大鼠胰岛细胞原代培养

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成年大鼠胰岛细胞的体外培养

１．１实验动物１．２试剂
００— ３００ｍ之间的胰岛吸至另一个装有培养基的培养皿ＳＤ大鼠，雄性，体重２３０— ２５０ｇ，清洁级，由２中，同时计算胰岛数。中南大学实验动物学部提供。．３胰岛细胞纯度和活度的测定ＤＴＺ染色鉴定胰岛细胞ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基（Ｈｙｅｌｏｎｅ）；胎牛血清（杭州２的纯度，双硫腙（ｄｉｔｈｉｚｏｎｅ，ＤＴＺ）是一种金属检测试剂，可以与四季青公司）；ＩＶ型胶原酶（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；Ｈｅｐｅｓ、ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ胰岛素颗粒中所含的锌离子特异性鳌和，从而将胰岛细胞染１．０７７（Ｓｉｇｍａ）。而其它细胞不被染色。纯化后的胰岛细胞中分别超净工作台（北京）；倒置相差显微镜（重庆光学成猩红色，ＭＥＭ／Ｆ１２培养液，每１ｍＬ培养液中加入ＤＴＺ贮仪器厂）；解剖显微镜（南京江南光学仪器厂）；ＣＯ细胞培养加入适量Ｄ存液ｌ０Ｌ，把细胞置于３７℃培养箱中１０ａｒｉｎ后，显微镜下箱（美国Ｒｅｖｅｏ）；低温台式离心机（Ｈｅｔｔｉｅｈ）等实验必备仪器。计数，计算纯度。台盼蓝染色鉴定胰岛细胞的存活率，取纯
岛移植广泛应用的重要原因之一。如何获得大量的胰岛胞，底部沉淀主要为腺泡细胞和导管细胞。吸取２层之间的成为研究的热点。本实验旨在应用１种改良的方法分离细胞，用Ｈａｎｋｓ液洗２遍，ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｈｙｅｌｏｎｅ）重悬细胞，以出高数量和高质量的胰岛，为胰岛移植的开展奠定必要的技上过程均在冰上操作。通过ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度梯度离心后的胰

