抗血清制备原理、步骤及应用
抗血清的制备
抗血清的制备在资讯栏目看到有关免疫血清的制备，跃跃欲试，希望能够和大家分享一下我关于抗血清的制备的实验，希望高手可以指点指点．(一)实验目的(1)了解抗血清制备的基本原理。
(2)掌握抗血清制备的操作步骤及方法。
(二)实验原理用具有抗原性的物质注入健康动物机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经一定次数注射，使血清中的抗体组达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离出血清，从而获得抗血清。
为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。
对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。
本次实验是用颗粒性抗原(苏云金芽胞杆菌鞭毛及菌体抗原)制备相应的抗血清，这类抗原的免疫原性较强，不需加入佐剂也能获得特异性强、效价高的抗血清。
（三）实验器材(1)活材料：1)苏云金芽胞杆菌醋螟亚种(Bacillus thuringiensis subsp.galleria血清型H5ab)、加拿大变种(Bacillus thuringiensis var.canadensis 血清型H5ac)、库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki血清型H3abc)未知血清型的苏云金芽胞杆菌。
2)动物家免(大耳白，2—3kg),健康雄性或未孕雌免。
(2)培养基：供试培养基的配方如表1所示。
表1 三种培养基配方培养基培养基配方牛肉膏/% 蛋白胨/% 氯化钠/% 琼脂/% pH值软琼脂培养基1.0 1.0 0.2 0.5 7.2摇瓶培养基1.0 1.0 0.2 / 7.2斜面培养基1.0 1.0 0.2 2.0 7.2(3)器材：注射器(5Ml)、针头(5号、12号)、剪刀、胶布、纱布、离心管、止血钳、刀片、l0mL吸管、带橡皮塞无菌试管、平皿、接种环、100mL三角瓶(带橡皮塞)、量筒、小动物解剖台、青霉素瓶、镊子、甲醛、碘酒棉球、酒精棉球、干棉球、麦氏比浊管、生理盐水等。
抗血清制备
抗体是机体接受抗原刺激后产生的一种具有免疫特异性的球蛋白。
在免疫学实践，为制备抗体常以抗原性物质（细菌、病毒、类毒素、血清及其他蛋白质）给动物注射。
经过一定时间后，动物血清中可以产生大量的特异性抗体。
这种含有特异性抗体的血清称为免疫血清。
免疫血清不但对传染病的诊断、预防和治疗有重要意义，而且对器官移植，肿瘤以及某些科研工作也有重要意义。
抗体的产生通常与抗原的质和量、动物种类以及接种途径有密切关系。
因此在制备免疫血清时要根据抗原的不同选择适宜的动物种类和免疫方法。
一．抗菌血清的制备材料：1.动物：家兔2.菌种：伤寒杆菌H901，伤寒杆菌O9013.培养基：普通培养基4.其它：0.5%甲醛盐水，0.5%石灰酸盐水，无菌生理盐水，标准比浊管，离心机。
方法：1.抗原的制备：标准菌株的选择：所用的菌种伤寒杆菌H901和伤寒杆菌O901应具有典型形态菌落及生化反应。
在生理盐水中不发生自身凝集，与特异血清有高度凝集者可作为菌种。
2.菌液的制备Ⅰ.原液制备：H菌液的制备：将合格的伤寒杆菌H菌株接种于普通琼脂的克氏瓶或大试管内37℃孵育18—24小时。
肉眼观察有无杂菌生长，必要时作镜检。
用无菌甲醛生理盐水洗下菌苔，将洗下液体装入无菌试管内，置37℃恒温箱18—24小时以杀菌。
