人凝血因子Ⅷ效价检验标准操作规程
凝血因子Ⅷ抑制物实验室检测
Southern Medical University
立即封板，37 ℃ 2h
Southern Medical University
Southern Medical University
ID
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1A
106
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
100
2B
80.6
−
Southern Medical University
定量检测性能评价
阳性率：61.19%，Bethesda方法为64.31% 经配对卡方检验：P＝0.144 一致性检验：Kappa=0.715， P＝0.000 灵敏度：87.22% 特异度：85.71% 阴性预测值：78.83% 阳性预测值：91.67% 诊断符合率：86.69%
160.0BU/mL
Southern Medical University
指标性能评价(n=261)：
定性检测性能评价
经ROC曲线分析(0.939)，APTTD（APTT2-APTT1）CUT-OFF值为1.6sec
APTTCI纠正指数CUT-OFF值为0.55(APTTCI=APTT*APTT1*APTT2* APTTD3/106)
rn Medical University
FⅧ抑制物自动化筛查的方法学研究
1. 以SYSMEX CA1500为检测平台 2. 以凝固法为检测原理 3. 分别设定即刻纠正试验（APTT1）及孵育后纠正
试验（APTT2）程序 4. 所有试剂均为商品化试剂 5. FⅧ抑制物筛查所需时间小于20min
Southern Medical University
人凝血因子检验方法
人凝血因子检验方法引言人凝血因子是一组在血液凝固过程中起关键作用的蛋白质。
凝血因子检验是评估一个人的凝血功能是否正常的重要方法。
本文将介绍人凝血因子检验的方法，包括常用的实验室检测方法和新兴的分子诊断技术。
1. 凝血因子简介人体内共有13种已知的凝血因子，它们按照其参与凝血反应的顺序被编号为Ⅰ至ⅩⅢ。
这些凝血因子在正常情况下相互协作，形成一个复杂而精确的平衡系统，以维持正常的止血和溶栓过程。
2. 常用实验室检测方法2.1 凝血酶原时间（PT）PT是评估外源性凝血通路功能的指标。
该测试使用钠柠檬酸抗凝剂处理患者的血液样本，然后添加磷酸钙和组织因子来启动凝血反应。
通过计算患者样本中形成凝块所需时间来确定PT值。
2.2 部分凝血活酶时间（APTT）APTT是评估内源性凝血通路功能的指标。
该测试使用钠柠檬酸抗凝剂处理患者的血液样本，然后添加磷酸钙和活化的部分凝血活酶来启动凝血反应。
通过计算患者样本中形成凝块所需时间来确定APTT值。
2.3 血小板计数和出血时间除了凝血因子本身，血小板也是维持正常止血过程中不可或缺的组成部分。
进行完整的凝血功能检查时，还需要评估患者的血小板计数和出血时间。
3. 分子诊断技术近年来，随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的新兴检测方法被应用于人凝血因子检验中。
3.1 多重PCR多重PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种高效且灵敏的分子生物学技术，可以同时检测多个基因突变。
在人凝血因子检验中，多重PCR可以用于快速筛查常见突变引起的凝血因子缺陷。
3.2 基因测序基因测序是一种直接测定DNA序列的方法。
通过对凝血因子相关基因进行全序列测定，可以发现罕见突变或新的基因变异，为凝血功能异常的诊断提供更准确的依据。
3.3 基因芯片技术基因芯片技术是一种高通量的基因分析方法，可以同时检测上千个基因。
在人凝血因子检验中，基因芯片技术可以用于快速筛查多个凝血相关基因的变异。
人凝血因子Ⅷ效价测定一步法
人凝血因子Ⅷ效价测定一步法1 试剂1.1样品稀释液：取1容积的3.8%枸橼酸钠液加入5容积咪唑缓冲液。
1.1.1 咪唑缓冲液称0.68g咪唑和1.17g氯化钠溶于100ml蒸馏水中，加入42.2ml 0.1mol/L盐酸，然后被加入蒸馏水至200ml,pH为7.3。
