色谱峰,色谱柱及参数(精制知识)
色谱图和峰参数
色谱图和峰参数色谱图和峰参数Ø色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。
Ø基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
Ø噪音(noise)——基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
Ø漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
Ø色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。
不对称色谱峰有两种:前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。
前者少见。
Ø拖尾因子(tailing factor，T)——T,，用以衡量色谱峰的对称性。
也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。
《中国药典》规定T应为0.95~1.05。
T,0.95为前延峰，T,1.05为拖尾峰。
Ø峰底——基线上峰的起点至终点的距离。
Ø峰高(peak height，h)——峰的最高点至峰底的距离。
Ø峰宽(peak width，W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。
W,4σØ半峰宽(peak width at half-height，W)——峰高一半处的峰宽。
Wh/2h/2,2.355σØ标准偏差(standard deviation，σ)——正态分布曲线x,?1时(拐点)的峰宽之半。
正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。
色谱柱基础知识的总结
色谱柱基础知识简介一、色谱柱工作原理当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。
由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出二、色谱柱的分类2.1 色谱柱主要分为填充柱和毛细管柱注：此外，还有一些综合了填充柱和毛细管柱特点的特殊色谱柱，例如Alltech 公司采用专利技术生产的集束管毛细管柱。
2.2 填充柱与毛细管柱的比较表1 填充柱与毛细管柱的比较色谱柱内径/mm 长度/m柱材料柱容量载气流速填充柱2-50.5-3玻璃或金属材质mg20-30mL/min毛细管柱0.10-0.810-100熔融石英或不锈钢、聚酰亚胺涂层ng1-10mL/min注：毛细管柱外层为聚酰亚胺，可修补柱子缺陷（即增强柔韧性）并且增加强度。
三、填充柱3.1 填充柱的构成3.1.1 填充柱的柱管填充柱可以使用任何类型的柱管，只要它对样品是清洁,、惰性的, 以及能够承受GC 的柱箱温度，像：不锈钢管、玻璃管、铜管、聚四氟乙烯管、聚合物管等。
3.1.2固体载体（颗粒）和固定相近距离观察一个填充颗粒,会发现它是由一个固体载体（颗粒）和在它上面均匀涂渍的涂敷物（叫做固定相）所组成。
固体载体即液态固定相附着的载体，其细小、均匀、多孔，增加与样品接触的表面积。
常用的固体载体为硅土。
固体载体也有不同大小的颗粒度，颗粒度是指“目数大小”。
一般是根据柱径来选择固体载体的粒度，保持载体的直径为柱内径的1/20 为宜。
常用60-80目及80-100目。
表 2 直径大小与目号的关系四、毛细管柱4.1 毛细管柱的构成毛细管色谱柱由两个主要部分组成：管身和固定相。
4.1.1 管身毛细管柱的管身一般使用熔融二氧化硅或不锈钢作为基本材质。
熔融二氧化硅即高纯度合成石英（以下通称熔融石英），通常在其表面涂上一层聚酰亚胺做为保护层。
有关色谱保留的基本术语及参数
固定相的粒径
固定相的粒径大小影响色谱分离的效 率和分离度，粒径越小，分离效率越 高，但同时也会增加柱压和减少柱寿 命。
流动相的性质
流动相的选择
流动相的选择对色谱分离效果也 有重要影响，需要根据不同物质 的性质选择合适的流动相。
流动相的极性
流动相的极性影响物质的溶解度 和在固定相上的吸附力，极性强 的流动相有利于极性物质的分离 。
优化分离时间的方法
可以通过提高流速、减少进样量、选择合适 的色谱柱和检测器等方法来缩短分离时间。
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峰宽
峰宽（Peak Width）
色谱峰的高度与基线之间的距离，用于衡量色谱峰的宽度。
峰宽计算公式
$W = frac{H}{2sqrt{2ln 2}}$，其中$H$为色谱峰的高度。
塔板数
塔板数（Number of Plate）：用于衡量色谱柱对物质的分 离能力。
