FRET 荧光共振能量转移
13 荧光共振能量转移
Fluorescence resonance energy transfer, FRET
导言
荧光共振能量转移（FRET）已广泛应用于荧光的所有应用，包括 医学诊断、DNA分析和光学成像。FRET的广泛使用是由于能量传 递的有利距离，通常为蛋白质的大小或膜的厚度。此外，FRET的 程度很容易从荧光团的光谱特性预测。如果荧光团的光谱特性允 许FRET，它将发生，并且不会受到样品中生物分子的显著影响。 这些有利的特性允许基于样品的已知尺寸和结构特征来设计实验。 FRET是一种可以用经典物理学解释的电动力学现象。FRET发生 在激发态的供体（D）分子和基态的受体（A）分子之间。供体分 子通常以较短的波长发射，与受体的吸收光谱重叠。能量转移发 生在没有光子出现的情况下，并且是供体和受体之间的长程偶极偶极相互作用的结果。术语共振能量转移（RET）是优选的，因 为该过程不涉及光子的出现。能量转移率取决于供体的发射光谱 与受体的吸收光谱的光谱重叠程度、供体的量子产率、供体和受 体跃迁偶极的相对取向以及供体与受体之间的距离。受体分子 RET的距离依赖性允许测量供体和受体之间的距离。
FRET的理论基础
两种不同的发荧光分子，一个为D，另一个为 A 。当D吸收激发光，使D处于激发态D*。这 时如果在附近存在A，D*的激发能传给附近的 A，使A处于激发态A*, A* 就会发荧光
D * A D A* A hv (荧光）
这一现象称为激发能量转移或荧光共振能量转 移。D为供能者（donor , D),A为受能者 （acceptor, A),A发出的荧光称敏化荧光。
荧光与荧光光谱
与发光速率常数Kf呈反比关系，即 Kf越大，则 τ越小 一般物质的为10-9s 数量级，因而测量时所用 的脉冲时间必须小于10-9s ，在测量时只能用 光脉冲，所用仪器为瞬态荧光光谱仪 一般荧光光谱仪用氙灯产生荧光，发出的荧光 是稳定的, 因此普通所用的荧光光谱仪不能测量
荧光共振能量转移技术在蛋白质研究中的应用
荧光共振能量转移技术在蛋白质研究中的应用蛋白质是生命活动中不可或缺的分子，其结构和功能具有极其重要的研究价值。
荧光共振能量转移技术（FRET）是近年来被广泛应用于蛋白质研究中的一种技术。
本文将介绍FRET技术的基本原理以及在蛋白质研究中的应用，并且分析FRET技术的优势和局限性。
一、FRET技术的基本原理FRET是指基于两个发射荧光信号的不同颜色，即接受者荧光二次激发的信号和给体荧光发射的信号之间的能量传递。
在二者距离越近，能量转移的效率越高，也就是说接受者荧光强度则会增强，而给体荧光强度则减弱。
因此，FRET技术可以通过测量荧光强度的变化来研究分子间距离的变化。
FRET技术通常需要三个关键的组分：一是给体分子，即发出荧光信号的分子；二是接受者分子，即接收能量的分子；三是这两个分子之间的桥梁，即是通过某些特定的结构，比如基于染料、化学修饰物或蛋白质的标记来实现。
FRET研究的原理和应用包括以下几方面：1. 能量转移的范围介电常数（Dielectric constant）是常数，以描述介质对静电场的响应功能。
当介电常数越小时，FRET的距离传感器效果会更好。
2. 水解酶/内切酶的测量许多水解酶和内切酶都是含有两个底物的。
如果这两个底物分别标记为荧光基团（即“给体”和“受体”）并且贡献了不同的荧光谱轮廓，就可以测量它们之间的距离。
通常，分子底物被标记为一种用荧光染料标记的底物和一种荧光基团荧光标记的底物。
3. 蛋白质折叠和细胞信号的分析FRET技术也可以用于测量蛋白质折叠状态的变化。
蛋白质通常被认为处于“折叠状态”或“不折叠状态”。
如果在两者之间出现折叠的变化，则可以将该变化与一系列信号事件联系起来，包括结构变化、功能调节和疾病发展。
二、FRET技术在蛋白质研究中的应用FRET技术在蛋白质研究中有着广泛的应用。
主要包括以下几个方面：1. 研究蛋白质交互作用蛋白质间的交互作用是细胞中许多生化反应所必需的。
时间分辨荧光共振能量转移(tr-fret)结果
时间分辨荧光共振能量转移(tr-fret)结果时间分辨荧光共振能量转移（tr-FRET）是一种用于研究生物分子间相互作用的技术，常用于研究蛋白质结构的构象变化、蛋白质与配体的结合以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用等。
这种技术可以从微观尺度上了解生物分子间不同方面的相互作用，从而更好地理解其功能以及潜在的药物靶点。
荧光共振能量转移是通过荧光探针的荧光信号变化来模拟分子间的相互作用，同时又从能量转移上解释荧光信号强度的变化，因此也称为荧光共振能量转移技术。
荧光探针通常包括接受体和供体，分别用于测定分子间的间距以及分子的相对方向。
通过测量供体的荧光信号强度以及接受体的荧光信号强度，可以确定分子之间的间距和相对方向，从而了解分子间的相互作用以及产生的荧光信号变化。
在实际应用中，tr-FRET技术通常采用荧光分子作为荧光探针，用于检测生物分子间的相互作用。
荧光分子通常包括供体、接受体以及荧光色团等分子，不同的荧光分子可以根据其荧光特性、化学结构等进行选择。
