的制备、筛选单克隆抗体和大规模制备和纯化等步骤。
这些步骤需要严格控制条件和技术，以确保制备出高质量的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备原理及方法
单克隆抗体的制备原理及方法单克隆抗体是一种由单一克隆B细胞产生的抗体，具有高度的特异性和亲和力。
它在生物医药领域有着广泛的应用，包括疾病诊断、治疗和生物学研究等方面。
本文将介绍单克隆抗体的制备原理及方法，希望能对相关领域的研究人员有所帮助。
一、制备原理。
单克隆抗体的制备原理主要包括以下几个步骤，抗原免疫、细胞融合、筛选和鉴定、扩增和保存。
首先，通过将目标抗原注射到实验动物体内，诱导其产生特异性抗体。
然后，从免疫动物体内获得B细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
接着，通过细胞培养和筛选，筛选出产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。
最后，对所得的单克隆抗体进行扩增和保存，以备进一步的实验和应用。
二、制备方法。
1. 抗原免疫。
选择合适的实验动物，根据抗原的特性和研究需要，选择合适的免疫方案，包括抗原的种类、免疫的途径和次数等。
2. 细胞融合。
将获得的B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
融合细胞的筛选条件包括杂交瘤细胞的生长条件、培养基的成分和杂交瘤细胞的筛选方法等。
3. 筛选和鉴定。
通过特异性抗原的筛选和鉴定，筛选出产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。
鉴定的方法包括ELISA、免疫印迹、免疫荧光等。
4. 扩增和保存。
对所得的单克隆抗体进行扩增和保存，以备进一步的实验和应用。
扩增的方法包括体外培养、动物体内生长等。
三、实验注意事项。
在进行单克隆抗体的制备过程中，需要注意以下几个方面的实验注意事项，实验动物的选择和管理、抗原的制备和纯化、细胞融合和杂交瘤细胞的培养条件、单克隆抗体的鉴定和保存等。
四、应用前景。
单克隆抗体作为一种重要的生物医药制剂，在疾病诊断、治疗和生物学研究等方面具有广阔的应用前景。
随着生物技术的不断发展，单克隆抗体的制备技术也在不断完善，相信在未来会有更多的应用领域被开发出来。
综上所述，单克隆抗体的制备原理及方法是一个复杂而又具有挑战性的过程，需要研究人员在实验操作中严格把关，以确保所得的单克隆抗体具有高度的特异性和亲和力。
实验一、抗体的制备.
永州职业技术学院
杨晓斌
目的 1、掌握抗体制备方法 2、理解福氏佐剂的作用 内容 1、伤寒沙门菌O抗体的制备； 2、抗人全血清的制备。
一、伤寒沙门菌O抗体的制备
（一）、实验原理： 用抗原刺激机体可以使机体产生抗体，根据抗体 产生的一般规律，视抗原的性质选择不同的途径 免疫动物，经初次、再次免疫的过程，使得动物 血清中产生足量的特异性抗体，继而分离血清并 纯化免疫球蛋白，得到免疫血清或抗体。 抗体的制备是利用动物，有目的地生产某种抗体， 通过这种方法得到的抗体是多克隆抗体，可用于 体外的抗原抗体反应。
（2） 伤寒沙门菌O抗原免疫方案 用于免疫动物的菌液浓度视种的不同而异， 伤寒沙门菌、志贺痢疾菌等道杆菌，免疫浓 度多为109个/ml左右。细菌性抗原的免疫方 案大致相同，见下表：
免疫日期（天） 1免疫途径 Nhomakorabea点皮内抗原 伤寒沙门菌O抗原
免疫剂量（ml） 1.0
6
11 16 19
静脉
静脉 静脉 静脉
（二）、试剂与器材 1、 抗原与免疫对象 细菌菌种（伤寒沙门菌O901）、混合人全血清、 健康家兔。 2、 试剂 生理盐水、甘油、防腐剂等。 3、 设备与器材 剪刀、镊子、注射器、研钵、试管等器材和冰箱、 离心机等仪器。
实验动物的捉拿和固定方法
1．小鼠 性情比较温顺，一般不会主动咬人，但由于体形较 小且胆小怕惊，因此捉拿动作需要轻缓。捉拿时先用右手 将鼠尾抓住并提起，将其旋转数周后放在实验台面（最好 有一定粗糙度，以便于鼠爪用力）上，在小鼠向前爬行时 用力向后拉尾，此时用左手的拇指和食指捏住小鼠两耳和 头颈部皮肤，然后将鼠臵于左手心中，拉直后肢并用左手 无名指和小指压紧尾巴和后肢，右手即可作注射、灌胃等 实验操作。若进行解剖、手术、尾部采血或尾静脉注射时， 要将小鼠做一定形式固定。如作解剖、手术和心脏采血时， 一般将小鼠仰卧，用大头针或线绳将小鼠四肢固定在木板 上。作尾静脉注射或采血时，可将小鼠装入木制或有机玻 璃制作的小鼠固定盒内，亦可将小鼠直接 固 定在固定板 上
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抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。
检查合格后即以其中一注射器作注射用。
（四）免疫方法抗原剂量，首次剂量为300～500μg，加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。
每2～3周加强免疫一次。
加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加强免疫时不必注射百日咳疫苗。
在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3ml血，制备血清，检测抗体效价（见后）。
如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止（图2-3）。
当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。
图2-3 抗体反应（五）抗血清的采集与保存家兔是最常用以产生抗体的动物，因此这里主要讨论兔血的收集。
羊等较大动物以颈静脉、动脉取血，鼠等小动物取血可参阅有关资料。
取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血。
取动脉或静脉放血时，将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。
剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。
用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集30～40ml 。