塔板数计算公式：$N = frac{16pi^2mu L}{E^2Delta t}$， 其中$mu$为流动相流速，$L$为色谱柱长度，$E$为扩散系 数，$Delta t$为保留时间差。
03
在实际应用中，可以通过实验条件优化，如调整温度、流速等
，来提高分离效果和分离速度。
03
色谱参数
分离度
分离度（Resolution，R）
相邻两色谱峰之间距离与峰底宽度的比值，用于衡量色谱峰的分离程度。
分离度计算公式
$R = frac{2(t_{2} - t_{1})}{W_{1} + W_{2}}$，其中$t_{2}$和$t_{1}$分别为相邻 两峰中后峰和前峰的保留时间，$W_{1}$和$W_{2}$分别为相邻两峰的峰底宽度 。
后延峰
液相色谱的结构原理和基本知识 液相色谱操作规程
液相色谱的结构原理和基本知识液相色谱操作规程液相色谱(HPLC)法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的固定相的柱色谱分离技术。
液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。
在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用液相色谱来分析。
液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
液相色谱分析原理(1)、液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在佳条件下得以分离。
(2)、液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
色谱柱参数
色色谱谱柱柱的的参参数数
载碳量
硅胶表面键合相的比例 与比表面积，键合覆盖度等有关 对ODS，载碳量从7-18%（ODS-100Z为20%）不等 ODS的载碳量高， 则保留增加，适合分析非极性化合
物。制备色谱的上样量也可以增加 载碳量通常影响选择性
色色谱谱柱柱的的参参数数
硅胶表面性质-纯度
Super-ODS为2 μm 填料，UPLC为1.7 μm填料 3cm以下的制备色谱柱通常使用5-10 μm填料 更大内径的制备色谱柱通常使用更大的粒径，如10 μm, 或20 μm
色色谱谱柱柱的的参参数数
孔径
孔径小，含孔率高，则 比表面积大，载碳量高
化合物在孔内分离 孔径大小必须和分子大小相匹配，分子必须能进入孔内，一般小分
CH3
monomeric bonding
柱效高, 平衡快
OH
CH3
+ X Si (CH2)17CH3
OH
X
稳定性好， 制备上样量大
polymeric bonding
R Si (CH2)17CH3 R
O
CH3
Si
O
(CH2)17CH3
色色谱谱柱柱的的参参数数
ODS柱的特征结构
色色谱谱柱柱的的参参数数
强极性化合物使用AQ色谱柱(ODS-100V) 高比表面积和载碳量可以提高制备色谱的上样
量
TTSSKKGGEELL反反相相色色谱谱柱柱选选择择一一览览表表
硅胶填料：
TSK-GEL
固定相
ODS-100V
C18
ODS-100Z
C18
ODS-100S
C18
ODS-120T
C18
色谱柱名词解释
色谱柱是色谱分析中使用的一种关键设备，用于将混合物中的成分分离并进行定性和定量分析。
以下是一些与色谱柱相关的常见名词解释：
1. 固定相（Stationary Phase）：色谱柱中的固定涂层或填料，具有特定的化学性质和分离能力。
样品在固定相中发生相互作用，导致不同成分以不同速度移动并被分离。
2. 流动相（Mobile Phase）：用于携带样品通过色谱柱的流体，可以是气体（气相色谱）或液体（液相色谱）。
流动相的选择取决于分析目标和色谱柱类型。
3. 柱效（Plate Number）：用于描述色谱柱分离能力的度量。
柱效越高，表示色谱柱的分离效果越好。
4. 保留时间（Retention Time）：在色谱柱中，样品组分从进样到检测器出现的时间。
保留时间可以帮助确定化合物的特征和纯度。
5. 色谱峰（Chromatographic Peak）：色谱图中呈现出的高度峰值，表示在特定保留时间内检测到的样品成分。
6. 柱温（Column Temperature）：色谱柱的操作温度，可以对分离效果和分析速度产生影响。
某些分析方法需要在特定的温度下进行。
7. 柱寿命（Column Lifetime）：色谱柱使用期限，取决于使用条件和期间的保养和维护。
柱寿命的结束通常由分离性能下降或峰形变得不规则来决定。
色谱参数及色谱图方面的术语
（一）色谱参数1、死时间：不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大之所需的时间。
2、保留时间：组分从进样到出峰最大之所需的时间。
2.1调整保留时间：减去死时间保留时间。
2.2校正保留时间：用压力梯度校正因子修正的保留时间。