原代大鼠胰岛的分离纯化及功能鉴定

原代大鼠胰岛的分离纯化及功能鉴定1)李小东,郭庆,高璟英,张婉,武冬梅,刘云峰,章毅摘要:目的探讨成年大鼠胰岛分离㊁纯化的方法,为成人胰岛的分离纯化奠定基础㊂方法通过用胶原酶P 消化胰腺及利用H i s t o p a q u e 1077分离液离心分离纯化雄性S D 大鼠胰岛,用双硫棕(D T Z )染色,吖啶橙碘化丙啶(A O /P I )染色和胰岛素分泌实验来鉴定胰岛的纯度㊁活性和功能;利用激光共聚焦技术检测胰岛细胞中钙离子浓度㊂结果分离获得的胰岛可被D T Z 和A O /P I 分别染成猩红色和绿色;体外刺激胰岛素分泌实验,2.8mM ㊁8.3mM ㊁16.7mM 葡萄糖情况下胰岛素分泌量分别是:(11.7ʃ1.4)u I U /m L ㊁(38.2ʃ8.7)u I U /m L ㊁(86.3ʃ5.1)u I U /m L ;在2.8mM 葡萄糖基础上,8.3mM 葡萄糖明显增加胰岛细胞中钙离子浓度,16.7mM 葡萄糖在8.3mM 葡萄糖基础上又进一步升高钙离子浓度㊂结论采用胶原酶P 消化法及H i s t o p a q u e 1077分离液离心分得的胰岛纯度高,活性㊁功能良好,随着葡萄糖浓度的增加,胰岛细胞中钙离子浓度明显增加㊂关键词:胰岛;分离;钙离子;原代大鼠中图分类号:R 329.2R 256.2 文献标识码:A d o i :10.3969/j.i s s n .16721349.2014.03.051 文章编号:16721349(2014)03034502 老年人是糖尿病高发人群,在全部心脑血管病死亡的病例中,除直接与糖尿病有关外,其余13%的病例与高血糖有关,高血压合并糖尿病成为脑卒中死亡的重要原因[1]㊂近年来有关糖尿病治疗研究引起了人们的关注,其中有很多胰岛移植的研究㊂随着分子生物学技术的发展,虽然各个方面取得了很大进步,但其移植效果并不理想,在人体的胰岛移植中,活性能保持一年以上不超过40%[2]㊂其主要原因是胰岛分离纯化后活性不高,移植后的排斥反应以及免疫抑制剂对大鼠胰岛的毒性作用[3]㊂因此获得足量㊁活性良好的胰岛非常重要㊂本实验采用胶原酶P 消化胰腺及H i s t o p a q u e 1077分离液直接离心分得大鼠胰岛,并对其活性及功能进行评价㊂1 材料与方法1.1 动物雄性S D 大鼠,体重250g ~300g,由山西医科大学实验动物中心提供㊂1.2 试剂胶原酶P 购自瑞士罗氏公司;双硫棕(D T Z )㊁H E P E S ㊁葡萄糖㊁多聚赖氨酸(分子量15~30万)购自美国S i g -m a 公司;1640培养基㊁胎牛血清购自美国H y c l o n e 公司;D i s -pa s e Ⅱ购自美国A m r e s c o 公司;青链霉素(双抗)购自北京索莱宝公司;A O P I 购自南京建成生物科技有限公司;大鼠胰岛素放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所㊂1.3 主要仪器超净工作台(北京世安科技林净化技术有限公司);C O 2细胞培养箱(北京博奥恒信生物科技有限公司);台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);奥林巴斯激光共聚焦显微镜I X 81(日本奥林巴斯I X 51)㊂1.4 方法1.4.1 原代大鼠胰岛及胰岛细胞分离培养无菌条件下,大鼠断头处死,迅速打开胸腹,在胆总管汇入十二指肠的入口处用止血钳夹住,经胆总管缓慢注入13m L4ħ的1m g/m L 胶原酶P 溶液,38ħ水浴消化11m i n ,取出立即加入20m L4ħ培养液(含10%胎牛血清)终止消化,剧烈振摇胰腺至细沙状,用孔径350μm 的滤网过滤,1200r /m i n ,离心2m i n ,去上清,加入10m L 分离液H i s t o p a q u e1077至管中重悬组织,将10m L1640培养基慢慢顺管壁注入管中,3200r /m i n ,离心23m i n㊂收集界面间的悬浮胰岛,在含10%胎牛血清,100U /m L 青霉素,100μg /m L 链霉素的1640培养基中培养,并置于37ħ,5%C O 2,100%湿度的孵箱中培养[4]㊂将胰岛用含3mm o l /LE D T A 的无钙镁P B S 溶液脱钙后,加入D i s p a s e Ⅱ(5m g /m L )酶液,培养箱孵育6m i n ,用4ħ培养液终止消化,吹打使胰岛分散,1000r /m i n ,离心2m i n,将胰岛细胞接种在培养皿中,按胰岛培养条件培养[4]㊂1.4.2 大鼠胰岛的D T Z 纯度鉴定 D T Z10m g 溶于10m L D M S O ,用H a n k s 液(p H 7.8)1ʒ1000稀释,0.22μm 孔径滤膜过滤,与胰岛制备物混合,室温10m i n 后镜检[5];大鼠胰岛的A O /P I 活性鉴定:用H a n k s 液配制储存液,A O :670μm o l /L ,P I :750μm o l /L ,4ħ避光保存,使用前取0.01m L A O 与1m L P I 混合,用H a n k s 液10倍稀释,0.22μm 孔径滤膜过滤,与胰岛混合10m i n ,在荧光显微镜下采用490n m 激发光,510n m 发射光镜检[6]㊂1.4.3 胰岛素分泌实验配置葡萄糖浓度分别是2.8mM ,8.3mM ,16.7mM 的K R B H 孵育液㊂方法:①取6个E p p e n d o r f 管标号,各加1m L2.8mM 葡萄糖的K R