大鼠胚胎神经干细胞单克隆化及单层化培养和鉴定
大鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性
大鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性商爱民;吴靖芳;薛刚;张静;张耕【摘要】目的:探讨影响大鼠胚胎成纤维细胞(REF)分离和培养的一些因素,以建立稳定的REF培养体系.方法:取SD大鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对REF的生长形态、生长曲线进行观察,以探讨不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对REF分离及培养的影响,并对其进行免疫细胞化学鉴定.结果:13.5d 胎龄鼠胚的REF分离效果优于10.5d、18.5d 胎龄鼠胚;REF在体外为贴壁生长型细胞,第三代细胞增殖旺盛;并表达波形蛋白(vimentin)、层黏连蛋白(laminin,LN)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)蛋白.结论:13.5d 胎龄SD大鼠REF以H-DMEM做培养基,在第3代增殖旺盛,合成多种细胞外基质,最适宜作胚胎干细胞或其它悬浮培养细胞的饲养层.【期刊名称】《神经药理学报》【年(卷),期】2010(027)003【总页数】4页(P17-20)【关键词】大鼠;胚胎;成纤维细胞;层黏连蛋白;纤维连接蛋白【作者】商爱民;吴靖芳;薛刚;张静;张耕【作者单位】河北北方学院教务处,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000;河北北方学院附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000【正文语种】中文【中图分类】R329.2;Q256胚胎成纤维细胞饲养层是体外成功培养人胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)细胞的必要条件。
主要分泌某些细胞因子如成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子[1],以促进 ES细胞增殖以及抑制分化。
同时又能分泌细胞外基质,如纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、层黏连蛋白(laminin,LN)等。
海马神经干细胞的分离、培养与鉴定
显 示 神 经 元 、 状 胶 质 细胞 、 星 寡树 突 细胞 抗 原 阳性 。 结论 ： 海 马 分 离 出 的 细 胞 具 有 自我 更 新 、 殖 和 分 化 能 从 增
力 ， 神经 干细胞。 是
关 键 词 神 经 干 细 胞 海 马 大 鼠 细 胞 培 养
分类 号 Ｒ７ １ ０ ４ ．５
维普资讯
第 １ ２卷 第 １ ９期 ２０ ０ ２年 ｌ Ｏ月
中 国 现 代 医学 杂 志 Ｃｈｎ ｏ ｍ ￣ ｏ ｏ ｅｎ Ｍ ｅ ｉｉ ｉａＪ ｕ ｆＭ ｄ Ｆ ｄｃｎｅ
Ｖｏ ． ２ Ｎｏ． ９ １１ １ ０Ｃ ．２ ０ ｔ ０２
Ｉ ＯＬＡＴＩ Ｎ ． Ｓ Ｏ ＣＵＬＴＵＲＥ ＡＮ Ｄ ＤＥＮＴＩ ＣＡＴＩ Ｎ Ｆ ＮＥＵＲＡ Ｌ Ｉ ＦＩ Ｏ Ｏ Ｓ ＴＥＭ ＣＥＬＬＳ Ｉ ＲＡ ＴＳ’ Ｈ Ｉ Ｎ ＰＰＯ ＣＡＬＭ ＰＵＳ
Ｌｉ ｕ Ｂａｉａｎ ， ｉ ｇｑ ｙ ＬｉＸ ｎ ｕｎ ， ａｎ Ｚｈ ｇｈｕ ｘｉ ， ｅ ． ａ ａｎ ｔａ１
个 克 隆 进 行 连 续 传 代 培 养 ， 免 疫 组 化 检 测 ｎｓｉ 原 和 分 化 后 神 经 细 胞 特 异 性 抗 原 。 结 果 ： 海 马 获 得 的 用 ｅｔ ｎ抗 从
