慢病毒的浓缩与纯化——PEG-8000浓缩法
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
PEG收集沉淀病毒的方法
PEG收集沉淀病毒的方法
1、用超声波或冻融的方法使细胞破碎释放出病毒；
2、慢慢搅动并加入NaCl终浓度是0.5mol/L,有助于病毒的沉淀，再等量加入10％
PEG(一般使用的是PEG6000就可以了。
3、4过夜或放置一段时间；
4、8000r/min离心30分钟，收集病毒沉淀；
5、将病毒沉淀加入适量的PBS中，4℃过夜；
6、10000r/min离心1小时,沉淀即为浓缩的病毒。
还可以用梯度离心或其他方法进一步纯化。
取100mL毒液，10000r/min，10min，取上清。
上清中加入10Gpeg-20000和2gNaCl4℃
溶解过夜，20000r/min，离心30min，弃上清，留沉淀。
沉淀用3ml无菌PBS重悬，
转入透析袋中，2L预冷PBS透析液4℃透析，每4h换一次液，到第三次过夜透析。
将透析袋放入平皿中，覆盖蔗糖浓缩至1.5ml，500μl1支分装至EP管中。
-80℃备
用。
将细胞反复冻融3次后，则获得病毒液。
取500mL病毒液，于4℃2000rpm离心10min，取上清；在超净工作台中，向上清中加入PEG6000和10gNaCl，边加边轻轻搅拌混匀，于4℃溶解过夜（注意要溶解完全，防止有未溶解的PEG）；于4℃8500g离心30min，弃上清，留取沉淀；沉淀用1.5mL无菌的PBS重悬，转入透析袋中，置于2L的预冷的PBS中进行透析，每4h更换一次透析液，至第3次时透析过夜；用蔗糖进行浓缩，500μL/每支分装到EP管中，-80℃保存；采用紫外分光光度计和BCA进行蛋白定量，定量结果为20.5mg/mL。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法之巴公井开创作方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管(Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步调（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物平安柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直拔出到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管拔出到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
慢病毒生产及使用操作技巧介绍材料
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附录）2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一）293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共4 大格，每大格16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。
用PEG8000大量制备和纯化质粒的方法（实验室版）
用PEG8000大量制备和纯化质粒的方法（实验室版）PEG8000沉淀法大量制备和纯化腺病毒质粒1．取经小提质粒鉴定正确后的菌液于LB平皿上进行四区连续划线（划二区时，接种针无需烧灼处理），37℃培养过夜。
挑取1个单菌落接种到500 ml 含特定抗生素的LB培养液内（可用1000ml三角烧瓶），于37℃，250~300 rpm震摇过夜。
2．收集500 ml菌液至干净的离心管，离心，5000 rpm，20 min (肉眼观察上清液，应澄清、透明)。
3．弃上清，在洗水纸上扣干。
先后加入溶液Ⅰ10 ml （用洗管将细菌充分悬起、混匀）, 溶液Ⅱ20 ml（上下颠倒混匀20次、室稳静臵5 min）和溶液Ⅲ 15 ml（上下颠倒混匀20次）。
离心，5000 rpm，15 min。
4．转移上清至干净的50 ml离心管（如果膜状物质比较松散，可以用parafilm 进行简单过滤处理），加入0.6倍体积的异丙醇（27 ml），充分混匀。
离心，4000 rpm，15 min。
5．弃上清，用3 ml TE (1mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH8.0)充分溶解所有沉淀（用吸管操作），加入等体积5 M LiCl（此时总体积为6 ml），混匀（此时溶液呈白色浑浊状），离心，4000 rpm，15 min。
6．转移上清（6 ml）至50 ml干净的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇（3.6 ml），混匀。
离心，4000 rpm，15 min。
7．弃上清，用0.5 ml TE 充分溶解沉淀（首先应确定沉淀的位臵。
分两步溶解，先加300 μl充分溶解并转移DNA后，再用200 μl溶解剩余沉淀并转移。
溶解时，最好使用吸管），并将溶液转移至1.5 ml Ep管（此时溶液为无色、稍粘稠液体），加入5 μl RNaseA，37℃ 1 hr。
加入等体积的1.6 M NaCl 含13% PEG 8000，倒臵混匀数次，可观察到白色絮状沉淀。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩办法之羊若含玉创作办法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN A V ANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 办法步调（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并参加20ml Production造就基以便第二轮病毒的收集.将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中.（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物平安柜中风干并紫外消毒30min.（3）每个Ultra-clear SW28管参加30ml 预先处理过滤过的病毒上清.（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS 配制).将移液管一直拔出到离心管的底部，迟缓将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫.同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分离参加到另两个离心管中.另取一支清洁的移液管，对剩下3管进行同样处理.（5）务必确定离心管没有裂痕且用PBS调剂各管重量使两两平衡.（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h.（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀.管底可见少量的半透明或白色沉淀. 将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上过剩的液体.（8）每管中参加100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀.（9）将SW28超速离心管拔出到50ml锥底离心管中，盖上盖子.（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡.（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底.（12）用200μl移液器轻柔吹打使沉淀重悬.防止产生泡沫.将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保管于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃冻存.办法二 PEG-8000浓缩法(1)5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭尽 30min；保管在4℃.(2)使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；(3)每30ml过滤后的病毒初始液，参加5X PEG-8000+NaCl母液7.5 ml；(4)每20～30min混杂一次，共进行3-5次；(5)4度放置留宿；(6)4度，4000 g，离心 20min；(7)吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残存液体；(8)参加适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；(9)集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保管在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80 ℃办法三慢病毒纯化浓缩试剂盒1.每10ml过滤后的病毒初始液，参加Concen Solution 3ml，每20-30min混杂一次，共进行3-5次.2.2. 4℃放置留宿.3. 4℃，3000 g，离心45min.4. 去失落上清，静置管子1-2min，吸走残存液体.5. 参加无血清DEME充分溶解慢病毒沉淀.6. 病毒悬液分装成200μl每份,保管在离心管中，速冻后储存在-80 ℃.。
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2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。
3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。
5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。
6. 4℃，25，000 rpm. (82，700g) 离心2小时。
7. 小心将管子从转头中取出。
倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。
吸掉剩余的液滴。
在管底应当有可见的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。
9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
10. 在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
11. 4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。
13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。
方法二 PEG-8000浓缩法1. 5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200mlMilli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。