1荧光共振能量转移原理如果两个荧光团相距在1~10nm之间,且一个
简述荧光共振能量转移技术
简述荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术（FRET）是一种通过荧光信号的传递来研究分子间相互作用的技术。
它基于荧光分子的特性，利用分子间的能量传递来研究化学和生物学系统中的相互作用。
荧光共振能量转移是一种非辐射能量传递的过程，它发生在足够靠近的两个荧光分子之间。
这两个分子分别称为给体和受体。
给体的激发态能量可以通过FRET传递给受体，从而使受体从基态跃迁到激发态。
这一过程在分子间的距离较近时才能发生，一般要求距离在1-10纳米范围内。
通过测量受体的荧光强度变化，可以获得有关给体和受体之间相互作用的信息。
在FRET过程中，给体和受体的选择非常重要。
给体的荧光发射波长应与受体的吸收波长相匹配，以确保能量传递的有效性。
常用的给体-受体组合包括荧光蛋白-荧光蛋白、荧光染料-荧光蛋白、荧光染料-金纳米颗粒等。
FRET技术在生物学研究中得到了广泛应用。
例如，通过将荧光蛋白标记在感兴趣的蛋白质上，可以研究蛋白质的定位、结构和功能。
通过观察荧光信号的变化，可以了解蛋白质与其他分子的相互作用、结合和解离过程。
此外，FRET还可以用于研究细胞和组织中的信号传导、代谢过程等。
除了生物学研究，FRET技术也在化学、材料科学等领域得到了应用。
例如，通过合成特定结构的荧光分子，可以实现对分子间相互作用的精确控制和检测。
这对于研究分子的自组装、聚集行为以及材料的光学性质具有重要意义。
FRET技术的发展受到了许多因素的影响。
首先，荧光分子的性质和性能对FRET的效果有着重要影响。
选择合适的荧光分子对于获得准确的结果至关重要。
此外，实验条件的控制也是关键因素。
温度、溶剂、pH值等因素都可能影响FRET的效果，因此需要进行严格的实验控制和优化。
荧光共振能量转移技术是一种用于研究分子间相互作用的强大工具。
通过测量荧光信号的传递，可以获得有关分子结构、相互作用和功能的重要信息。
FRET技术在生物学、化学和材料科学等领域具有广泛的应用前景，将为我们深入了解分子世界提供更多的可能性。
1荧光共振能量转移 原理 如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个
1.荧光共振能量转移如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个荧光团的发射光谱与另一个荧光团的吸收光谱有重叠,当供体被入射光激发时,可通过偶极-偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受体分子,供体分子衰变到基态而不发射荧光,受体分子由基态跃迁到激发态,再衰变到基态同时发射荧光。
这一过程称为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。
1.适用于活细胞和固定细胞的各类分子,2.灵敏度和分辨率高,并能清晰成像,3.准确度高，操作简便4.最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息,首先,FRET对空间构想改变十分敏感,其测量范围在1~10 nm,但如果待测蛋白原本就相当接近, FRET信号已经达到最大值,此时一些刺激引起的微小的构想改变就可能无法引起FRET信号的很大改变;其次,存在光漂白作用, FRET需要起始激发光激发D,这时就很难避免对A的间接激发,这样的交叉激发降低了分析的灵敏性; 第三,存在其他一些本底荧光的干扰;另外,起始激发光可能会破坏一些光敏的组织和细胞,产生光毒性。
这些缺点很大程度上限制了FRET的进一步发展。
2.蛋白质双杂交技术以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。
由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。
如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。
这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。
通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。
荧光共振能量转移及相关分析方法
荧光共振能量转移及相关分析方法荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是一种通过分子间非辐射能量转移过程来研究分子间相互作用的技术。