细胞 群 能 够 连 续 传 代 ， 离后 的 单 个 细 胞 能 形成 事 迹 球 ， 疫 检 测 为 ｎｓｉ 性 ； 外 、 内分 化 的细 胞 分 别 分 免 ｅｔ ｎ阳 体 体
［ ｂｔａｔ Ｏｂｅｔ ｅＴｏｉ ｌｔ ｎａ ｄｉｅｔｉ ｔ ｎｏ ｅ ｒｌｔｍ ｅｓｉ ｒｔ’ ｉｐｃｌ ｕ ． ｔｏ ｓＣ ｌ Ａ ｓ ｃ］ ｊｃｉ ： ｏａｉ ｎ ｎｉｃ ｉ ｆ ｕａ ｓ ｃｌ ａｓ ｈｐｏａｍｐｓ Ｍｅｈｄ ： ｅ ｓ ｒ ｖ ｓ ｏ ｄ ｆａｏ ｎ ｅ ｌｎ ｌ
大鼠Müller细胞的体外培养及免疫组织化学鉴定
大鼠Müller细胞的体外培养及免疫组织化学鉴定王芳;赛音·贺西格;佘振珏;肖虹蕾;周国民【期刊名称】《解剖学杂志》【年(卷),期】2005(028)005【摘要】Müller细胞是视网膜中一种非常重要的胶质细胞。
成熟的Müller细胞发出很多分支包围、分隔神经元的胞体和突起。
研究表明Müller细胞在外伤或光损伤后可表达多种生长因子，这些生长因子除对神经元具有保护作用外，对细胞外环境也具有调控作用。
因此，Müller细胞在视网膜中的作用正日益受到人们的重视。
而Müller细胞的培养方法主要有组织块贴壁培养法和酶解法。
本实验应用酶解法成功分离了大鼠视网膜的Müller细胞，并进行体外培养、免疫组化鉴定，为进一步研究胶质细胞在中枢神经系统的作用提供实验基础。
【总页数】3页(P599-601)【作者】王芳;赛音·贺西格;佘振珏;肖虹蕾;周国民【作者单位】复旦大学上海医学院解剖与组织胚胎学系,上海200032;复旦大学生命科学院;复旦大学附属眼耳鼻喉医院【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.全反式视黄酸对体外培养大鼠Müller细胞生长的影响 [J], 张艳莉;聂玉红;许洁娜;潘竹娟;黄强;吴开力2.新生大鼠视网膜Müller细胞原代培养纯化及鉴定 [J], 李传旭;梁林晖;谢伯林;曾骏文3.高浓度葡萄糖对体外培养大鼠Müller细胞P2Y2受体的影响 [J], 张海宁;惠延年4.大鼠视网膜Müller细胞体外培养特性 [J], 李春花;郑玉萍;周婷洁;雷晓琴;王润生;宋虎平;马为梅5.康柏西普对体外培养的大鼠Müller细胞锌离子转运体8表达的影响 [J], 康道欢; 史彩平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
胎脑神经干细胞的培养及鉴定
１ｃ ｍ脑组织 一块 或 多块 ， 速 浸入 新 配 的中性 福 尔 迅
马林溶 液 ， 固定 ２ 。按 常规 系列 酒精 脱水 、 甲 再 ４ｈ 二 苯透 明 、 温箱 （５～ ６℃ ） 蜡 、 埋 ， 蜡切 片 黏 恒 ５ ５ 浸 包 石
着色较均匀 。室管膜下 区、 马、 海 纹状 体、 丘脑 、 嗅
①免疫组化检测 Ｎ ｓｎ的表达 ： ｅｔ ｉ 胚胎在
娩 出后 ０５ｈ内取 完 整脑 组 织 固定 于 中性 福尔 马林 ．
溶 液 ０ ５～１ｈ 待 脑 外层 稍硬 后 ， ． ， 用手 术 刀刺破 脑 膜 将胎脑组 织固定 ２ 。然后从 不 同部位 切取厚 ０ ５～ ４ｈ ．
２ １ 人 胎 脑 组织 Ｎ ｓｎ的 表达 Ｎ ｓｎ阳 性 着 色 ． ｅｔ ｉ ｅｔ ｉ 为棕黄 色颗 粒 ， 主要位 于神 经干细 胞 的胞 浆 中 ， 别 个 细胞胞 核着 色 。阳性 细 胞 呈 单个 细 胞 或 成 簇存 在 ，
球 、 等 部位 发 现数 量 不 等 的 Ｎ ｓｎ阳 性着 色 细 皮层 ｅｔ ｉ
胞， 小脑 、 干 、 髓部 位未 检测 到 Ｎ ｓｎ阳性 细胞 。 脑 脊 ｅｔ ｉ
于多 聚赖 氨 酸处 理 后 的玻 片 上 ， 温保 存 ， Ｎ ｓｎ 室 行 ｅｔ ｉ
２２ 细 胞 标 志 物 的 鉴 定 将 收 集 到 的 神 经 球 行 ． Ｎ ｓｎ免 疫荧 光染 色 ， 果显示 神经 球 呈绿 色荧 光 。 ｅｔ ｉ 结 原代 培养早 期形 成 的 细胞 团 ， 见 某 些 细 胞 团 中有 仅 散在 的极 少量 阳性 细胞 ， 而培 养 ３～ ４代 后 ， 细胞 球