常用的荧光探针包括Cy3/Cy5双染料、ATTO488/ATTO594等荧光标记物体系，以及蛋白质标记荧光分子、小分子标记荧光分子等。
时间分辨荧光共振能量转移技术最大的优势在于其高度的灵敏度以及选择性。
由于荧光信号可以在微观尺度上反映分子间的相互作用，因此可以提供更加准确的结果。
同时由于荧光分子的选择性，该技术可以用于研究分子间的各种不同类型的相互作用。
tr-FRET技术在分子生物学、药物研究等领域中的应用前景非常广阔。
例如，在研究蛋白质结构和功能时，该技术可以帮助研究人员了解蛋白质间的相互作用，这对于理解蛋白质功能和构象变化具有重要的意义。
同时，在药物研究领域中，该技术可以用于评估药物靶点的亲和性以及药物分子与靶点之间的相互作用等问题。
总之，时间分辨荧光共振能量转移技术是一种非常重要的生物分子相互作用研究技术，其应用前景非常广阔。
随着该技术的不断发展和完善，相信它会在更广泛的领域中得到应用，为人类健康和生物科学的发展做出贡献。
荧光共振能量转移技术的基本原理和应用
荧光共振能量转移技术的基本原理和应用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer , FRET）作为一种高效的光学分子尺”在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。
在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。
蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。
FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。
一、FRET技术基本原理荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。
FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。
能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。
作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。
人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。
（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。
核酸荧光探针荧光共振能量转移的研究及其应用
核酸荧光探针荧光共振能量转移的研究及其应用在生命科学领域中，核酸的检测和分析一直是一个非常重要的研究方向。
为了能够更好地对核酸进行检测和分析，人们发明了一种新技术——核酸荧光探针荧光共振能量转移技术（FRET），取得了很多成功的应用。
本文就来详细介绍一下这项技术。
一、荧光共振能量转移的原理及机制荧光共振能量转移技术是通过两个特殊设计的荧光分子之间的相互作用来实现研究的。
其中，一个荧光分子作为受体，另一个作为供体。
当两个荧光分子处于一定的距离时，荧光供体的激发态能量可以通过非辐射跃迁的方式传输到荧光受体上，荧光受体因此得以激发并发射荧光。
这个过程中，荧光供体和荧光受体的各种物理特性都会对能量传递过程产生影响。
荧光共振能量转移过程中，能量传递的距离直接关系着传递效率的高低。
在一般情况下，这个距离多在10至100埃之间。
此外，还需要荧光供体和荧光受体吸收和发射的波长有重叠区域。
这就要求两种荧光染料有一定的重叠波长区域，才能使能量传递过程更加有效。
二、核酸荧光探针荧光共振能量转移的研究FRET技术被广泛应用于核酸分析中，尤其是DNA和RNA的测序、检测和描绘。
在这里，核酸荧光探针是一种特殊的FRET体系，它由荧光供体和荧光受体一起组成，这两个分子都和核酸连在一起。
核酸荧光探针能够通过特异性与DNA或RNA杂交形成双链结构，从而实现能量传递过程。
由于DNA和RNA本身之间是具有一定的互补性质的，因此核酸荧光探针可以通过这个互补性定位到特定的序列中进行检测和分析。
在设计核酸荧光探针时，选择合适的荧光供体和荧光受体也是非常重要的。
供体和受体的选择需要充分考虑它们的吸收与发射光谱，以及这两者之间的重叠区域。
同时，为了使探针在特定的位点上高效识别目标序列，将荧光供体和荧光受体设计在同一核酸分子上的方法也被逐渐采用。
近年来，人们还尝试探讨FRET技术在一些特殊情况下的应用，如在离子和分子识别中。
在这些情况下，荧光供体和荧光受体的距离和重叠区域会受到离子和分子浓度的影响。
tamra 荧光共振能量转移
Tamra 荧光共振能量转移一、概述荧光共振能量转移（FRET）是一种分子之间能量转移的过程，通过这种过程，一个激发态分子的能量可以传递给另一个分子，从而激发另一个分子成为激发态。
这种过程在生物学、生物化学和生物医学等领域中有着重要的应用和意义。
二、原理在FRET中，通常存在一个受体分子和一个给体分子。
当给体分子受到激发而处于激发态时，它会发出一个能量恰好与受体分子的激发态能量相匹配的光子。
