大鼠体外受精技术研究进展

大鼠体外受精技术研究进展张春燕1, 2，刘丽均2，徐平2，芮荣1*1南京农业大学动物医学院，南京210095；2中国科学院上海实验动物中心，上海201615摘要：目前，体外受精技术在多种哺乳动物已取得成功并获得广泛应用。

大鼠由于其本身的特殊性，体外受精及随后的胚胎培养一直比较困难，国内关于大鼠体外受精方面的研究更是少有报道。

文章主要从卵母细胞体外培养、精子获能、受精、受精卵体外培养及胚胎移植等方面着手，对国外大鼠体外受精的研究现状作一简要综述。

关键词：大鼠；体外受精；胚胎培养；胚胎移植体外受精（IVF）是指在体外环境完成精卵结合的过程。

体外受精研究的深入开展，不仅加深了人们对受精机制的认识，也为动物繁育、治疗人类不孕症提供了有力的手段。

目前，该项技术在小鼠、兔、山羊、猪和牛等动物及人类已日趋成熟，并得到广泛应用；但在国内少有大鼠体外受精的报道。

现将该领域的研究现状作一综述，以供参考。

1. 大鼠体外受精研究简史事实上，大鼠是较早用于体外受精研究的实验动物之一。

早在1968年，Toyoda 和Chang 就开始了大鼠体外受精技术的研究，但只能使去除透明带的卵子和精子在体外受精[1]。

1973年，Miyamoto和Chang利用从交配雌鼠子宫内收集的精子进行体外受精时发现，子宫内收集的精子可以使透明带完整的卵子受精[2]。

从而用实验证明，以前的体外受精之所以不成功，关键是精子在体外培养时没有获能，不具备穿过透明带使卵子受精的能力。

1974年，Toyoda 等研制出适合于大鼠精子体外获能的培养液，由此逐步建立起大鼠体外受精技术[3]。

近年来，研究者在精子获能液、胚胎培养液及提高体外受精胚胎质量方面做了大量研究，目的是尽量模拟体内受精和胚胎发育环境，探索大鼠体外受精的最适条件，以提高其胚胎体外生产效率。

2. 研究方法及进展完整的体外受精技术包括：卵母细胞的体外成熟（IVM）；精子获能；体外受精；早期胚胎培养和移植。

而胚胎移植结果仍是鉴定体外受精胚胎质量的最有效证据。

2.1 卵母细胞的来源与体外成熟2.1.1收集卵巢未成熟卵母细胞哺乳动物的卵巢上有大量未成熟、处于不同发育阶段的卵母细胞，这部分卵母细胞需经IVM培养后，方可用于体外受精。

获得卵巢卵母细胞的方法主要有两种：（1）机械分离法－利用穿刺针将卵巢表面的卵泡刺破，释放出卵母细胞；或是采用切割法，将整个卵巢切碎后收集卵母细胞。

穿刺法采卵数量少，切割法获卵数较多，但切割法会产生更多裸卵或造成卵丘细胞损伤。

（2）胶原酶消化法－该方法主要用于腔前卵泡卵母细胞的分离。

大鼠大卵泡（直径>350um）卵母细胞的体外培养，通常使用含15％灭活血清的MEM (Eagle’s Minimum Essential Medium)作为培养液，培养12 h后检查成熟发育情况，以生发泡破裂或第一极体排出作为成熟的判断标准。

*通讯作者，Email：rrui@。

在进行腔前卵泡卵母细胞分离培养时，通常取10或11日龄大鼠卵巢，洗净后放入3ml 含4mg/mL胶原酶与10ug/mL脱氧核糖核酸酶的MEM培养液中，置于37℃ CO2培养箱内孵育30-45 min，再用吸管反复吹打，驱散卵巢组织，收集腔前卵泡。

基础培养液为添加有1 mM 丙酮酸钠、0.25 M尿苷、3 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）、50 ug/mL庆大霉素、5 ug/mL胰岛素、5 ug/mL转铁蛋白、5 ng/mL硒和2 mM次黄嘌呤的MEM培养液，其渗透压约为300，pH 值为7.3。