得到原液。
用作无菌试验即将菌液接种于肉汤及琼脂培养基培养4天，无活菌生长者才可使用。
O菌液的制备：将合格的伤寒杆菌H菌株依上法培养后，用无菌0.5%石灰酸盐水将菌苔洗下，洗液装入无菌试管置于37℃温箱中18—24小时杀菌得原液。
经检查无菌时可以使用（如无伤寒杆菌O菌株也可用H菌株制备O抗原。
即用0.5%石灰酸生理盐水洗下H菌菌液置100℃水浴60分钟，破坏其H抗原即为O菌液。
Ⅱ.应用液的制备：合格的原液用标准比浊管计算含菌落数目后，用生理盐水稀释至每毫升含菌10亿。
是为了应用液加入适量甲醛使其为0.25%，制备好的原液及应用液均保存在2—10℃冰箱中备用，有效期为1年。
常规抗血清的制备方法
离心
37。C摇动、 离心
1000rpm 由慢渐快1min、 1000rpm
10min 静止1.5min 7min
常规抗血清的制备方法
加入HAT培养 液悬浮细胞， 置于培养孔内
第21页
选择性培养
随机融合后细胞类型 HAT选择培养原理
常规抗血清的制备方法
第22页
随机融合后细胞类型
细胞组合
淋巴细胞 + 骨髓瘤 淋巴细胞 + 淋巴细胞 骨髓瘤 + 骨髓瘤 未融合淋巴细胞 未融合骨髓瘤常规抗血清的制备方法来自第28页多抗与单抗制剂比较
多抗
单抗
单抗
（血清） （腹水） （培养上清）
特异性抗体含量（mg/ml） 0.1-1
0.5-5 0.005-0.025
无关Ig含量（mg/ml）
10
0.5-1
—
其它血清蛋白
大量
极少
—
均一性
—
+
+
特异性
多决定簇 单决定簇 单决定簇
稳定性
很好
略差
略差
重复性
HGPRT
+ + — + —
生长状态
长久生长 短期生长 不能生长 短期生长 不能生长
常规抗血清的制备方法
第23页
核苷酸从头合成路径 （de novo synthesis）
核苷酸补救合成路径 （salvage synthesis）
氨基碟呤 （A）
HAT 核苷酸
次黄嘌呤 （H）
胸腺嘧 啶核苷 （T）
常规抗血清的制备方法
搜集时间：末次接种后72h
常规抗血清的制备方法
第18页
骨髓瘤细胞准备
抗血清制备 - 添加
抗血清制备抗原以常规的方法免疫家兔或小鼠获得相应的抗血清为多克隆抗体，不同的抗原和不同的动物，其免疫途径及抗原用量和免疫程序存在一定的差异，但步骤及方法大致类似。
初次免疫时，纯化的病毒以生理盐水稀释，与等量的弗氏完全佐剂进行乳化使之形成油包水乳剂，再次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化，最后一次注射不需要佐剂乳化。
一．佐剂乳化将抗原（如病毒）按注射剂量用生理盐水稀释后加入等量的佐剂，漩涡震荡20min,超声波200w,工作时间2s,间歇时间10s,处理2-3次，取出20ul,滴到冰水混合物上，如果油滴三分钟内不扩散，则说明乳化成功。
二．免疫流程实验室437小鼠注射量按照60μg-60μg -60μg -90μg。
三．取血一般第三次免疫后隔两周采血，取阴性血清胃对照，以1/200 μg/μl浓度的病毒抗原包被，利用ELISA测其效价。
血清初次的稀释可按1/100 1/1000 1/10000 1/10000.....如果效价较低可按流程再加强免疫一次。
取血可用间断式割尾法或一次性摘眼球法，取后将血置于37℃保温1h,然后5000rpm 离心10min,取上清，加入万分之一的叠氮化钠-60℃保存。
腹腔注射【定义】：腹腔注射是将药物注入胃肠道浆膜以外，腹膜以内．其吸收速度较快（2小时左右）。
【适应症】：人不常应用，有时可以作为特殊治疗手段，如多巴胺、速尿联合腹腔注射治疗肝硬化顽固性腹水。