B H 液,每管挑入5个胰岛,37ħ孵育30m i n 后,弃上清㊂②每管再加入1m L2.8mM 葡萄糖的K R B H 液孵育,37ħ孵育30m i n ,收集上清,标号,-20ħ保存待测㊂③依次给予8.3mM 葡萄糖㊁16.7mM 葡萄糖孵育,方法同上,收集上清,-20ħ保存待测㊂用放射免疫法检测上述待测样品㊂1.4.4 激光共聚焦检测细胞内部钙离子浓度胰岛用F l u o 4AM (4μM )染料在37ħ的条件下孵育半小时,孵育完用含2.8mM 糖的H a n k s 液轻轻冲洗两遍,防止染液残留影响之后的细胞内钙离子浓度的测定,再加入2m L 含2.8mM 糖H a n k s 液㊂使用奥林巴斯激光共聚焦显微镜I X 81观察,设置激光波长494n m ,发射波长516n m ㊂所得到的比值F /F 0(细胞荧光减去背景荧光和自身荧光)反应细胞内钙离子浓度的变化[4]㊂1.5 统计学处理计量资料以均数ʃ标准差(x ʃs)表示,统计分析用S i g m a p l o t 12.0统计软件,采用两组t 检验或配对t 检验进行分析,P <0.05有统计学意义;激光共聚焦的数据用F V 101)为国家自然科学基金(N o .N S F C81070662,81273564),山西省自然科学基金(N o .20120110398),山西省高等学校优秀青年学术带头人支持计划(N o .201124),山西省留学人员科技活动项目择优资助(N o .2011762),山西省回国留学人员科研资助项目(N o .2012046),山西省卫生厅科研课题(N o .201201062)㊂㊃543㊃中西医结合心脑血管病杂志2014年3月第12卷第3期A S W3.0软件(日本奥林巴斯公司)进行分析㊂2结果2.1原代大鼠胰岛一般只离体培养7d,在体视显微镜下观察,胰岛质地饱满,呈椭圆形或圆形,透光率较小,直径在100~ 300μm;胰岛细胞在倒置显微镜下观察呈球形,部分细胞之间相连成细胞团㊂胰岛中包含α,β,δ和p p细胞,但是在体积上有明显差别,β细胞是α细胞的2~3倍,δ细胞比α细胞更小,β细胞直径11~13.5μm㊂2.2 D T Z和A O/P I对胰岛纯度及活性鉴定分别在40倍, 100倍的显微镜下观察,可见全部胰岛被D T Z染成猩红色;在490n m激发光,510n m发射光的荧光显微镜下观察,培养过夜的胰岛97%以上可被A O/P I染成绿色㊂2.3 胰岛素分泌实验胰岛分别在葡萄糖浓度为2.8mM (2.8G),8.3mM(8.3G),16.7mM(16.7G)的K R B H溶液中孵育半小时后,所测胰岛素值分别为:(11.7ʃ1.4)u I U/m L, (38.2ʃ8.7)u I U/m L,(86.3ʃ5.1)u I U/m L,胰岛素分泌量随葡萄糖浓度增加而增加㊂2.4激光共聚焦技术检测胰岛细胞中钙离子浓度实验中,在2.8mM葡萄糖(n=10)的基础上,8.3mM葡萄糖(n=10)可以明显升高胰岛细胞内的钙离子浓度;16.7mM葡萄糖(n=10)在8.3mM的葡萄糖的基础上进一步的升高了胰岛细胞中的钙离子浓度㊂2.8G v s8.3G(P<0.05);2.8G v s16.7G(P< 0.001);8.3Gv s16.7G(P<0.01)㊂3讨论胰岛细胞移植为治疗胰岛素依赖性糖尿病开辟了一条新的途径[7]㊂胰岛移植不仅可纠正糖代谢紊乱,还能避免因血管病变引起的眼㊁肾㊁脑和心血管并发症,但胰岛的分离纯化是一个较复杂的过程,所获胰岛的产量和质量受很多因素影响,稍有偏差即会直接影响治疗效果,因此备受关注[8]㊂如何获得高纯度及高活性的胰岛仍是亟待解决的问题㊂目前成年大鼠胰岛分离纯化多采用机械研磨与F i c o l l密度梯度离心法[9],而本实验采用单一的H i s t o p a q u e1077是即用型的,减少了F i c o l l不同密度分离剂的配制及除菌的步骤㊂由于纯化时只有H i s t o p a q u e1077和1640培养基两个密度,纯化梯度易于形成,使得胰岛的纯化变得简便,缩短了分离大鼠胰岛的时间㊂此法减少了多步分离过程中不确定的因素对胰岛质量的影响,尽可能快的给予离体胰岛营养,利于获得纯度高,活性良好的胰岛㊂H i s t o p a q u e1077较F i c o l l等能提供一个更好的渗透环境,能更好地保持胰岛的活性与功能㊂实验证实,胶原酶P消化胰腺及利用H i s t o p a q u e1077分离得到的大鼠胰岛纯度高㊁活性㊁功能良好㊂同时我们总结了大鼠胰岛分离纯化过程中一些体会:①胰腺灌注的成功与否是分离纯化胰岛的关键,文献报道多采用4.5号头皮针穿刺灌注,为防止针尖过于锐利,刺破胆管壁致胶原酶外溢,我们采用与此针头同样粗细的细塑料管(尖端较钝)进行灌注㊂②灌注时用线结扎位置要在最低一支胆管与主干的汇合支以下,以防止部分酶液倒流至肝内㊂③应采用4ħ的胶原酶灌注,因温度高时胶原酶过早消化胰管和腺泡,灌注好的胰腺应置于0ħ的冰袋上剔除非胰腺组织,这些非胰腺组织无法消化且会黏附正常胰腺组织,不利于过滤㊂④胰腺消化分散后,应立即加入20m L4ħ培养液,混匀终止消化㊂如果培养液用量太少,则不能终止胶原酶的作用,造成过度消化,破坏胰岛完整性,影响分离效果[10]㊂D T Z是一种螯合锌㊁铜㊁铅等的指示剂,因为大鼠的胰岛β细胞含锌,D T Z染液可将胰岛染成猩红色,所以D T Z对胰岛是特异性染色[5];A O为浸润性染料(膜通透性),可侵入活细胞与双链D N A结合发出绿色荧光;P