这时，受体分子会吸收这个光子，使得受体分子也处于激发态。
在一些情况下，受体分子会通过发出荧光或者其他方式释放掉这部分能量。
三、应用1. 生物标记FRET被广泛应用于生物标记技术中，通过激发和检测受体分子和给体分子之间的能量转移来实现生物分子的定位和监测。
利用荧光共振能量转移技术可以观察蛋白质在细胞内的相互作用，研究生物膜上的受体、通道、酶等分子，并且还可以用作高通量筛选技术。
2. 光学成像FRET也被应用于光学成像领域，通过观察分子间的荧光共振能量转移过程，可以实现高分辨率的光学成像，例如在研究细胞内分子的定位和互作关系方面有着重要的应用。
3. 荧光传感FRET在分析化学和生物医学领域中也有重要应用，例如可以将FRET 技术应用于生物分子或者环境中的化学物质的传感与检测。
四、发展随着生物技术和光学成像技术的不断发展，FRET技术也在不断改进和应用扩展。
更加灵敏和可视化的FRET探针正在不断被设计和制备，为生物医学和生命科学研究提供了更好的工具。
FRET技术也与其他技术相结合，如单分子成像技术、光学和电化学技术等，以实现更加全面和深入的生物分子研究。
五、结语荧光共振能量转移作为一种重要的分子间能量转移方式，在生物学、生物化学和生物医学领域中有着广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和发展，相信FRET技术将在更广泛的领域中发挥更加重要的作用。
六、优势和挑战FRET技术的优势在于其高度的灵敏度和分辨率，能够实现单个分子层面的检测和成像，同时对生物分子的动态过程有着极佳的监测能力。
荧光共振能量转移
FRET技术研究PEDF和目标蛋白之间在小鼠神经元（神经胶质细胞）的相互作用一、FRET技术基本原理荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。
FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。
能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。
作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。
人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。
（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。
最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。
相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。
）以GFP的两个突变体CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）为例简要说明其原理：CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。
荧光共振能量转移(FRET)
原理
FRET系统
分子信标
在较低温度下，分子信标与靶标结合呈 S1 状态，发出荧光。 随着温度升高，分子信标与靶标分离，分子信标重新恢复为发卡式结构即 S2 状态，从而荧光强度减弱。 温度持续增高，将导致分子信标熔链即 S3 状态，荧光基团振能量转移（FRET）
黎景景
• 两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子 吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能 态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作 用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发 生能量共振转移） • FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电 偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体 激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体 可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光）， 也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着 荧光寿命的相应缩短或延长。
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2. 荧光（Fluorescence)：当处于基态的分子吸收光能后进入激发态，并且立即返回基态并以 荧光（ ：
光的形式释放能量，这种光称为荧光。