1.1.23.8%枸橼酸钠溶液称9.5g枸橼酸钠溶解于250ml蒸馏水中。
1.2 血小板代用品“兔（人）脑组织的氯仿抽提液”。
用前用生理盐水稀释至适当倍数。
1.3白陶土生理盐水混悬液称0.5g白陶土加生理盐水至100ml即可使用。
1.4 基质血浆取人凝血因子Ⅷ含量低于2%的血友病病人血浆或人工基质血浆，然后分装于5ml安瓿，冻干或-30℃保存。
1.50.05mol/L氯化钙溶液称111g氯化钙溶于1000ml蒸馏水中，配制成1mol/L氯化钙贮存液，用前进行20倍稀释，配成0.05mol/L氯化钙溶液。
1.6 人凝血因子Ⅷ标准品及标准血浆人凝血因子Ⅷ国家标准品或经国家标准品标化的工作标准（定量分装冻干，置-30℃保存，一般2IU/ml左右），用前取样品稀释液溶解成1IU/ml。
标准血浆系取30份新鲜正常人血浆等量混合后，分装于小瓶内，置-30℃保存。
自采血后至分浆冻结整个过程不得超过4小时。
1.7待测样品按标示量加入注射用水溶解，测定时稀释成1IU/ml。
2 测定2.1取2支试管，每管加入0.1ml基质血浆和0.1ml样品稀释液，混匀，再加0.1ml血小板代用品和0.1ml白陶土悬液，混匀，将试管置37℃水浴保温一定时间（一般2～6分钟），然后加入0.1ml0.05mol/L氯化钙溶液，记录凝固时间，2管平均值为基质血浆的“空白”值（一般应大于3分钟）。
2.2 标准品或标准血浆用样品稀释液分别进行10倍、20倍、40倍、100倍和200倍稀释，用不同稀释浓度标准品代替2.1项试验中样品稀释液，按上述方法分别测定凝固时间。
2.3 待测样品稀释成约0.02～0.04IU/ml，代替2.1项试验中样品稀释液，同时分别测定凝固时间。
凝血因子Ⅷ定性检测试剂盒(凝血块溶解法)
凝血因子Ⅷ定性检测试剂盒(凝血块溶解法)简介：凝血因子Ⅷ在Ca 2+的参与下，能使可溶于尿素或单氯乙酸溶液的可溶性纤维蛋白单体聚合物变为纤维蛋白，因此含因子Ⅷ的血浆凝固后不再溶解于上述溶液。
如果待检血浆中缺乏因子Ⅷ，则聚合物可溶解于上述溶液。
Leagene 因子Ⅷ用于定性检测人、动物血浆中凝血因子Ⅷ。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、 离心机2、 计时器3、 水浴锅操作步骤(仅供参考)：1、 制备待测血浆：取新鲜待测静脉血，与柠檬酸钠抗凝剂混合，轻轻混匀。
离心，收集上层液(缺乏血小板的血浆)，转移至塑料试管或离心管，以防止血小板被激活。
同时应设正常对照血浆。
2、 取待测血浆(包括正常对照血浆)、CaCl 2(25mM) l ，混匀。
3、 置于水浴，期间轻轻混匀数次，直至凝块形成。
4、 将凝块转移至F Ⅷ溶液，每5min 观察1次，共计2h ；2h 后每2～4h 观察1次，共计24h 。
参考区间： 24h 内纤维蛋白凝块不溶解则为阳性注意事项： 编号 名称 TC0321 100T Storage 试剂(A): 柠檬酸钠抗凝剂 30ml RT 试剂(B): CaCl 2(25mM) 10ml 4℃ 试剂(C): F Ⅷ溶液 10ml 4℃ 使用说明书 1份1、以上操作，应同时测定正常对照。
2、获得样本后，应及时检测，一般不应超过1h，4℃不应超过4h。
3、应精确控制孵育温度在37±1℃，过高或过低均会影响结果。
4、抽血要顺利，抗凝要充分。
5、分离血浆应在3000g离心10min，务必去除血小板。
6、本检测试剂盒敏感性低，特异性高。
有效期：6个月有效。
相关：编号名称CS0001 ACK红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)CS0201 细胞线粒体分离试剂盒DC0032 Masson三色染色液DF0135 多聚甲醛溶液(4% PFA)DM0002 姬姆萨染色液(Giemsa stain,1:9)PW0040 Western blot一抗稀释液TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)。
医疗机构医院医学实验室凝血因子活性测定技术要求