I为排斥性染料(膜不通透性),不能进入活细胞,与死亡(膜通透性改变)细胞的核酸结合,发出红色荧光[6]㊂实验中,所有胰岛可被染成猩红色,表明用此种实验方法分得的胰岛纯度较高;A O/P I可将97%以上胰岛染成绿色,表明胰岛活性良好㊂葡萄糖依赖性的胰岛素分泌实验证实了胰岛功能良好㊂胰岛细胞中钙离子浓度会升高会促进胰岛素分泌㊂我们对胰岛细胞中钙离子浓度进行检测后发现,利用高浓度葡萄糖刺激胰岛时,可明显升高胰岛中钙离子浓度㊂利用胶原酶P消化胰腺及利用H i s t o p a q u e1077分离液离心纯化胰岛是一种较简单可靠的方法㊂参考文献:[1] Z h a oY Q,L i a nY Y,L i G F,e t a l.I n f l u e n t i a l f a c t o r s f o r s h o r t t e r mp r o g n o s i s o f p a t i e n t sw i t ha c u t ec e r e b r a l i n f a r c t i o n:Al o g i s t i cr e-g r e s s i o na n a l y s i s[J].M e d i c a l,2011,36(3):265268.[2] B r e t z e lR G,H e r i n g B J,S c h u l t zA O,e t a l.I n t e r n a t i o n a l i s l e t t r a n s-p l a n t r e g i s t r y r e p o r t[M].19961997.S p r i n g e r,1996,15360.[3]杨永生,孙宝震,解英俊,等.大鼠胰岛分离纯化方法的改进[J].中国实验诊断学,2006,10(12):14861488.[4] Z h a n g Y,L i uY,Q uJ,e t a l.F u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o no fh y p e r-p o l a r i z a t i o n a c t i v a t e dc y c l i cn u c l e o t i d e g a t e dc h a n n e l si nr a t p a n c r e a t i cβc e l l s[J].,2009,203(1):4553.[5] L a t i f Z,N o e l J,A l e j a n d r oR.As i m p l em e t h o d o f s t a i n i n g f r e s h a n dc u l t u r ed i s le t s[J].T r a n s p l a n t a t i o n,1988,45(4):827.[6] L e eD Y,Y a n g K,L e eS,e t a l.O p t i m i z a t i o no fm o n o m e t h o x y‐p o l y e t h y l e n e g l y c o l g r a f t i n g o nt h e p a n c r e a t i c i s l e tc a p s u l e s[J].2002,62(3):372377.[7]张鑫,高居忠,王学明,等.成年大鼠胰岛分离纯化的实验研究[J].首都医科大学学报,2003,24(3):314316.[8]O n e i lJ J,S t e g e m a n nJ P,N i c h o l s o n D T,e ta l.T h ei s o l a t i o na n df u n c t i o no f p o r c i n e i s l e t s f r o m m a r k e tw e igh t pi g s[J].C e l l T r a n s-p l a n t a t i o n,2001,10(3):235246.[9] B r a n d h o r s tD,B r a n d h o r s tH,H e r i n g B J,e t a l.I s l e t i s o l a t i o n f r o mt h e p a n c r e a s o f l a r g em a mm a l s a n dh u m a n s:10y e a r s o f e x p e r i e n c e [J].E x p e r i m e n t a l C l i n i c a l E n d o c r i n o l o g y&D i a b e t e s,2009,103(S02):314.[10]李永翔,李戈,董维平,等.大鼠胰岛分离纯化技术的改进[J].复旦学报:医学版,2006,33(2):2668.作者简介:李小东,现为山西医科大学2010级研究生(邮编:030001);郭庆㊁高璟英㊁张婉㊁武冬梅㊁章毅(通讯作者),工作于山西医科大学基础医学院药理教研室(邮编:030001);刘云峰,工作于山西医科大学第一医院㊂(收稿日期:20130518)(本文编辑王雅洁)㊃643㊃C H I N E S EJ O U R N A L O FI N T E G R A T I V E M E D I C I N E O N C A R D I O/C E R E B R O V A S C U L A R D I S E A S E M a r c h2014 V o l.12 N o.3。