隔天换液一次，培养20 d后观察卵母细胞生长和成熟分裂情况。

在卵子成熟过程中，卵质、核和膜的同期化“成熟”对于正常受精和发育至关重要。

研究表明，卵母细胞的体外培养和发育与其后的受精率和囊胚发育率相关性很大。

卵泡液有促进卵质成熟的作用，而卵丘细胞的存在不仅对核成熟有利，并且对体外受精与其后的胚胎发育有利，而且这种作用还可通过向培养液中添加血清或卵泡液得到加强[4]。

尽管促卵泡素（FSH）和卵巢类固醇激素对卵母细胞核成熟没有明显的作用，但对卵母细胞成熟后的正常体外受精起着十分重要的作用[5]。

胎牛血清（FCS）可以阻止卵母细胞体外培养时的透明带硬化，有利于精子穿透；并可缩短透明带被胰蛋白酶溶解的时间，但对卵母细胞核和胞质影响不大[6]。

2.1.2 体内成熟卵母细胞即从经超数排卵处理的雌鼠输卵管内采集体内成熟的卵母细胞。

超排技术在许多哺乳动物上均有应用，但由于遗传背景的不同和发情周期的差别等原因，对性成熟大鼠的超数排卵收效甚微。

Armstrong 和Opavsky（1988）采用连续几天注射FSH的方法，结果获得大量有发育能力的附植前胚胎[7]。

近年的研究发现，对65g左右的未成熟大鼠，可间隔48 h腹腔分别注射10 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG），可获得大量有受精能力的成熟卵母细胞。

2.2 精子获能一般认为，哺乳动物的精子必须在雌性动物生殖道内停留一段时间后，才具备使卵子受精的能力，称之为精子获能。

获能是哺乳动物精子受精时独具的特征，一般有两个显著的变化，一是脱去精子表面的某些大分子物质和去能因子，这是一个可逆的生理学变化；二是诱发顶体反应，出现顶体结构的变化。

精子获能的方法有体内获能和体外获能两种。

体内获能是早期进行体外受精研究时常用的方法，即从交配后一定时间的雌鼠子宫内获取精子，再用于体外受精。

体外获能指在体外培养条件下使精子完成获能的方法，精子获能是体外受精中一个关键性技术环节，是影响体外受精结果的重要因素之一。

影响大鼠精子获能的因素很多，常见的因素包括（1）钙离子（Ca2＋）－Ca2＋在诱发精子顶体反应中起重要的作用，钙离子载体能与Ca2＋形成复合物，携带Ca2＋进入精子，从而诱发顶体反应并激活顶体酶。

（2）BSA－BSA对于仓鼠、小鼠和牛的IVF都不是必需的，但对大鼠IVF必不可少[8]。

BSA可能改变精子的胆固醇含量，调整精子的脂肪水平，从而改变精子膜的稳定性。

精子一旦获能，BSA可促进其迅速穿过卵子。

（3）渗透压－当渗透压为310时，有利于大鼠精子获能，低于290时则获能不好[8，9]。

需要说明的是，这种渗透压是通过增加NaCl浓度，而不是通过增加山梨醇来实现的。

由此可见，精子穿透力的提高可能不仅仅是渗透压的作用，还与高浓度的NaCl有关。

（4）pH值－大鼠精子获能的最适pH为7.2－7.4。

pH值偏高可致快速获能，但不利于精子生存；而偏低则获能时间会大大延长，不利于体外受精的进行。

长久以来，用于大鼠的体外受精液仅仅局限于mKRB液。

2004年， Jiang等首次尝试以IVF20作为受精液对SD和Wistar两品系大鼠进行体外受精。

结果发现，Wistar 受精率可达78％；在IVF20中添加30 mM NaCl后，SD品系的体外受精率可达73％；体外受精后的胚胎都能以较高比例发育到囊胚（47％），并在移植后能完成全程发育 [9]。