当猪只较小而难以寻找耳静脉时，或天冷皮肤血管收缩或猪处于贫血消瘦情况血管不明显时，可以通过腹腔注射补液．以防脱水死亡，因下痢脱水1/3以上即有生命危险．【操作步骤】：小鼠腹腔注射腹腔注射是常见的给药方式，尤其是在麻醉时。
常见的麻醉方法均是麻醉药物腹腔注射。
1. 小鼠腹腔注射可以用1ml的注射器，配合4号针头。
2. 腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。
这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。
1实验一 免疫血清的制备及应用(1)
实验一免疫血清的制备及应用（1）免疫血清（溶血素）的制备【实验原理】用绵羊红细胞(SRBC)免疫家兔，可获得抗绵羊红细胞抗体(抗SRBC抗体)。
SRBC与抗SRBC抗体结合，在补体参与下，可出现红细胞溶解，因此抗SRBC抗体也称为溶血素。
【主要试剂与器材】1.健康雄性家兔、绵羊。
2.2%碘酒、75％酒精、无菌生理盐水。
3.0.10g/L硫酸镁生理盐水溶液。
4.无菌三角瓶(内装玻璃珠)、离心管、吸管、注射器。
5.离心机。
【操作方法】1.抗原制备（1）用碘酒、75％酒精消毒绵羊颈静脉处皮肤，抽血，缓慢注入含有玻璃珠的无菌三角瓶内，轻轻摇动三角瓶，脱纤维抗凝。
抗凝绵羊血用Alsever液可保存2周。
（2）无菌取抗凝绵羊血于离心管中，加适量生理盐水，2000r/min离心5min，吸去上清液和白细胞层，再用较多的无菌盐水与红细胞混匀，离心再弃上清，重复3次，最后一次离心10min。
（3）根据红细胞压积，用0.10g/L硫酸镁生理盐水溶液配成20％SRBC悬液。
2.免疫动物（1）取健康雄性家兔，通过耳静脉免疫，免疫程序见表1-2。
表1-2 溶血素制备免疫方案【结果判断】收获的抗血清应是无菌、无溶血的。
【注意事项】注意无菌操作，并尽可能多的采集血清。
【方法评价】溶血素方法简便易行，但是动物个体间产生溶血素质量差异较大。
【临床应用】溶血素可直接用于补体参与的溶血反应，如总补体溶血活性和单个补体成分溶血活性测定。
用溶血素和SRBC做指示系统，可进行补体结合试验。
【思考题】在制备绵羊红细胞过程中为什么要洗涤并吸去红细胞表面的白细胞层?。
抗血清 的制备
抗血清的制备抗血清制备是一种常见的免疫学实验技术，用于检测特定物质的存在和数量。
下面将对抗血清制备的原理、步骤及注意事项进行详细介绍。
一、原理抗血清是由动物免疫某种抗原制备得到的一种免疫血清，其中包含了特异性抗体。
抗血清制备的原理是通过注射一定量的特异性抗原到动物体内，使其产生特异性抗体，然后收集抗血清。
二、材料和试剂1.抗原：需要制备抗血清的特定抗原。
2.兔、小鼠等动物。
3.盐酸：用于调整兔抗血清的pH值。
4.取血器：用于采集动物血液。
5.离心管、离心机：用于收集血清。
6.不含菌的容器：用于保存抗血清。
三、步骤根据实验要求，制备特定抗原，可以是蛋白质、细胞、病毒、细菌等。
2.制作与抗原相应的抗体兔/小鼠选择适宜种类的动物，注射免疫原，隔一段时间后，在动物体内试验特异性抗体的出现，出现后即可采血制血清。
一般来讲，兔子被认为是制备抗血清的最佳动物，而小鼠常常会出现交叉反应。
3.采集兔血液注射完最后一次免疫原后一周左右，在一个清洁的容器上臂处用取血器采血2-3ml。
离心采集到的兔血液，定量将其分离出血清，再加入盐酸，调节pH值，即可得到兔抗血清。
5.评价抗血清的质量评价抗血清的质量，主要是通过测定抗体滴度来判断抗血清的特异性和强度。