医疗机构医院医学实验室凝血因子活性测定技术要求1 范围本标准规定了凝血因子（Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ）活性测定的技术要求，包括了一期法、二期法和发色底物法。
由于方法学不一致，本标准不涉及纤维蛋白原检测和凝血因子XIII的检测。
本标准适用于开展凝血因子活性检测的医学实验室，用于规范相应的检测过程和质量控制。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
WS/T 359-2011 血浆凝固实验血液标本的采集及处理指南WS/T 406-2012 临床血液学检验常规项目分析质量要求WS/T 407-2012 医疗机构内定量检验结果可比性验证指南3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1凝血酶原时间prothrombin time, PT血浆与凝血活酶试剂（例如，组织因子）和氯化钙反应后发生凝固所需要的时间。
[WS/T 359-2011，定义2.1]3.2活化部分凝血活酶时间activated partial thromboplastin time, APTT血浆与适量的氯化钙（CaCl2）、部分凝血活酶试剂盒接触因子激活剂（如白陶土）反应后发生凝固所需要的时间。
[WS/T 359-2011，定义2.2]3.3定标曲线calibration curve校准曲线参考曲线定量反映凝血因子活性与纤维蛋白形成所需时间之间的相互关系的曲线。
3.4参考血浆reference plasma校准血浆定标血浆已知凝血因子活性的枸橼酸钠抗凝的正常混合血浆。
该血浆可以自备，亦可从制造商处购买，用于制备参考曲线。
3.5乏因子血浆factor-deficient plasma缺乏待测凝血因子的血浆。
3.6质控血浆control plasma源于人或动物血，或者人工制成的新鲜、冰冻或冻干的血浆，用于质量控制。
血浆凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ促凝血活性测定
血浆凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ促凝血活性测定摘要】目的讨论血浆凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ促凝血活性测定。
方法对样本进行临床检验。
结论参考范围(一期法)FⅧ：C 54.29%～168.51%，FⅨ：C 50.09%～222.05%，FⅪ：C 81%～118%， FⅫ：C 61 %～148%。
因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ的促凝活性检测与Ⅱ：C、V：C、Ⅶ：C、X： C等一样，都是以相当正常人的百分活性来表示的，故工作参考值很重要，志愿者以100例为好，且年龄段分布要有代表性，制成的混合血浆在一30℃下也只能保持3个月。
每次检测都必须制作标准曲线。
【关键词】血浆凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ促凝血活性测定参考范围(一期法)FⅧ：C54.29%～168.51%，FⅨ：C50.09%～222.05%，FⅪ：C81%～118%，FⅫ：C61 %～148%。
结果评价1.生理情况血浆凝血因子Ⅷ曾称为抗血友病因子(antihemophilic factor，AHF)或抗血友病球蛋白(antihemophilic globulin，AHG)，正常人血浆浓度很不稳定，一般为0.1mg/L，分子质量为3330000，肝脏可能是主要的合成场所，其基因定位于X性染色体(Xq28)，长度为186kb。
凝血因子Ⅸ也称为凝血活酶成分(plasma thromboplastin com-ponent，或叫christmas因子，分子质量为56000，正常血浆浓度为3～4mg/L，为肝脏合成的维生素K依赖性凝血因子，其基因定位于X染色体(Xq27.1)，长度为34kb。