然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。
二星期后，可在另一耳放血。
此法可反复多次放血。
颈动脉放血时，将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。
放血过程中要严格按无菌要求进行。
收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,1 0min。
在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4。
C冰箱保存。
（六）抗血清质量的评价在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。
只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。
1．效价抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。
效价测定的方法常用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。
某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。
前者测定的效价极为精确。
而后者则粗糙得多。
（1）放射免疫法：以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。
通常以结合率为50%的血清稀度和为效价。
如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000，则该血清的效价就是1：15000。
抗血清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起注意。
（测定方法见第8章）（2）双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。
球脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65℃左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为0.1%。
用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔（图2-4）。
中央孔内加适量抗原（容量为50μl），周围各孔内分别加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度（图2-5）。
图2-4 双向扩散模型图2-5 免疫扩散试验2．特异性测定抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能力。
特异性好就是抗血清的识别能力强。
通常，特异性是以交叉反应率来表示的。
交叉反应率低，表示抗血清的特异性好，反之则特异性差。
交叉反应率一般是用竞争抑制曲线来判断的。
以不同浓度的抗原和近似抗原物质分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50时的浓度，按下列公式计算交叉反应率。
S=y/Z×100%S：交叉反应率，y：IC50时抗原浓度，Z：IC50时近似抗原物质的浓度。
如某抗原的IC50浓度为90Pg/管，而一些近似抗原物质IC50浓度几乎是无限大，可以说这一抗血清与其它抗原物质的交叉反应率近似零，即无交叉反应，该抗血清的特异性是好的。
3．亲合力在免疫学中，亲合力是指抗体与结合抗原体的活度或牢固度。
抗体与抗原结合疏松，结合后会迅速解离，称为亲合力低，反之，亲合力高。
亲合力的高低是由抗原分子的大小，抗体分子的结合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。
亲合力常以亲合常数K表示。
K的单位是升/摩尔（L/mol）。
在RIA中，K是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度）的倒数，K=1/[H]，[H]是最小检出量，通常，K的范围在108～1012L/mol之间，也有高达1014L/mol的。
计算亲合常数的方法20余种，计算出的K都不能真实反映实验情况，只能作为参考。
（七）免疫失败的可能原因及应采取的措施有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。
（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。
（2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。
（3）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。
（4）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。
（5）免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。
（6）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。
二、单克隆抗体的制备1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。
单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。
单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。
表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体的制备方法如下。
（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。
初次免疫1×107/0.5ml ip↓2～3周后第二次免疫1×107/0.5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv↓取脾融合（二）细胞融合1．细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。