它广泛应用于生物医学领域，用于研究生物大分子（如蛋白质和核酸）的相互作用、结构和功能。
在FRET过程中，一个分子的荧光就能转移到另一个分子上，既不发出荧光也不带来辐射能量损失。
这种能量转移的效率与两个分子之间的距离密切相关，通常要求两个分子的距离在1至10纳米之间。
FRET的原理基于荧光分子的特性。
荧光分子（受体）吸收光子能量后进入激发态，然后通过非辐射能量转移的方式将能量传递给一个接受体分子。
接受体分子可以是一个发生荧光的分子，也可以是一个荧光猝灭剂。
如果接受体分子是一个发生荧光的分子，它将重新辐射有相同或不同波长的光子。
如果接受体分子是一个猝灭剂，它将通过非辐射机制将能量降低为热或振动能。
荧光共振能量转移具有很多优点。
首先，由于非辐射能量转移的效率与分子间距离的六次方成反比关系，所以FRET可以提供亚纳米尺度的分辨率。
其次，FRET技术操作简单，不需要复杂的分析设备，可以在大多数实验室中实施。
此外，FRET可以在单个分子水平上进行研究，提供了对生物大分子的高灵敏度分析。
因此，FRET广泛应用于生物医学研究中各个方面，例如蛋白质相互作用、信号传导、酶活性和膜蛋白结构的研究。
在FRET研究中，有几种常用的分析方法。
首先是通过荧光显微镜观察FRET信号。
荧光显微镜可以实现对单个分子或细胞的FRET信号实时监测和定量分析。
其次是可以借助分点突变的手段，通过改变受体分子上的特定氨基酸残基，来研究荧光共振能量转移的机制和效率。
此外，还可以利用光谱和时间分辨荧光光谱法来研究FRET现象。
这些方法能够提供更加详细和准确的FRET分析结果。
除了上述基本的FRET分析方法，还有一些改进和扩展的技术被用于更加复杂和精确的研究。
荧光共振能量转移技术的基本原理和应用
荧光共振能量转移技术的基本原理和应用-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII荧光共振能量转移技术的基本原理和应用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。
在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。
蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。
FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。
荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。
FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。
能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。
作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。
人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。
荧光共振能量转移FERT
动生物医学研究的发展。
人工智能和机器学习在FERT数据分析中应用
数据处理和分析自
动化
利用人工智能和机器学习技术， 实现FERT数据的自动处理和分析， 提高数据处理效率。
特征提取和分类识
别
通过机器学习方法，对FERT数据 进行特征提取和分类识别，辅助 研究人员对实验结果进行解读和 分析。
预测模型构建
荧光探针
设计具有特异性识别功能 的荧光探针，用于检测生 物体内的特定分子或离子。
荧光成像技术
结合显微镜、荧光共聚焦 等技术，对生物样品进行 高分辨率、高灵敏度的荧 光成像。
药物筛选与设计
药物靶标研究
01
利用FERT技术，研究药物与靶标蛋白之间的相互作用，为药物
设计提供理论依据。
药物代谢动力学研究
02
在本次项目中，我们将FERT技术应用于多种生物分子相互作用的研究，如蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA等，进一步 验证了该技术的通用性和可靠性。
建立了完善的实验流程和数据分析方法
通过不断摸索和实践，我们建立了一套完善的FERT实验流程和数据分析方法，为后续的研究提供了重要 的参考和借鉴。
展望未来发展趋势和挑战
开发新型荧光染料和荧光蛋白，提高荧光信号的强度和稳定性， 以增加检测的灵敏度和特异性。
优化实验条件
通过调整实验条件，如温度、pH值、离子强度等，改善荧光共振 能量转移的效率，提高检测效果。
引入信号放大技术
结合信号放大技术，如酶联反应、纳米材料等，增强荧光信号，提 高检测灵敏度。