凝血因子Ⅺ，又称血浆凝血活酶前质(plasma thromboplastin antecedent，PTA)，是一种较为稳定的凝血蛋白，血浆正常浓度为4～6mg/L，分子质量为160 000，由肝脏合成，基因定位于4号染色体(4q35)，长度为23kb。
因子Ⅻ，也称Hageman因子，正常血浆浓度为29mg/L，分子质量为80 000，主要由肝脏合成，基因定位于第5号染色体(5q33-ter)，长度为11.9kb。
冻干人凝血因子Ⅷ浓制剂制造及检定规程
冻干人凝血因子Ⅷ浓制剂制造及检定规程本品系由乙型肝炎疫苗免疫健康人的新鲜血浆分离、提纯、冻干并经病毒灭活制成。
主要成份为人凝血因子Ⅷ及少量纤维蛋白原，含适量枸橼酸钠，不含防腐剂。
本品对缺秒人凝血因子Ⅷ所致的凝血机能缺陷具有纠正作用，专供防治甲型血友病患者的出血症状。
1 制造1.1制造要求1.1.1 对血浆的要求1.1.1.1所用之血浆来源应符合《原料血浆采集（单采血浆术）规程》要求，血浆应无凝块、无纤维蛋白析出，非脂血，无溶血。
在采集时应减少皮肤损伤，保持血流通畅，并与抗凝剂充分混合，用塑料袋采集。
新鲜分离液体血浆或新鲜冰冻血浆及冻结冷沉淀，均可用于生产。
1.1.1.2分离后的血浆应保持无菌，并应及时冰冻保存。
自采血到冻结一般在8小时内完成。
液体血浆应在4±2℃贮放，贮放时间应不超过小时，最长不得超过12小时。
冰冻血浆（-30℃以下）保存期不超过6个月。
1.1.2 对制造工作室、设备及原材料的要求，与《人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程》中1.1.3～1.1.4项要求相同。
1.2 制造工艺1.2.1 采用低温乙醇法或冻融法制得冷沉淀，经抽提、吸附、精制，亦可采用经卫生部批准的其他工艺制备，并经卫生部批准的适宜方法进行病毒灭活处理。
1.2.2 分批同一制造工艺、同一容器混合的制品作为一批，不同滤器和不同机柜冻干的制品分为亚批。
1.2.3 稳定剂及防腐剂制品内允许加稳定剂，制品应不含防腐剂。
1.2.4除菌过滤及分装本品应用微孔薄膜过滤，可直接分装无菌的成品瓶内，每瓶装量根据效价及规格确定。
1.2.5 半成品检定每批半成品应进行效价测定及热原质试验，并按亚批做无菌试验。
1.2.6 冻干除菌过滤分装的制品经外观检查后立即冻结，并按《人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程》1。
2。
5项规定进行冻干，但制品温度不得超过35℃。
1.3 规格每瓶含人凝血因子Ⅷ的效价可有50、100、200、300、400IU五种，制品的效价应标示在瓶签及包装上。
人凝血因子Ⅷ效价检验标准操作规程
人凝血因子Ⅷ效价检验标准操作规程1目的严格规范操作者的检测方法，使操作者能够快速有效和安全准确地完成检验操作，特制定本操作规程。
2适用范围本操作规程适用于冷沉淀、人凝血因子Ⅷ洗脱原液、原液、半成品、冻干及成品等含有人凝血因子Ⅷ的供试品效价检测。
3制定依据《中华人民共和国药典》（2015年版）三部，附录3521人凝血因子Ⅷ效价测定法（一期法）。
4职责4.1检验人员按本SOP对供试品进行检验和计算。
4.2复核人对检验中的计算进行复核。
4.3确认人按本SOP对检验过程及结果进行相应确认和判定。
5仪器及器具5.1仪器5.1.1凝血仪5.1.2电子天平5.1.3电子分析天平5.1.4漩涡混匀器5.2器具5.2.1微量移液器5.2.2吸头5.2.3移液管5.2.4洗耳球5.2.5试管5.2.6试管架5.2.7砂轮5.2.8凝血仪耗材（比色盘、供试品杯等）6试剂及试液6.1试剂6.1.1人凝血因子VIII国家标准品6.1.2人凝血因子VIII比较品6.2试液6.2.1人凝血因子Ⅷ缺乏血浆6.2.2稀释液（咪唑稀释液/因子稀释液/样本稀释液）6.2.3激活的部分促凝血酶原激酶时间试剂6.2.4氯化钙溶液7操作步骤7.1供试品溶液、比较品溶液及标准品溶液的制备7.1.1供试品及比较品溶液的制备7.1.1.1供试品及比较品的预稀释用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将供试品预稀释成约1IU/ml（冻干制品先按标示量加入水溶解；冷沉淀先取1~2g，加水溶解约为20倍。