载玻 片 ） 诱导分化 ５～ ， 出载 玻 片 ， 免 疫荧 光 ， ７ｄ取 行 细胞化 学检测 。
动物细胞工程
动物细胞工程第一章动物细胞工程概论一、动物细胞工程的概念1.动物细胞工程的定义动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的技术方法对动物细胞进行各种操作并使其在体外生长、增殖、分化以生产有用产品或引向成体化（产生新型生物个体）的技术体系，是生物技术（生物工程）的重要组成部分。
狭义细胞工程指对细胞个体进行的各种操作，广义的细胞工程包括对细胞、组织、器官所进行的各种操作。
2.动物细胞工程研究的主要内容以狭义细胞工程为主，兼顾组织、器官工程等内容的研究。
(1)狭义细胞工程：研究体外分离、培养、增殖、分化动物细胞的条件以及保存、操作及利用动物细胞的工艺技术体系。
(2)组织工程：研究体外培养、增殖动物组织的条件以及保存、操作及利用动物组织的工艺技术体系。
(3)器官工程：研究体外培养、增殖器官的条件以及保存、操作及利用动物器官的工艺技术体系。
(4)动物胚胎工程：研究动物胚胎生产、保存、操作及移植的工艺技术体系。
3.动物细胞工程研究的意义(1)是动物繁殖的重要技术手段加快动物繁殖速度：A.体外受精生产胚胎 B.胚胎移植生产动物(2)是人类辅助生殖技术的重要组成部分体外受精—胚胎移植技术，可以克服雄性不育和雌性不孕；(3)是动物遗传育种的重要技术手段对精子或卵子进行遗传操作，或利用细胞融合、胚胎嵌合技术可以使若干个动物性状进行有机组合，产生新的生物个体；(4)生产药物直接培养细胞或组织，从细胞或组织代谢物中直接获得药物;对细胞进行遗传操作，生产转基因动物，利用转基因动物生产药物（生物反应器）；(5)保存珍惜动物资源由于动物克隆技术的成功，保存细胞、组织、胚胎，就意味着保存一个生命个体，保存细胞、组织、胚胎，就意味着保存一个生物种群(6)提供人类器官移植的材料人类器官移植发展很快，目前可以进行心脏、肝、肾脏移植，可以进行皮肤、角膜、骨髓细胞移植。
三、动物细胞工程讲授的主要内容1.动物细胞、组织培养2.动物细胞融合3.动物细胞重组4.向细胞内引入高分子物质5.动物细胞冷冻保存6.动物胚胎工程四、动物细胞工程实验（实习）内容1.实验仪器设备的识别与使用2.动物细胞培养用液的制备3.动物胎儿成纤维细胞分离与培养4.动物细胞常规检查和生物学检测5.培养细胞的冻存与复苏五、动物细胞工程研究取得的重要进展1.精液采集、精液冷冻与人工授精技术的成熟和发展，为充分发挥利用雄性动物生殖潜力奠定了基础；2.雌性动物卵母细胞体外成熟培养技术的成功，使人们在体外完成动物生殖过程成为可能；3.体外受精与胚胎移植技术的成功，产生了试管婴儿，试管牛，试管猪，试管山羊，试管兔；4.细胞核移植技术的成功，使人们克隆高等哺乳动物的梦想得以实现体细胞核移植、胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植技术的成功，为克隆动物和转基因动物生产提供了技术支撑；5.胚胎干细胞与组织干细胞成功分离、体外扩增与诱导分化研究的成功，为人类医学发展提供了宝贵的材料；胚胎干细胞，胰腺干细胞，神经干细胞，骨髓干细胞，皮肤干细胞，角膜干细胞6.转基因细胞（细胞转染基因）技术的成功，为转基因动物的生产创造了条件；7.胚胎嵌合技术一种或两种动物胚胎共同生长发育形成一个生物个体的技术，即在一个生物体内，含有来源于两个不同胚胎的细胞和组织；8.细胞融合技术将两种或两种以上的细胞融合，形成一个具有新性状的细胞，这种技术称为细胞融合技术。
新生大鼠背根神经节神经元的分离、培养及鉴定
新生大鼠背根神经节神经元的分离、培养及鉴定摘要】目的：建立一种简单、稳定、高效的新生大鼠背根神经节神经元原代培养方法。
方法：摘取新生24h SD大鼠背根神经节，采用0.25%胰酶和0.1%Ⅳ型胶原酶消化，制成单细胞悬液，接种于Neurobasal/B27无血清培养液中。