多模态成像技术在FERT中应用前景
活体成像的应用前景
FERT技术具有非侵入性、高灵敏度等优点，未来有望在活 体成像领域发挥重要作用。然而，活体成像需要解决荧光 染料的生物相容性、光稳定性等问题，这也是未来FERT技 术发展的重要方向之一。
荧光共振能量转移
1990年代
荧光共振能量转移技术开始应用于生物成像 领域。
1970年代
荧光共振能量转移技术开始应用于生物分子 相互作用的研究。
2000年代至今
随着技术的发展和仪器的改进，荧光共振能 量转移技术不断得到优化和应用拓展。
02
荧光共振能量转移
的实验技术
实验设备与试剂
荧光光谱仪
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激发态与荧光态
激发态
分子吸收光子后进入的较高能级状态。
荧光态
激发态分子通过辐射衰变回到基态，释放出光子，即荧光。
能量转移与荧光寿命
能量转移
当一个荧光分子的发射光谱与另一个分子的吸收光谱重叠时，后者可能从前者接收能量， 实现能量转移。
荧光寿命
荧光态分子的平均寿命，即荧光辐射衰变至基态的平均时间。
04
影响因素分析
分析实验结果，探讨荧光共振 能量转移的影响因素，如染料 浓度、溶剂性质、温度等。
应用前景
根据实验结果，探讨荧光共振 能量转移在生物医学、化学、
物理等领域的应用前景。
03
荧光共振能量转移
的理论基础
能级与光谱
能级
分子在吸收特定能量后，电子从基态 跃迁至激发态，形成不同的能级。
光谱
不同能级间存在能量差，当光子能量 与能级差相匹配时，分子吸收光子并 跃迁至激发态。
太阳能电池的光电转换效率和稳定性。
光电器件与太阳能电池的优化
03
通过荧光共振能量转移技术可以对光电器件和太阳能电池进行
优化，提高其性能和应用范围。
05
荧光共振能量转移
的挑战与展望
荧光共振能量转移的局限性
《荧光共振能量转移》课件
使用单色仪扫描不同激发波长下的荧 光光谱，观察荧光共振能量转移现象
。
光谱采集
使用荧光光谱仪采集荧光光谱，记录 荧光强度随波长的变化。
数据处理与分析
对采集到的光谱数据进行处理和分析 ，提取相关信息，如荧光寿命、能量 转移效率和光谱位移等。
数据处理与分析方法
Hale Waihona Puke 1 2荧光寿命测量
通过测量荧光衰减曲线，计算荧光分子的寿命。
荧光共振能量转移的概念起源于 20世纪50年代，最初用于研究分 子间的相互作用。
发展
随着技术的不断进步，荧光共振 能量转移的应用范围逐渐扩大， 成为生物医学、化学等领域的重 要工具。
未来展望
随着新材料的发现和技术的创新 ，荧光共振能量转移有望在更多 领域发挥重要作用。
02
荧光共振能量转移的原理
分子能级与光谱
通过荧光共振能量转移技术可以快速筛选出与目标分子结合的药物 候选物，提高药物研发效率。
医学诊断
荧光共振能量转移技术可以用于肿瘤标记物检测、免疫分析等医学 诊断领域，提高诊断准确性和灵敏度。
在化学与材料科学领域的应用
化学反应监测
荧光共振能量转移技术可以实时监测化学反应过程中分子的动态变 化，有助于深入了解化学反应机理。
能量转移效率计算
根据荧光光谱的变化，计算能量转移效率。
3
光谱位移分析
分析荧光光谱随激发波长的变化，确定能量转移 的特性。
04
荧光共振能量转移的应用 实例
在生物医学领域的应用
生物分子相互作用研究
利用荧光共振能量转移技术可以实时监测生物分子间的相互作用 ，有助于深入了解生命过程和疾病机制。
药物设计与筛选
荧光探针简介
哪些分子具有较强的双光子吸收能力？
1、含有供电子基团（D）和/或吸电子基团（A），且均 通过大的π体系以共轭方式相连；
2、具有以下结构特征：
1）D- π-D
2） D- π-A
3）D- π-A- π-D
4） A- π-A
5）A- π-D- π-A
6）A（- π -D）3
3、增强供/吸电子基团的供/吸电子能力或增加供/吸电子 基团的数目，一般有利于增强双光子吸收能力；
(HOOCH2CH2C)2N
O
O
H
O
N
N
(HOOCH2CH2C)2N
O
+Ca2+ -Ca2+
配体与Ca2+络合后，荧光显著增强
-OOC N
O
-OOC
O
Ca2+ O
H
N
N
-OOC N
O
-OOC
引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445
荧光探针方法的优点
灵敏度高（一般用量10-4~10-5mol/L）； 选择性好； 可用显微镜直接观察，时空分辨率很高； 响应时间短； 操作方便、成本低； ∙∙∙∙∙∙
国外权威期刊
Angew.Chem.Int.Ed. J.Am.Chem.Soc. .Chem. mun. Org. Lett.