2.3净保留时间：用压力梯度校正因子修正的调整保留时间。
3、死体积：不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大之所需的载气体积。
4、保留体积：组分从进样到出先峰最大之所需的载气体积。
4.1调整保留体积：减去死体积的保留体积。
4.2校正保留体积：用压力梯度校正因子修正的保留体积。
4.3净保留体积：用压力梯度校正因子修正的调整保留体积。
5、比保留体积：每克固定液校正到273K时的净保留体积。
6、相对保留值：在相同操作条件下，组分与参比组分的调整保留值之比。
7、分配系数：在平衡状态下，组分在固定液与流动相中的浓度比。
8、容量因子在平衡状态时，组分在固定液与流动相中的质量之比。
9、柱效能：色谱柱在色谱分离过程中主要由动力学因素所决定的分离效能。
通常用理论板数，理论板高或有效板数表示。
9.1理论板数：表示柱效能的物理量。
9.2理论板高：单位理论板的长度。
9.3有效板数：减去死时间后表示柱效能的物理量。
10、分离度：两个相邻色谱峰的分离程度，以两个组分保留值之差与其平均峰宽值之比表示。
11、灵敏度：通过检测器的物理量变化时响应信号的变化率。
12、检测线：随单位体积的载气或在单位时间内进入检测器的组分所产生的信号等于基线噪声二倍时的量。
13、线性范围：检测信号与被测物质的量呈线性关系的范围。
14、载气流速：在色谱柱出口的温度和压力下测得并校正到柱温时的载气体积流速。
（二）色谱图及其他1、色谱图：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或载气流出体积的曲线图。
2、色谱峰：色谱柱流出组分通过检测系统时所产生的响应信号的微分曲线。
3、峰底：从峰的起点与终点之间连接的直线。
4、峰高：从峰最大值到峰底的距离。
如何选择正确的气相毛细管色谱柱型号及规格
气相毛细管柱是气相色谱柱中最常见，使用频率最多的色谱柱，常规的测试应用基本以此为主。
想要实验顺利选择合适的柱子非常重要。
一根合适的柱子才能保证我们能得到想要的色谱分离结果，错误的选择柱子可能会导致色谱峰间的分离度或者理论塔板数无法达到我们的测试要求。
选择合适的柱子第一要素是我们需要了解色谱柱的规格参数。
毛细管柱的规格参数是什么呢？那就是长度、内径和膜厚，以及固定相种类。
当拿到一根柱子，首先会看到一个CD-5，30m*0.25mm*0.25um类似这样的标识。
它表示：这些参数是固定的吗？当然不是，格式是固定的，但是里面的型号是可以改变的。
柱子长度关于毛细管柱，商品化柱子长度可以从5米至100米不等，我们可以根据自己的实验需求选择合适的长度规格，选择依据一般是组分越简单柱长越短，所以100米规格的色谱柱并不多，除一些专用柱除外。
最常见的色谱柱长度规格是30m。
长度会影响色谱柱的分析时间，快速分析时建议选择短柱子（5米、10米、15米）。
在内径和膜厚相同的情况下，一般长柱子可以提高分离度，当然分析时间也会相应增加。
例如60米柱子与30米柱子相比，分离时间可能是其两倍。
另外色谱柱越长也会增加柱流失、影响柱惰性。
内径规格关于毛细管柱，商品化柱子内径规格有0.1毫米、0.15毫米、0.18毫米、0.2毫米、0.25毫米、0.32毫米、0.45毫米、0.53毫米、0.8毫米。
色谱柱内径的大小对分离效果的影响非常明显，内径越小色谱柱的塔板数就越高，柱效越高。
但是载样量会减少。
使用细柱子需要关注载样量，过载就会导致柱效降低。
经过专家和学者以及实验人员长期的实验摸索，累计的经验是：痕量级杂质的分析多选用0.53毫米内径的色谱柱。
0.32毫米色谱柱可以相对兼顾到进样量和柱效。
实验室最常用的规格是0.25mm内径色谱柱。
一般GC/MS中使用的柱子大多是0.25mm内径。
此外，对于快速分析来说，0.1mm和0.2mm最有优势。
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常见问题和维护：
整个液相系统最值得关注的常数：压力
除体系受到污染之外，几乎所有柱前的问题都能在压力变化上表现出来。
压力来源：泵上的压力传感器
最常见的问题：
压力小（几乎为零）：说明没有流动相流过柱子。
可能原因：
柱前漏夜
流速设为0了
流动相干了
吸滤头没有放流动相液面之下
频繁出现的气泡会影响到流路的延续性，应该注意。吸滤头堵，管路脏（通常是水相）有可能带来频繁出现的气泡。可以先A，B的溶剂瓶调换一下。PURGE三五次。后换回来，再PURGE两次。清洗一下管路。
压力过大：说明流路堵了
逐段排查，先从柱（预柱）前接口（因为柱子最易堵某一段堵了（通常是柱子）。换柱子（或预柱）。
换针：
调针位：
调针位：
设定洗针体积：
一些小概念：
PEEK：聚醚醚酮
色谱管道，外径多为1/16inch，1inch=2.54cm，1/16in=2.54cm，内径大小以颜色标准，红色（我们用的）最小，为0.13mm（应该是国际统一标准）