将培养3d 的DRGn于倒置相差显微镜下进行形态学观察，扫描电镜行细胞形态学检测，应用β-tubulinⅢ进行免疫细胞化学染色，鉴定细胞纯度。
结果：体外培养的背根神经节神经元生长状态良好，纯度可达到(92±6)%。
结论：本实验方法简单、稳定、高效，可以获得高纯度的背根神经节神经元。
【关键词】背根神经节；动物实验；细胞培养；纯化【中图分类号】R74 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）21-0034-03The dissection, purification and culture of dorsal root ganglion neurons from new born ratsZhang Yuyao1, Liang Chen1, HU Xueyu(corresponding author)21 Fourth Military Medical Un iversity, Xi’an, Shanxi, 710032, China2 Department of orthopaedics, Xijing hospital,Fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China【Abstract】Objective To establish an simple, efficient, reliable method for the purification culture system of dorsal root ganglion neurons derived from new born rats. Methods Dorsal root ganglions harvested from new born SD rats were digested with the mixture of trypsin and collegonease Ⅳ, then turned into single cell suspension and plated in neuralbasal media. The purified rate was evaluated according to cell count and β-tubulinⅢ immunocytochemistry stain. Results Cultured dorsal root ganglion cells could survive healthily. The purification rate of neurons was（92±6）%. Conclusion The method, which is used for culture and purification of DRGn, is a simple, efficient and reliable way. Using it could obtain highly purify neurons.【Key words】Dorsal root ganglion; Animal experimentation;CellCulture;Purification背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）主要由感觉神经元组成，参与脊髓反射与感觉功能的调节，DRG因其细胞种类、生物学特性单一，越来越受到人们的重视。
小鼠胚胎中脑神经干细胞分离、培养及分化
小鼠胚胎中脑神经干细胞分离、培养及分化刘兵;刘洪涛;戴冀斌;彭超华;黄娟【摘要】目的:探讨小鼠胚胎中脑分离神经干细胞的体外培养方法,以获取高纯度的神经干细胞,为神经干细胞的深入研究提供试验材料。
方法:无菌条件下分离孕12~13 d小鼠胚胎中脑曲,制成单细胞悬液,碱性成纤维生长因子(bFGF)和B27存在的培养基中培养扩增,通过免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞及子代细胞的分化方向,流式细胞术检测TH阳性神经元比例。
