胚胎大鼠背根神经节神经元的培养与纯化

Abstract Objective To estabIish a simpIe and reIiabIe method for primary cuIture and purification of embryonic dorsaI root gangIion neurons. Methods DorsaI root gangIions （ DRG）from rat embryos were isoIated under microscope and dissociated in trypsin. The dissociated neurons were treated with 5-fIuorouraciI for purification. Immunocytochemistry was performed by doubIe staining with anti-caIcitonin genereIated peptide and anti-NF200 antibodies to evaIuate the purification rate of DRG neurons. Results IsoIated and cuItured DRG neurons surand the purified rate of DRG neurons couId reach to around 93% . Conclusion The vived and grew niceIy in the basis medium for neurons， above method is very usefuI to obtain dorsaI root gangIion neurons and to purify the neuronaI popuIation. Key words ceII cuIture； gangIia， spinaI； neurons
解放军医学杂志 2006 年 12 月 第 31 卷 第 12 期 Med J Chin PLA VoI 31 No 12 December 2006
［［ 1 作用及相关的止痛药物研究 ， 一氧化氮对 DRGn 的 ［［ 4 神经保护功能等 。此外， 由于胚胎大鼠 DRGn 处于 幼稚阶段， 具有体外较易成活、 组织相容性好、 排异反 应轻等特点， 还可用于细胞移植研究。有学者将胚胎 DRGn 发生的轴突拉长， 并植入受损伤的脊髓内， 结果 显示 DRGn 及轴突可在受体内存活， 并修复损伤的脊 ［［ 3 。 髓 由于神经节体积微小， 必须在解剖显微镜下操作， ［［ 5 本实验采用 Banker 等 介绍的方法解剖分离胚胎大 如超过孕 17 鼠的背根神经节， 以孕 15 天大鼠为最佳， 天， 则神经节与脊髓连接较紧密而不易摘离。培养体 加 系选用适于神经元存活、 生长的 NeurobasaI 培养基， （ NGF） 能够 入葡萄糖和 B-27 添加剂。神经生长因子 维持 DRGn 存活， 促进轴突生长、 延长， 因此在培养体 系中必不可少。 欲获得大量、 纯化的 DRGn， 需尽量去除 DRG 内的 其余杂质细胞， 如雪旺细胞和成纤维细胞等。抗有丝 分裂药物和差速贴壁法是最常用的两种方法， 如运用 得当， 二者均可获得较好的效果。有人认为抗有丝分 裂药物可能对 DRGn 有一定毒性而抑制其存活和生 长， 但在本实验中， 我们在培养后 48h 加入适宜浓度的 ［［ 3 5-FU ， 成功抑制了杂质细胞生长， 未对 DRGn 造成明
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解放军医学杂志 2006 年 12 月 第 31 卷 第 12 期 Med J Chin PLA VoI 31 No 12 December 2006
胚胎大鼠背根神经节神经元的培养与纯化
张军 许百男 李翀 孟祥辉
摘 要 目的 建立一种简单可行的胚胎大鼠背根神经节神经元培养和纯化方法。方法 取胚胎大鼠背根神经节， 通过胰蛋白 酶消化、 抗有丝分裂药物纯化等方法获得背根神经节神经元。采用降钙素基因相关的缩氨酸和神经丝蛋白双重免疫细胞化学染色法 纯度可达到 93% 左右。结论 此培 鉴定并测定神经元的纯度。结果 分离培养的背根神经节神经元在适宜的培养基中生长良好， 养方法简单、 易行， 能培养和纯化出大量背根神经节神经元。 关键词 细胞培养； 神经节， 脊； 神经元 中国图书资料分类号 R394. 26