3. 磷光（Phosphorescence）:分子从激发三线态返回基态以光的形式释放能量。 磷光（ ） 4. 激发(Excitation, Ex)和发射(Emission, Em)光谱（Spectra):
2. 绿色荧光蛋白类(Green Fluorescent Proteins, GFPs)
参考阅读文献
1. Jonathan D. Violin,et al., A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. J Cell Biology, 2003,161:899–909 2. Elizabeth A J et l., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-1395 3. Rajesh B S. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. J Cell Biology, 2003, 160: 629–633 4. Jin Zhang, et al.,. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. PNAS ,2001, 98: 14997–15002 5. Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP. Biophysical Journal , 2003,85:599–611 6. Alexander Sorkin, et al., Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Current Biology 2000, 10:1395–1398
Em. 535nm
Acceptor
Ex. 440nm
FRET 原理(Principle)
FRET的条件
发生FRET需要三个条件： 发生FRET需要三个条件： FRET需要三个条件 1、供体分子的发射光谱和受体分子的吸收
光谱必须有显著的重迭， 30％； 光谱必须有显著的重迭，一般大于 30％； 2、供体分子和受体分子间的距离必须在 之间. D和 间的FRET 效率： 1 – 10 nm 之间. D和A间的FRET 效率：
6 R0 E= 6 R0 + R 6
D Em
A Ex
4505Biblioteka 0550600λ (nm)
R0: E=50%时供体和受体分子间的距离.对于特定 的供体受体对是常数; R: 供体和受体分子间的距离. E: FRET效率. 对于R特别灵敏.
举例: 假设 R0=5nm, 1） R=10nm, E=1.5% 2） R=5nm, E=50% 3） R=6nm, E=25%
S1 hν0 hν1 hν2 S0 T1
荧光共振能量转移(FRET)现象
1. 供体 供体(Donor, D) 2. 受体 受体(Acceptor, A) 3. FRET现象的特征 选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光 现象的特征: 现象的特征
Em. 470nm
Donor
CFP
YFP Ex. 470nm
3、供体分子的发射态偶极矩与受体分 子的吸收态偶极矩、 子的吸收态偶极矩、以及它们的向量 必须满足一定的条件
FRET的应用 的应用
通过 FRET 技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息。 常用于解决如下问题: 1)蛋白分子的共定位; 2)蛋白分子聚合体; 3)转录机制; 4)转换途径; 5)分子运动; 6)蛋白折叠等生物学问题.
思考题
1. 为什么FRET效率对供体受体分子间的空间距离非 常灵敏?
2.你认为FRET技术特别适合什么领域?举例说明。
3. A和B分子都不能发射荧光,要求采用FRET技术检 测二者之间的相互作用特征,请问应该如何处理?
论文题目： 供体受体对之间R0定量分析与计算
荧光共振能量转移
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
陈 同 生 华南师范大学信息光电子科技学院
分子能级与荧光
1. 能级（ Energy Level）：原子的可能状态是不连续的，因此各状态对应能量也是不连续的。 能级（ ）：
包含电子能级、振动能级和转动。
Miyawaki A, et al., Nature 1997, 388:882-887
在FRET实验中经常使用的 供体-受体荧光分子对
1.染料类(Dye)
FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5 BFP-GFP BFP-YFP CFP-YFP CFP-dsRED GFP-dsRED
FRET技术应用一:检测两个发光分子间的重合与共定位
Laser
Laser
D A
荧光标记
利用FRET技术检测不发光分子间相互作用的策略
FRET技术应用二: 检测分子间的相互作用
Laser
FRET技术应用三: 检测分子的折叠与构象变化
Laser
FRET技术应用举例：细胞内钙离子浓度的实时测量
(b)