四、注意事项1.严格控制免疫原和免疫过程，确保抗原和抗体的特异性和纯度。
2.合理选择免疫动物种类，不同种类免疫动物会对抗原产生不同反应。
3.采血时要注意安全和卫生，防止感染病毒和细菌。
4.在制备抗血清的过程中需要注意保护动物的健康和福利，并严格按照实验室安全规范操作。
抗血清制备
抗血清制备抗血清是一种广泛应用于医学、生物学、农业等领域的重要抗体。
它可以通过对动物实验的刺激来制备，具有较高的特异性和灵敏性。
本文将介绍抗血清的制备过程和应用领域。
一、抗血清的制备抗血清的制备需要对动物实验进行免疫刺激，让其产生免疫反应，生成相应的抗体。
制备抗体的方法有多种，包括:1. 多次免疫法：将抗原与适当的佐剂混合后注射给动物，每次注射间隔时间大于1个星期。
免疫周期主要根据抗原型以及免疫状态来确定。
一般情况下，需要多次免疫才能达到所需的浓度。
2. 单次免疫法：在抗原一侧布局NMDA表达杂交的细胞，给兔子单偏免疫或初免疫后再进行免疫，以提高抗体效价。
3. 聚集物制备法：将抗原加入雄鹰蛋白中，然后注射到家兔或小猪体内，以选育出抗体。
以上三种方法都有它们的优缺点，适用于不同的条件下。
二、抗血清的应用抗体在医学、生物学、农业等领域都有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 诊断：通过抗血清与疾病相关物质的特异性结合可以进行诊断，如HIV、狂犬病、乙肝等病毒感染的检测。
2. 治疗：抗体被广泛应用于治疗各种疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病、传染病等。
3. 细胞学：抗体可用于细胞学实验，用于检测细胞内、细胞表面或细胞核内的成分，如检测肿瘤细胞、细胞分离、特定蛋白识别等。
4. 农业：抗血清可用于畜牧业和农业生产，如检测动物或植物病毒感染、食品中添加的污染物等。
三、注意事项在制备抗血清时，需要注意以下几点：1. 选择优质的抗原，并进行适当的保护、存储。
2. 用药量应适当，尽量不要过多。
3. 对免疫动物的饲养和体温要求高。
4. 在注射时要注意卫生和安全问题，防止交叉感染。
5. 制备后需要进行充分的检测和鉴定，以确定抗体的特异性和效价。
抗血清的制备是一项重要的实验技术，应用领域广泛，但同时也需要谨慎和责任心。
只有严格遵守操作规定和注意事项，才能制备出优质的抗血清，促进科学的发展。
免疫血清的制备实验报告
六、教师评价
3。由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体。
4.多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外,还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原（如蛋白质类抗原）要加入佐剂，以增强免疫性。
四、实验过程及步骤
1.免疫接种
1)取一只健康大白兔固定在兔笼中
2）酒精消毒大白兔皮肤后，通过皮下或皮内注射方式接种大白兔，共计注射8-10个位置，每一处约0。1ml.
3)为提高免疫血清效价，通常需要进行2—3次加强免疫，每次免疫间隔10—15天。然后再接免疫结束后的血清采集过程。
4）注射完毕，将大白兔从兔台取下，放回饲养笼.
3）用结扎细线2根穿过颈动脉,远心端结扎，近心端备用。动脉夹夹住颈动脉近心端，用眼科镊手柄处将颈动脉抬起,然后用眼科剪斜向近心端剪开血管,插入动脉导管，两端分别用预留的结扎细线固定，打开动脉夹取血至锥形瓶后密封.