PEEK接头手紧即可
不锈钢接头要用工具紧
接头分一体的和分为主体和压紧环两部分的。后者在拧紧的过程中，不易带动管道扭曲变形。
可能原因：泵体内有气泡，泵头单向阀坏。
先确认是哪一台泵有问题。先走100%A相。看是否压力还是波动大，还大则说明A泵有问题。压力正常则说明A泵正常。再走100%的B相，过程如上。
确认好泵之后，先purge一下，以驱赶气泡。Purge两次后，还是压力波动大，这有可能单向阀坏了，需要清洗或更换。
Ctc自动进样器的常用维护操作（实验室现场操作）：
也可能进样过程有问题，注意观察进样针活塞是否推到底。可能由于流通阀堵塞，造成压力大，进样针没法推到底。
重现性不好：
内标波动大，可能喷雾针脏了，使得喷雾不均匀。可能是液相方法没有开发好。峰型差，峰太宽都有可能造成面积不重复（不会差别太大）。
注意观察重现性不好的那几针，是否峰型比较特殊，保留时间也有较大变化，如果是，很有可能是由于pump里进了气泡，造成流速不稳，这点可以从压力变化得到确认，但是好像没法记录压力曲线。
梯度方法的建立：
Rs：分离度，表示两峰分离程度的物理量。
k：容量因子，表示某溶质在固定相和流动相中物质的量的比，在等度洗脱中。一种物质的k值是恒定不变的。上面两试针对的是梯度洗脱， 表示的平均容量因子。
a：分离因子，两个溶质的容量因子的比。通常k大的作为分子。表示两物质分离能力的大小。
N：理论塔板数，表示柱子的分离能力，也就是柱效。
= W
W=1.70
=0.7则W=0.7*1.70=1.19
差不多刚好实现单位质荷比的分离
线性范围：
信号强度与样品浓度的关系可用如下关系式表示：R=ARCX。R为信号强度大小，AR为响应因子。C为样品浓度，X为指数。X=1，表示在线性范围之内，考虑到实验误差等因素。一般只要X在0.98-1.92之间，就认为还在线性范围之内。线性范围是一个浓度范围，下限比较难测。通常就以最小检测量或最小检测浓度作为线性范围的下限。
不锈钢的压紧环是一次性的
单位换算：
1MPa=10bar=7500.6torr=14.5psi
Psi：pound per square inch (psi)
Torr：托里彻利，标准大气压的1/760。也就是mmHg（毫米汞柱）
其它问题：
残留大：
很可能是洗针过程有问题，注意观洗针时有没有抽上液体，抽上来的液体是否有很多气泡。出现过由于转子磨损，洗针液不能顺畅流出进样口。造成洗针不充分。清洗或更换转子。
流路中有大段气泡：
通过大流速（如5ml/min）冲洗可以去除泵体内气泡。也就是常说的PURGE。按下泵的面板上的purge键即可。每次PURGE的时间和流速可以在面板上设定。通常不改。初始值应该是5ml/min，3min。
但有时候泵体内空气太多，purge都不可以，或者很难抽上流动相，这是可以在purge的同时，用注射器，在泵的废液出口处抽。直到没有气泡。
死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
死体积(dead volume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）
质谱检测器的色谱图：chromatogram，强度和时间的图。等同于紫外检测的色谱图。
质谱检测器的光谱图：spectrum，某一时间点（段时间内平均）的强度相对质荷比的图
下图上半为一色谱图，下半部为图是灰色方块（2.5min左右）内，平均强度相对质荷比的光谱图。类似于紫外中的全波长图。
分辨率：unit分辨率定义为半峰宽为0.7。其意义如下：
流路中有大段气泡
处理方法：
漏液：从泵的出口到柱子的前端接口（柱后漏液几乎不会影响压力值）顺次检查。泵上有自己的漏液传感器。检测到漏液。会停止工作并蜂鸣，变红。同时显示错误信息：ERROR：LEAK DETECTED。发现漏液点，先停泵，重新接好。将漏液擦干。
有的漏液不明显，这时压力的也不会太小，检查时要注意，可用手仔细摸各个接口，感觉是否湿冷。
压力还高：说明是柱前某段堵了。
这时再将进样器出口（接柱子）的peek管接头拧下：
压力正常：说明是这段peek管堵了。换peek管。
压力还高：说明是进样器之前的部分堵了。通常是进样器六通阀堵了。反冲或清洗流通阀。
其它部分依次类推。
压力波动大：说明流路中的液流不平稳，这时色谱图通常保留时间不稳定，峰型也不好。得到的线性，重复性也不会好。
关于偶尔出现的气泡，不用太过在意，因为：
1.有脱气机在。
2.在purge时，由于流速太大，难免会出现气泡。尤其是在purge阀开超过180度，废液出口处出现气泡就跟平常了。
3.只要气泡不在泵腔内堆积，就几乎不会影响到分析结果。只要出了泵口，在高压下会
被压缩的很小。不影响流路的延续性。
所以，只要观察压力变化，如果压力没有异常波动，就行。在泵体内有气泡堆积时，压力波动会变大。什么样的波动算正常，需要大家注意观察。根究经验，在以恒定流速，梯度不变时，面板上以MP为单位的显示值应该几乎不变。