包被 1h 后吸除多聚赖氨酸， 在超 入 1mI 多聚赖氨酸， 净台内晾干 1h， 最后用 PBS 冲洗， 晾干备用。 1. 3 显微手术分离背根神经节 将孕鼠置于含乙醚 的容器内， 麻醉后用 70% 乙醇消毒腹部皮肤， 剖开腹腔 取出胚胎。去除胎鼠的头、 尾和腹部， 在解剖显微镜 （ OIympus， 日本） 下用显微镊分开椎体， 暴露椎管内的 脊髓， 并 小 心 将 脊 髓 从 椎 管 内 提 出。背 根 神 经 节 （ DRG） 呈串珠样位于脊髓的两侧。逐个摘除脊髓两旁 的 DRG， 置于 4C L-15 培养基中备用。 1. 4 DRGn 的培养和纯化 将 DRG 自 L-15 培养基移 入 4mI 0. 25% 胰蛋白酶内， 37C 消化 40min。1 000r / min 离心 5min， 吸去胰酶消化液， 加入 FBS 中止消化。 1 000r / min 离心 5min， 吸除 FBS 换入常规培养基， 并用 细头吸管反复吹打制成单细胞悬液。细胞计数后， 按 6 10 / mI 密度接种于预先已包被多聚赖氨酸的 6 孔细胞 培养板内。37C 、 5% CO2 条件下培养 48h 后， 更换含 5FU 的抗有丝分裂培养基， 以抑制成纤维细胞和雪旺细 胞等非神经元细胞的增殖。72h 后， 更换 DRG 常规培 养基， 每周换液 2 次， 在倒置相差显微镜下， 观察培养 后不同时间点 DRGn 的形态。 1. 5 免疫细胞化学染色鉴定 DRGn 及测定纯度 取 培养 8 天后的 DRGn， 吸除培养液， 0. 01moI / L PBS 清
解放军医学杂志 2006 年 l2 月 第 3l 卷 第 l2 期 Med J Chin PLA Vol 3l No l2 December 2006
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洗 2 次， 4% 多聚甲醛室温下固定 lh。再用 PBS 洗 3 次， 每次 5min， 换入 4% 山羊血清 （ NGS ） ， 室温作用 30min。吸除 NGS， 加入第一个一抗： 抗神经丝单克隆 抗体 （ NF200， lf l 000） ， 4C 过夜后， PBS 冲洗 3 次。加 入第一个二抗： 山羊抗鼠红色荧光抗体 （ Alexa Fluor Red 594， lf 250） ， 室温下作用 lh。PBS 冲洗 3 次， 加入 第二个一抗： 兔抗鼠多克隆抗降钙素基因相关的缩氨 lf l 000） ， 4C 过夜， PBS 冲洗 3 次， 换入 酸抗体 （ CGRP， 山羊 抗 兔 绿 色 荧 光 抗 体 （ Alexa Fluor Green 488， lf 500） ， PBS 清洗 3 次， 培养板每孔留置 2ml PBS， 密封 4C 保存。在荧光显微镜 （ Olympus） 下观察培养细胞的 显色情况， 二者均染色的为 DRGn。放大 200 倍下随机 计数细胞总数和 DRGn 数量， 最后计算 选取 5 个视野， 出细胞纯度。 2 结 果 2. 1 DRGn 的形态特征和生存规律 经胰蛋白酶消化 雪旺细胞和成纤维细胞为 后的细胞悬液主要以 DRGn、 主。大部分细胞在接种后 6 ~ l2h 内贴壁， DRGn 呈类
鼠。Leibovitz’ s L-15 培养基、 NeurobasaI 培养基、 胎牛 血清 （ FBS ） 、 葡萄糖和 B-27 添加剂、 神经生长因子 购自 Gibco 公司， 多聚赖氨酸 （ PLL） 、 胰蛋白酶 （ NGF） （ Trypsin） 、 氟尿嘧啶 （5-FU） 购自 Sigma 公司； 免疫组化 试剂包括抗神经丝单克隆抗体 （ NF200， Sigma） ， 兔抗鼠 多克隆抗降钙素基因相关的缩氨酸抗体 （ caIcitonin gene-reIated peptide， CGRP， Sigma） 、 山羊抗鼠红色荧光 抗体 （ AIexa FIuor Red 594， Invitrogen ） 、 山羊抗兔绿色 Invitrogen） 。 荧光抗体 （ AIexa FIuor Green 488， 1. 2 培养基和培养板的准备 常规 DRGn 培养基： 含 NeurobasaI 培养基、 1% B-27、 1% FBS、 2. 5g / L 葡萄糖、 10ng / mI NGF。抗有丝分裂培养基： 在常规培养基内加 向 6 孔培养板每孔加 入 20!moI / L 5-FU。在超净台内，
球形， 雪旺细胞为两端带有长突起的梭形， 而成纤维细 胞则为不规则的多角形， 无明显的突起。DRGn 在贴壁 即长出小的突起， 72h 后突起明显伸长， 并相互 后 24h， 连接成网状， 同时胞体相互聚集成簇 （图 l） 。生长速度 相对较快的雪旺细胞和成纤维细胞在抗有丝分裂药物 的作用下， 大部分死亡， 最终使培养体系内以 DRGn 为 主， 仅参杂少量雪旺细胞和成纤维细胞。DRGn 在培养 即抗有丝分裂处理后 3 天， 多表现出较好的生 后 8 天， 长状态， 并维持 l ~ 2 周。培养 2 ~ 3 周， DRGn 开始变 性死亡。 2. 2 DRGn 的鉴定和纯度测定 培养后 8 天的 DRGn 多表达特异性的 CGRP， 荧光显微镜下显示为绿色， 但 DRGn 还表达非 细胞突起未染色。同时， 作为神经元， 特异性的神经丝蛋白 （ NF200 ） ， 在镜下为红色荧光反 应， 胞体和突起均染色。将二者图像融合后， DRGn 表 现为黄色， 周围是红色的网络状突起 （图 2） 。将 DRGn 数量与相差显微镜下所有细胞数量比较， 计算出 DRGn 的纯度为 93% 。
作者简介： 张军， 医学硕士， 主治医师。主要从事颅脑外伤的基础与临床 研究 作者单位： 100853 北京 解放军总医院神经外பைடு நூலகம் （张军、 许百男、 李翀、 孟祥辉）