Thank you all for coming You were great audience
正常发出荧光
光诱导电荷转移机理（PCT）
当直接连有供电子基的荧光团和吸电子基共扼连接时，在光的激发下，分子内 就会发生从电子供体到电子受体的电荷转移。此即光诱导电荷转移（PCT）。 PCT效应可以使分子的荧光增强并且光谱红移。
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1荧光共振能量转移原理如果两个荧光团相距在1~10nm之
间,且一个
1.荧光共振能量转移
原理
如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个荧光团的发射光谱与另一个荧光团的吸收光谱有重叠,当供体被入射光激发时,可通过偶极-偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受体分子,供体分子衰变到基态而不发射荧光,受体分子由基态跃迁到激发态,再衰变到基态同时发射荧光。
这一过程称为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。
优点
1.适用于活细胞和固定细胞的各类分子,
2.灵敏度和分辨率高,并能清晰成像,
3.准确度高，操作简便
4.最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息,
缺点
首先,FRET对空间构想改变十分敏感,其测量范围在1~10 nm,但如果待测蛋白原本就相当接近, FRET信号已经达到最大值,此时一些刺激引起的微小的构想改变就可能无法引起FRET信号的很大改变;
其次,存在光漂白作用, FRET需要起始激发光激发D,这时就很难避免对A的间接激发,这样的交叉激发降低了分析的灵敏性; 第三,存在其他一些本底荧光的干扰;
另外,起始激发光可能会破坏一些光敏的组织和细胞,产生光毒性。
这些缺点很大程度上限制了FRET的进一步发展。
2.蛋白质双杂交技术
原理
以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。
由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱
饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。
如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。
这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。
通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。
酵母双杂交系统的优点及局限
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。
〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA －结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。
激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道
基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。
酵母双杂交系统在分析蛋白—蛋白间相互作时的优点:
（1）检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。
（2）作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
(3) 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
(4) 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
(5)分析新基因的生物学功能，用未知功能的基因去筛选文库，然
后根据钓到的已知基因的功能推测新基因的功能。
缺点
(1) 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在细胞核内无法进行。
(2) 酵母双杂交系统的“假阴性”
(3) 酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。
3.噬菌体展示技术
原理
噬菌体展示技术是利用基因工程手段将合成的一组一定长度的
随机序列寡核苷酸片段克隆到特定表达载体中, 使其表达产物以融合蛋白的形式呈现在丝状噬菌体表面。
进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体。
优点
不受样品量限制，可人工扩增，类似PCR对DNA的扩增
融合目的蛋白的噬菌体被分泌出胞外，免去了细胞破碎、提纯等物理化学步骤，保持了蛋白的天然构象
可进行反复筛选，对目的蛋白进行春花和富集
缺点
由于受大肠杆菌转化效率的限制, 一般肽库的容量只有109, 所以高于这一限制的基因将难以表达。
从建库开始, 密码子的选择与寡核苷酸的合成, 即编码肽的基因就带有一定的偏爱性, 这就从先天决定了肽库复杂度即多样性的局限性。
作为噬菌体的宿主, 大肠杆菌的生物合成系统有本身的表达限制, 如不能进行氨基酸的修饰。
4.蛋白质的亲和色谱
原理
色谱又叫层析。
亲和层析属于吸附层析的范畴，根据不同物质在同一吸附剂上的吸附能力不同进行分离，将样品放入基质中，经展开，吸附能力差的迁移快，吸附能力强的迁移慢，达到分离的目的。
优点
利用它从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的高纯度的活性物质,不但能可以用来分离一些含量极微的物质,而且可以分离那些性质十分相似的生化物质。
缺点
载体(如琼脂糖)价格昂贵,机械强度低;配基制备困难,有的配基本身需要分离纯化，步骤繁琐。
5.亲和印迹
原理
印迹法（bloting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后利用这种多肽的特异抗体来检测。
优点
高分辨率的电泳技术，特异敏感的抗原-抗体反应，1-5ng中等大小的靶蛋白
缺点
易产生背景太高的原因等问题。