3.获得免疫血清
1）将采集的动脉血放到37℃温箱中，静置1小时。
2)在4℃冰箱内放置6-8小时,待血清析出。
3）将析出的血清转移至50ml离心管。离心管配平后，在4℃，以2000rpm转速离心5min。
4）待血清析出后,用移液器将其转移至离心管中离心，离心结束后,上层血清即为免疫血清，用移液器将其转移到离心管中，放置于-20℃冰箱冻存备用。
五、实验总结
1。多克隆抗体的制备很复杂,一般要多次间隔免疫，以便产生更多抗体.还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等.
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抗血清制备原理、步骤及应用
抗血清是一种含有高效价特异性抗体的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。
通过注射抗血清可以传递被动免疫治疗许多疾病。
一、抗血清制备原理：
将抗原注射于动物体，将引起免疫应答。
可刺激动物的淋巴细胞转化为浆细胞并产生特异性抗体，待血清中积累大量抗体时，采集动物血液并分离析出血清，此即含抗体的免疫血清（抗血清）。
抗血清包括抗细菌、抗毒素、抗病毒血清。
二、抗血清制备步骤：
1、选择免疫动物
➢免疫动物一般选择青壮年期、健壮雌性个体。
➢抗原与免疫动物的种属差异越远越好。
➢针对不同性质的免疫原选择相应的动物。
➢制备H血清用马，制备R血清用兔，制备补体用豚鼠血清。
２、抗原制备
➢抗原剂量：用灭菌生理盐水将抗原稀释为2mg/mL，与佐剂混合制成乳剂后用于动物免疫。
➢免疫原的注射剂量应考虑其抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。
通常小鼠首次抗原剂量为50～100μg/次，大鼠为100～200μg/次，兔为100～1mg/次，合成免疫原为2mg（半抗原约
为20～200μg），一般需要与等量的福氏完全佐剂混合。
加强免疫原与福氏不完全佐剂混合或不用免疫佐剂，剂量为首次计量的1/2。
➢抗原乳剂的配制：将等量的佐剂与抗原溶液倒入钵内，经过反复碾磨，形成油包水乳剂。
制成的油包水乳剂直接影响免疫效果，因此使用前需进行质量检查。
检查方法是将制成的乳剂滴一滴在自来水表面，质量合格的乳剂滴入水面保持滴珠完整不分散，不合格的乳剂立即扩散，水面油亦逐渐扩大。
若检查不合格，则须继续操作至质量合格为止。
３、确定免疫方案
➢根据免疫目的的要求、抗原性质、佐剂种类来制定免疫方案。
可采用全量免疫法、微量免疫法或混合免疫法。
免疫接种途径通常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、淋巴结等接种途径，对抗原的吸收速度为静脉=腹腔=淋巴结＞肌肉＞皮下＞皮内。
若抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法；半抗原宜皮内多点注射。
免疫接种剂量应根据分子量大小、免疫原性强弱、动物个体状态和免疫时间决定。
➢免疫间隔时间：第一次与第二次免疫的时间间隔一般以10～20天为佳，二次以后间隔时间一般为7～10天。
４、免疫动物（常规免疫方法–皮内多点注射）
➢第一次免疫：剂量为每只兔子注射1.0mL抗原乳剂（含抗原量1～2mg）。
注射部位为两只后脚掌的皮内各注射0.2mL，其余0.6mL分多点注入脊椎二侧、颈部、腹股沟和腋窝等处淋巴结附近部位皮内，每点可注入0.05mL，分12次注入。