大鼠胰岛细胞原代培养方法的改良

（ｈｎａｇ１００）ＷｕＺｉｉｎＷａｇＹｕｉＬｕＧｕｌｎＳｅｙｎ０１１ｈｘａｇｎｘａｉｏｉｇａ
ＡＢＴＳＲＡＣＴＯｂｅｔｅＴｔｄｈｆｃｓｏｏａｉｇａｄｃｌｒｇｔｅｒｔａｃｅｔｌｔｉｊｃｉ：ｏｓｕｙｔｅｅｆｔｆｓｌｔｎｕｔｉｈａｐｎｒａｉｉｅｓｎｖｅｉｎｕｎｃｓ
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原代大鼠胰岛的分离纯化及功能鉴定-精选文档

原代大鼠胰岛的分离纯化及功能鉴定老年人是糖尿病高发人群，在全部心脑血管病死亡的病例中，除直接与糖尿病有关外，其余13%的病例与高血糖有关，高血压合并糖尿病成为脑卒中死亡的重要原因[1]。

近年来有关糖尿病治疗研究引起了人们的关注，其中有很多胰岛移植的研究。

随着分子生物学技术的发展，虽然各个方面取得了很大进步，但其移植效果并不理想，在人体的胰岛移植中，活性能保持一年以上不超过40%[2]。

其主要原因是胰岛分离纯化后活性不高，移植后的排斥反应以及免疫抑制剂对大鼠胰岛的毒性作用[3]。

因此获得足量、活性良好的胰岛非常重要。

本实验采用胶原酶P消化胰腺及Histopaque 1077分离液直接离心分得大鼠胰岛，并对其活性及功能进行评价。

1材料与方法1.1动物雄性SD大鼠，体重250 g～300 g，由山西医科大学实验动物中心提供。

1.2试剂胶原酶P购自瑞士罗氏公司；双硫棕（DTZ）、HEPES、葡萄糖、多聚赖氨酸（分子量15～30万）购自美国Sigma公司；1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；DispaseⅡ购自美国Amresco公司；青链霉素（双抗）购自北京索莱宝公司；AOPI 购自南京建成生物科技XX公司；大鼠胰岛素放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所。

1.3主要仪器超净工作台（北京世安科技林净化技术XX公司）；CO2细胞培养箱（北京博奥恒信生物科技XX公司）；台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器XX公司）；奥林巴斯激光共聚焦显微镜IX81（日本奥林巴斯IX51）。

1.4方法1.4.1原代大鼠胰岛及胰岛细胞分离培养无菌条件下，大鼠断头处死，迅速打开胸腹，在胆总管汇入十二指肠的入口处用止血钳夹住，经胆总管缓慢注入13 mL 4 ℃的1 mg/mL胶原酶P溶液，38 ℃水浴消化11 min，取出立即加入20 mL 4℃培养液（含10%胎牛血清）终止消化，剧烈振摇胰腺至细沙状，用孔径350 μm的滤网过滤，1 200 r/min，离心2 min，去上清，加入10 mL分离液Histopaque 1077至管中重悬组织，将10 mL 1640培养基慢慢顺管壁注入管中，3 200 r/min，离心23 min。