结果:培养的部分细胞体外分裂增殖,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并向神经细胞和胶质细胞分化并经流式细胞仪检测自然分化为多巴胺能神经元的比例为3.25%。
结论:小鼠胚脑中脑存在具有多分化潜能的神经干细胞,它们能在体外稳定培养、传代和分化。
【期刊名称】《长江大学学报：医学卷》【年(卷),期】2006(000)012【总页数】4页(P)【关键词】神经干细胞;培养;分化;中脑【作者】刘兵;刘洪涛;戴冀斌;彭超华;黄娟【作者单位】长江大学医学院;武汉大学医学院;武汉大学医学院;湖北荆州;湖北荆州;湖北武汉【正文语种】中文【中图分类】Q813神经干细胞(neural stem cells, NSCs)是一类广泛存在于胚胎及成体中枢神经系统的早期未分化细胞，被认为是神经系统的“发源地”[1]。
应用神经干细胞移植的方法修复神经系统脑的损伤与治疗人类神经退行性疾病中更显示出其优越性,其中最具有代表性的就是怕金森病，然而，这种方法在患者中广泛应用的障碍就是胚脑移植的问题。
本试验对小鼠胚胎中脑神经干细胞的分离和培养进行了尝试，为神经干细胞的进一步研究奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1) 实验动物孕12～13 d昆明小鼠(E12～13 d，SPF级)，由武汉大学医学院实验动物中心提供。
2) 试剂 DMEM/F12培养基，特优级胎牛血清(FBS),B27均购自GIBCO公司；碱性成纤维生长因子(bFGF)购自Peprotech公司；胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNase1)、左旋多聚赖氨酸(PLL)和DAPI购自SIGMA公司。
大鼠BMSCs的体外分离培养和鉴定
在使用的血清浓度问题上 ，国内外不 同的实验室所 用并
贴壁生长的特性 ，通 过换 液去 除不贴 壁的其 它杂 质细胞 后 ， 不一致 ，报道多在 ５％ 一２０％之间Ｌ 一 。虽然也有人对 比过
获得呈梭形 的贴 壁 干细胞 。之 后人 们采 用密度 梯度 离心 法 不同浓度血清对所培养 ＢＭＳＣｓ的影响 ，但 因实验条件 和所 使
ｍｉｌｌ。无菌条件下取 出双侧股骨 ，去除 附带组织 ，两端剪 断暴 露骨髓 腔。以 １ ｍｌ注射 器吸取低 糖 ＤＭＥＭ细胞培养 液反复 冲洗 ，至骨质发 白为止 ，将所 收集 的细胞悬 液用 ２０Ｏ目滤 网 过滤 ，制备成单 细胞悬 液。细胞计 数后 以 １．０×ｌＯ６／ｎａ接种 到含 加％胎 牛血清 的低糖 ＤＭＥＭ细胞培养液 的培养瓶 内。 １．３ 骨髓问充质干细胞的传代培养和扩增
一
ｌ８４０ 一
［１］劳业 兴 ，张冰若 ，苏薇薇 ．松针化学成分及药理学研究进 展［Ｊ］．中 药 材 ，２０Ｏ３。２６（９）６８１．
［２】张 霞 ，孙爱东 ．松 针提取 物的研 究进展 ［Ｊ】．中国食物 与营养 ， ２００９，９（９）：２３．
［３］ＷａｎｇＣ，Ｌｉ Ｊ，ＣｈｅｒｔＬ．Ａｍｅｔｉｏｔ＇ａｔｉｖｅｅｆｅｃｔ ｂｅ由既ｉｎｅ∞ ｅｎｄｏｄｌｄｉａｌ由ｓ－ ｆｌｌｎ￣ｏ［１ｉｎｄｉａｂ ｃ ｒａｔｓｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙｈｉｇｈｄｉｅｔ ａｎｄａｘｑ，ｔｏ￣ｔｏｄｎ［Ｊ］．ＥｕｒＪ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０Ｏ９，６２０（１—３）：１３１．
即增殖期 。
２．３ 向成 骨 细 胞 诱 导 结 果
诱导培养后 ，细胞变 为多角形 、不规则形 ，胞 浆 中含 有较
多颗粒 ，部分细胞聚集成集落 ，碱性磷酸酶染色呈 阳性 （图 ２）。