2.3大鼠体外受精体外受精不仅依赖于卵母细胞的成熟培养和精子获能，而且精子浓度、精卵相互作用的时间，培养液和培养温度、CO2含量等也是重要的影响因素。

2.3.1 精子的获取和培养取3 mon以上有繁育能力的雄鼠，颈椎脱臼处死，腹部75％酒精消毒，打开腹腔，取附睾尾。

用眼科剪小心将附睾尾周围的脂肪剥离，在灭菌滤纸上去除血迹和脂肪，用眼科剪在附睾尾上剪个小口，可见有乳白色精子团涌出，用穿刺针挑入预先平衡过夜的受精液滴中。

温箱孵育5 min后，取10-30uL精子悬液，移入另一新鲜液滴，使精子浓度达1.0ⅹ106个/mL，培养条件为5％CO2、95％空气、饱和湿度和37℃，5-7 h后完成获能。

2.3.2 卵子的获取和受精对雌鼠进行超数排卵，于hCG注射后14 h颈椎脱臼处死雌鼠，剪离输卵管，撕破膨大部，将卵团引入获能好的精子悬液中，每400 uL液滴中含10-40个卵母细胞，温箱孵育12 h 后即可完成受精。

2.4 胚胎培养受精后的大鼠胚胎要在体外培养到槡椹胚或囊胚后再移植给受体，才会获得较高的妊娠率。

目前，哺乳动物胚胎在体外培养中普遍存在早期发育阻滞现象。

如牛胚胎的发育阻滞常发生在8-16细胞，猪为4-细胞，仓鼠为2-4细胞，小鼠为2-细胞。

研究早期，大鼠胚胎体外培养时经常阻滞在2-4细胞期。

Kishi等尝试用培养仓鼠胚胎的HECM-1培养液培养大鼠原核期胚胎，48 h后57.9％的胚胎发育到了4-细胞；随后的8-细胞、桑椹胚和囊胚形成率分别为32.2％，17.4％和9.9％[10]。

Kishi等首次报道体外培养大鼠胚胎成功发育至囊胚[11]。

后经改良，把HECM-1中的NaCl浓度从98.0 mM降至78.8 mM，再添加7.5 mM葡萄糖和20种必需氨基酸，发展成现在通用的mR1ECM培养液，囊胚发育率可达80％以上[12]。

2000年，Goh等经实验改良又发明出R2ECM培养液，适用于大鼠2-细胞胚胎至囊胚的发育[13]，囊胚发育率可达80％以上。

此外，通过兔输卵管上皮共培养亦可克服大鼠胚胎的体外发育阻滞，采用该培养体系，59％的受精卵可发育到槡椹胚或囊胚[14]。

2.4.1影响大鼠胚胎体外培养的因素常见的影响因素有：（1）磷酸盐－它的存在对大鼠早期胚胎的发育有阻滞作用；但有研究表明，大鼠1-细胞胚胎在体外培养80 h后，添加磷酸盐可提高囊胚形成率。

当培养110 h 后，添加磷酸盐的囊胚形成率可达94％，不作添加仅为67％[15]。

(2)葡萄糖－葡萄糖对早期胚胎发育影响不大，不具有明显的抑制或促进作用；但桑椹胚期后添加葡萄糖可提高囊胚发育率[16]。

(3)渗透压和BSA－大鼠受精卵若在原核形成前转入mR1ECM培养液中，则发育能力降低；而经mKRB预培养后则发育率较髙。

后来的研究发现，渗透压和BSA在精子穿透卵子后的预培养中起着重要作用，是受精后卵母细胞发育到囊胚的必需因子[17]。

然而，支持最大发育率的最适BSA浓度与渗透压尚需进一步研究。

3. 存在问题经体外受精得到的胚胎在移植后能成功完成全程发育，但窝仔数下降，并且超过一半的母鼠在怀孕13－20 d时终止妊娠。

体内与体外受精后，经mR1ECM培养至桑椹胚或囊胚再移植，也得到类似的结果。

表明目前所用的培养条件仍与体内生长环境存有差距，有待于进一步完善。

不同品系的大鼠在相同IVF条件下，尤其是使用冷冻精子做IVF时，其受精率的差异很大。

不同品系来源的精子对溶液渗透压的敏感性不同，这一点已经在小鼠、牛、猪和人类得以证实。

因此，遗传背景不同可能会导致精子特性的差别及对渗透压耐受性的不同，在大鼠上仍需证明这一点。

4. 前景展望大鼠是仅次于小鼠的重要实验动物，在过去一个世纪中它一直是首选的啮齿类实验动物，被广泛地用于生物医学研究。