原代细胞培养操作步骤

原代细胞培养操作步骤原理：将动物机体的所有组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置适宜的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程之为称原代细胞培养。

操作步骤（一）胰酶消化法1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，放入75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和**浸入体内）然后用碘酒**腹部，取胎鼠带入超净台内（或者将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。

2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。

4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。

上述消化分离的方法是基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。

细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。

（二）组织块直接培养法自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。

翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。

入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。

大鼠胰岛β细胞原代分离培养及近膜钙离子测定技术研究

ｃｎｃｌｍｉｒｓｏｅｗｉｎｅｃｔｔｏｏ４ｎｏｍｏｉｒｃａｇｓｏｕ — ｌｓ — ｍｂａｅｃｌｉｍｆＢｃｉｓｏｆａｃｏｃｐｔａｘｉｉｎｆ３０ｎｌｔｎｔｈｎｅｆｓｂｐａｍａｍｅｒｎａｃｕｏ — ｅｌ．ｏｈａｏ
Ｉ儿科杂志第２缶床９卷第８期２１０１年８月ＪＣｉｅｉｔＶ１９Ｎｏ８Ａｕ２１ｌＰｄａｒｏ．．ｇ．０１ｎ２
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７９・６
ｄｉ１．９９ｊｓｎ１０ — ６６２１．８０１ｏ：０３６／．ｓ．００３０．００．９ｉ１
ｃｌｒｏｄｄｗｉＦ一ＡＭ，ｆｏｅｃｎｍａｅｈｗｔａ３＋ｏａｅｅｒｐａｍａｌｍｍａｐｅｅｔｄｎｎｎｆｒｔｅｌｗｅｅｌａｅｔＦＰ１－ｓｈ８ｌｒｓｅｔｕｉｇｓｓｏｈｔＣ２ｌｃｔｄｎａ－ｌｓｅｒｓｎｅｏｕｉｍｉｏｙ
Ｉｏｔｎ，ｐｉｒｕｔｒｆｒｔａｃｅｔ￣ｃｌｎｅｅｍｉａｉｎｏｕ－ｌｓ－ｍｂａｅｃｌｕｓｌｉａｏｒｍａｙｃｌｅｏａｎｒａｉ－ｅｌａｄｄｔｒｎｔｆｓｂｐａｍａｍｅｒｎａｃｍｕｐｃ［ｓｏｉＺＡＮｉ（ｅａｔｅｔｆＰｄａｉ，ＴｅＨＧＬＤｐｒｎｏｅｉｒｓｈｍｔｃ
度较好。激光共聚焦测定ＦＰｌ／Ｍ负载胰岛Ｂ细胞，近膜钙离子呈蓝色荧光，不均匀分布于近细胞膜附近。Ｆ —８Ａ

大鼠胰岛β细胞分离与培养的初步研究的开题报告

大鼠胰岛β细胞分离与培养的初步研究的开题报告
题目：大鼠胰岛β细胞分离与培养的初步研究
一、研究背景
胰岛β细胞是胰岛内分泌细胞中最重要的细胞，其主要功能为分泌胰岛素调节血糖。

因此，研究胰岛β细胞的分离和培养对于理解胰岛功能异常的疾病如糖尿病的发生、病理机制的探究以及药物筛选等方面具有重
要意义。

二、研究问题和方法
1. 研究问题
（1）如何从大鼠胰腺中分离出高纯度的β细胞？
（2）培养条件对β细胞的生长和分泌功能的影响是什么？
（3）是否可以通过其分泌的胰岛素的水平来评估β细胞的功能状态？
2. 研究方法
（1）采用胰酶消化、密度梯度离心等方法分离大鼠胰腺中的β细胞。

（2）设计多组不同的培养条件，通过比较细胞形态、分泌功能等指标来寻找最佳培养条件。

（3）采用ELISA法测定胰岛素水平来评估β细胞的功能状态。

三、研究意义和预期结果
本研究旨在建立大鼠胰岛β细胞的分离和培养方法，并探究培养条件对于β细胞的生长和分泌功能的影响。

通过该研究，可为后续糖尿病的研究提供重要的实验基础和资料。

预期结果为成功建立高效、可行的胰岛β细胞分离和培养方法，并获得最佳培养条件，得到稳定、高纯度、高活
性的β细胞，以及有对β细胞功能状态评估的特异性标准。

动物细胞原代培养过程

动物细胞原代培养一、剪取组织颈椎脱臼法处死小鼠，放在100ml的烧杯中用70％乙醇消毒3min。

用剪刀剪开腹部，取出肾、肝、脾（任意一种脏器）。

1、将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰ 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。