➢第二次免疫：初次免疫后20天左右，剂量为1.0mL/只，加福氏不完全佐剂。
注射部位在腹部皮下多点注射，每点注入0.1mL。
➢第三次免疫：二次免疫7～10天后，注射部位和剂量同第二次免疫。
➢试血：末次免疫5～7d后，抽取少许静脉血，分离血清后进行试血。
采用免疫双扩散法测定效价在1:16以上即可放血，若效价较低，可继续加强免疫。
５、采血分离血清
➢放血：放血前动物应停食12h，如拟保留该免疫动物，可直接由心脏取血或切开耳缘静脉滴血或心脏穿刺取血。
取血后由静脉缓缓注入等量5%葡萄糖溶液以补充失血量。
取血的动物经2～3个月休息，可再次加强免疫后取血；如拟一次放血致死，可用颈动脉放血的方法。
➢分离血清：在无菌条件下，待血液自然凝固后，静置4℃冰箱，待血清析出后，经离心沉淀分出血清。
6、抗血清的鉴定与保存
➢抗体特异性鉴定：鉴定方法常采用双向免疫琼脂扩散技术。
➢血清抗体效价测定：测定方法常用的是放射免疫法和免疫双扩散法。
➢抗体纯度鉴定：采用SDS-PAGE法进行纯度鉴定。
➢抗血清的纯化：常见的纯化方法是提取特异性IgG。
特异性IgG抗血清制备：首先用硫酸铵或硫酸钠盐析法粗提丙种球蛋白，再进一步纯化。
粗提法提取γ球蛋白：采用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法，硫酸铵盐析法须经多次沉淀，经三次提取后的γ球蛋白大多属于IgG。
➢抗血清的保存：将鉴定合格后的抗血清，以1:100的比例加入1%的硫柳汞或5%的叠氮钠，使其最后浓度分别为0.01%或0.05%。
用无菌滴管将抗血清分装小管，每管装约1mL，置于4℃保存，可保存3个月～6个月；-70℃～-20℃保存可保存2～3年；真空冰冻干燥保存，可保存4～5年。
三、实验流程图
四、主要仪器试剂
➢抗原与免疫对象：抗原、健康家兔。
➢试剂：生理盐水、福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、注射器、石炭酸、防腐剂(1%的硫柳汞或5%的叠氮钠)等。
➢设备与器材：剪刀、镊子、注射器等器材和冰箱、离心机等设备。
五、注意事项：
(1)动物的免疫反应存在个体差异，因此制备血清时，应同时免疫3～4只。
(2)为制备单价特异性高的抗血清，所用抗原纯度越高越好，因此在纯化抗原过程中应尽可能除去可能存在的杂蛋白。
(3)要制备高效价的抗体，必须要加佐剂，但若抗原中存在杂蛋白，则可能因佐剂的存在而产生非特异性的抗体，所以要根据实验需要和抗原的纯度适当地使用佐剂。
(4)制成的抗原乳剂是否为油包水乳剂应进行检查，否则会影响免疫效果，若不是油包水乳剂，应重新制备。
(5)当抗原量过少不易提纯时，可采用抗原抗体在琼脂扩散中形成的沉淀线直接免疫动物制备抗体。
(6)抗血清效价一般以抗血清稀释倍数表示。
血清效价检测方法很多，灵敏度各不同，在表示抗血清效价时，应注意标明检测方法。
(7)分装保存的抗血清应标明抗血清的名称、效价、制备日期以及包装量。
六、抗血清的应用
1)疾病的紧急预防与治疗：当动物接种相应抗血清后，机体迅速得到大量非自身免疫抗体，从而快速中和侵入人体的病原，如抗猪瘟血清能有效控制猪瘟的疫情，抗犬瘟热血清对犬瘟热有独特的疗效。
2)疾病诊断和病原鉴定：血清学诊断方法在疾病诊断和病原鉴定中具有十分重要的地位，其中采用高效价特性的抗血清（阳性血清）作为反应的诊断物是血清学诊断方法的重点。
如口蹄疫细胞中和试验性血清、日本血吸虫病凝集试验阳性血清、衣原体病间接血凝试验阳性血清等。
3)抗血清还可用于微生物的鉴定、抗原的分析、免疫球蛋白的鉴定以及其他蛋白质的鉴定与研究。