2、将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔二、清洗在盛有PBS 液平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后脏器放入另一盛有PBS 平皿中。

三、剪切将肾、肝、脾剪成1mm3 （剪成肉末状）大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。

四、消化1、在50ml离心筒中加入0. 25％胰蛋白酶溶液25ml，在温暖的环境中或置于37 °水浴摇床中轻轻摇动15min，转速约为180r/min。

2、让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶。

（小牛血清在共用无菌操作台上取用）3、在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复步骤1和2。

五、制备单细胞悬液1、将混合的细胞悬液离心，1200rpm，5min，弃上清。

2、将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬，再1000-1200rpm，5min离心。

3、用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止,然后再按照（1）进行离心，离心后弃去上清液，将沉淀用少量细胞培养液反复吹打。

制的细胞悬液。

六、接种1、将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。

2、用滤器过滤RPMI1640再悬沉淀，并使终体积为20ml。

（RPMI-1640RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维.帕克纪念研究所。

RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。

其中含有10%胎牛血清。

）七、培养1、在培养瓶外做好标记（标明所培养细胞的名称和时间），2、置于CO2的孵箱中培养，3、72h后即可观察。

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大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,无菌取出胰腺,置于4℃Ｈａｎｋｓ液中,用眼科小剪刀将胰腺剪成1ｍｍ3大小的组织块,加入0.5ｇ·Ｌ-1胶原酶,37℃恒温水浴振荡消化15ｍｉｎ,将已消化至细颗粒状组织吸出,并用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化,余下未消化完全的组织加入少量37℃Ｈａｎｋｓ液,用粗口径吸管轻轻吹打,直至大部分组织被消化成细颗粒状,用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化。

混合前后两部分的消化产物,用Ｈａｎｋｓ液低速离心洗涤3次后,将组织置于含100Ｕ·ｍｌ-1青霉素,100ｍｇ·Ｌ-1链霉素,11.1ｍｍｏｌ·Ｌ-1葡萄糖,10ｍｍｏｌ·Ｌ-1Ｈｅｐｅｓ和7%的胎牛血清的完全ＲＰＭＩ1640培养液中,用150目(108μｍ)尼龙筛网过滤,以除去未被消化的组织和结缔组织。

将已分离好的胰岛细胞和细胞团,置于含上述培养液内的培养瓶内培养。

24ｈ后,吸出未贴壁的细胞悬液,低速离心以收集细胞,显微镜下计数后,以每孔一定数量胰岛细胞团接种于24孔细胞培养板内,继续培养48ｈ后用于实验。

我分离胰岛细胞后,用DTZ染色,发现溶液中含有许多小颗粒,放入温箱中也未发生变化,镜下观察没有看到文献中所说的红染细胞。

我是将100mg双硫腙粉末溶于10mlDMSO中，用滤纸过滤，用时用KRBB缓冲液稀释100倍。

胰岛细胞分离是将成年大鼠胰腺用胶原Ⅴ酶消化后，过150目网取滤过液，再过400目网取网上细胞，加入L-DMEM培养。

方法是我根据文献稍作改动后实施的。

胰岛细胞分离和染色对于我都是第一次做，请高手指点一下。

溶液中如果有紫黑色小颗粒，那就是DTZ，过滤除的不净。

没有红染的细胞就是没有胰岛啊。

还有，我总觉得150目太密了，很多胰岛都滤不过去吧
大鼠胰岛细胞原代培养
一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。

此时组织块边缘模糊，再将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks 悬浮，离心，重复1~2次，再用培养基洗2~3次，用培养基悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。

由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15小时后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。

将新培养板中细胞培养48小时后，换新鲜配置的含有2.5ng/mL 的碘乙酸的培养基培养5小时，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2次，并换不含碘乙酸的培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层胰岛细胞，
胰岛细胞移植的研究进展
人类至今已有100多年用移植方法治疗糖尿病的历史，胰岛细胞移植治疗糖尿病存在两个障碍：组织来源不足和免疫排斥反应。

一．胰岛细胞的来源
1．同种的成人及胎儿胰岛成人胰岛一般取自新死亡的健康尸体，抗缺氧的能力较弱，且慢存在外分泌活性组织，死亡之后即迅速自溶，故应用较为困难。

而胎儿胰岛对低温缺氧的耐受能力较强、免疫原性弱、胰岛组织丰富、含有干细胞、移植后可保持正常的生长增殖能力，因此成为较为理想的供体组织。

2．异种胰岛猪的组织来源广泛，血糖调定点与人相似，猪胰岛素与人胰岛素排列极为接近，且能在新鲜的人血清组织中存活增生，猪胰岛成为最有可能的异种供体。

3．胰腺导管细胞胰腺导管细胞具有极强的扩增和分化能力，可在适宜的外部刺激下通过快速增殖丧失其导管细胞表现型，从而还原成多潜能细胞并进一步分化成为胰岛细胞。

4．干细胞根据来源分为胚胎干细胞和成体干细胞。

5．基因技术产生的具有胰岛素代谢特征的新型细胞运用基因从组技术和转基因技术，将胰岛素基因直接或间接转入靶细胞，从而构建具有胰岛素代谢特征的新型细胞用于胰岛细胞移植。

二．胰岛细胞体外增殖及其影响因素
对人胎胰岛细胞培养条件的研究显示：RPMI1640培养基，11.1mmol/l葡萄糖,增加6倍氨基酸,PH7.2,以人/胎血清代替小牛血清,与某些细胞共同培养,这些因素均有利于人胎胰岛组织的生长和B细胞功能的维护。

三．胰岛细胞移植技术
1．胰岛细胞的分离和纯化分为机械分离消化法和胶原酶消化法。

2．胰岛细胞的保存组织培养是胰岛细胞保存的有效方法。

胰岛在组织培养中至少可保存7 天，数周后仍能合成胰岛素，对葡萄糖刺激产生胰岛素分泌反应。

3．胰岛细胞移植的部位理想的移植部位应安全、血供丰富、植入细胞易于存活并发挥功能，可逃避免疫反应。

按移植部位将胰岛细胞移植分为原位移植和异位移植。

原位移植是基于胰岛素经门静脉进入肝脏这一生理基础来确定的，包括门静脉内、肝内、脾内、大网膜及腹腔内等部位的的移植。

异位移植则指皮下，肌肉内、睾丸内、胸腔内、肾包膜下及脑内等部位的移植。

目前多采用肝内门静脉注入的方法进行胰岛细胞移植。

4．胰岛的移植量一般认为胰岛的移植量至少要达到10—20%，才能维持正常血糖和糖基化血红蛋白水平。

5．胰岛细胞移植的适应征
①.胰岛素依赖型糖尿病(IDDM,I型)和严重的非胰岛素依赖型糖尿病：为防止慢性并发症的产生，有人提倡早期胰岛细胞移植
②上腹部脏器晚期恶性肿瘤如晚期胰腺癌\肝癌.
③.慢性胰腺炎为解决疼痛全或次切除胰腺需行自体胰岛移植。

6．胰岛细胞移植的原则
①从获得供体胰腺到胰岛细胞分离与纯化的冷缺血时间需控制在8小时以内，而胎儿离开母体4小时内应立即取出胎胰进行消化分离
②胰岛分离纯化后应立即移植
③门静脉内移植相对较佳，包括经肠系膜上静脉插管入门静脉、内窥镜门静脉直接注入
④遗址量应大于8000—11000IEQ/Kg
⑤早期免疫抑制剂首选T淋巴细胞抗体
⑥可多次，足量进行移植
四．免疫排斥反应的预防
1．减轻胰岛免疫原性制备高纯度的胰岛能够去处抗原提呈细胞，有效地降低免疫原性。

2．免疫隔离胰岛移植物免疫隔离技术利用人工装置将移植的胰岛和受体的免疫系统隔离开来，能组止受体的淋巴细胞和抗体对胰岛组织的攻击，而不影响胰岛素和营养物质的自由出入。

3．抑制受体的免疫反应通过调节移植受体的免疫系统，从而达到胰岛细胞免疫耐受
五．胰岛细胞移植展望
随着胰岛细胞来源的扩大和免疫排斥反应的控制，胰岛细胞移植必将成为广大糖尿病患者理想的治疗方法。