具体稀释过程如下：7.1.1.2供试品预稀释液的工作稀释（供试品溶液）将上述含人凝血因子Ⅷ约1IU/ml的供试品预稀释液用稀释液稀释6倍、8倍、10倍。
具体稀释过程如下：先取500μl已预稀释成含人凝血因子Ⅷ约1IU/ml的供试品预稀释液，加500μl稀释液，稀释成含人凝血因子Ⅷ约0.5IU/ml，混匀，再分别从中取200μl移到3支试管中，分别加400μl，600μl和800μl稀释液。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
人凝血因子Ⅷ效价检验标准操作规程
1目的
严格规范操作者的检测方法，使操作者能够快速有效和安全准确地完成检验操作，特制定本操作规程。
2适用范围
本操作规程适用于冷沉淀、人凝血因子Ⅷ洗脱原液、原液、半成品、冻干及成品等含有人凝血因子Ⅷ的供试品效价检测。
3制定依据
《中华人民共和国药典》（2015年版）三部，附录3521人凝血因子Ⅷ效价测定法（一期法）。
4职责
4.1检验人员按本SOP对供试品进行检验和计算。
4.2复核人对检验中的计算进行复核。
4.3确认人按本SOP对检验过程及结果进行相应确认和判定。
5仪器及器具
5.1仪器
5.1.1凝血仪
5.1.2电子天平
5.1.3电子分析天平
5.1.4漩涡混匀器
5.2器具
5.2.1微量移液器
5.2.2吸头
5.2.3移液管
5.2.4洗耳球
5.2.5试管
5.2.6试管架
5.2.7砂轮
5.2.8凝血仪耗材（比色盘、供试品杯等）
6试剂及试液
6.1试剂
6.1.1人凝血因子VIII国家标准品
6.1.2人凝血因子VIII比较品
6.2试液
6.2.1人凝血因子Ⅷ缺乏血浆
6.2.2稀释液（咪唑稀释液/因子稀释液/样本稀释液）
6.2.3激活的部分促凝血酶原激酶时间试剂
6.2.4氯化钙溶液
7操作步骤
7.1供试品溶液、比较品溶液及标准品溶液的制备
7.1.1供试品及比较品溶液的制备
7.1.1.1供试品及比较品的预稀释
用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将供试品预稀释成约1IU/ml（冻干制品
先按标示量加入水溶解；冷沉淀先取1~2g ，加水溶解约为20倍。
7.1.1.2 供试品预稀释液的工作稀释（供试品溶液）
将上述含人凝血因子Ⅷ约1IU/ml 的供试品预稀释液用稀释液稀释6倍、8倍、10倍。
具体稀释过程如下：
先取500μl 已预稀释成含人凝血因子Ⅷ约1IU/ml 的供试品预稀释液，加500μl 稀释液，稀释成含人凝血因子Ⅷ约0.5IU/ml ，混匀，再分别从中取2
00μl 移到3支试管中，分别加400μl ，600μl 和800μl 稀释液。
供试品稀释可根据本身效价高低及仪器环境等变化作适当适当调整。
7.1.2 标准品溶液的制备
7.1.2.1 预稀释：将标准品按标示量加入水溶解，取100μl 复溶品，加人凝
血因子Ⅷ缺乏血浆适量预稀释成约1IU/ml 。
7.1.2.2 工作稀释：将上述1IU/ml 的标准品用稀释液稀释2倍、4倍、8倍、
16倍、32倍。
7.2检验操作
7.2.1凝血仪准备：
7.2.1.1先打开凝血仪电源，在反应盘上放入比色盘，预热使反应仓温度
达到37℃。
7.2.1.2分别将激活的部分促凝血酶原激酶时间试剂和氯化钙溶液加入
凝血仪的相应区域。
7.2.2上机测试凝固时间
7.2.2.1将供试品杯加到供试品盘上，并按要求在相应的供试品杯中加入
供试液（标准品、比较品和供试品稀释液）和相应试剂。
具体加
入位置如下：
Dil杯加入稀释液；
18号杯加入人凝血因子Ⅷ缺乏血浆；
1~14号杯加入待测液；
7.2.2.2按仪器操作规程启动人凝血因子Ⅷ效价测定程序；
7.2.2.3测定结束后，记录返回的凝固时间
7.2.3测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10%，否
则重测。
7.3结果处理
7.3.1标准曲线制作：
将标准品5个不同稀释度所含人凝血因子Ⅷ效价（IU/ml），分别取对
数值；再将其各相应浓度所测得的凝固时间（秒，s），也分别取对数
值。
然后按统计学方法作直线回归方程（用excel计算）：
logy = blogx+a
其中：x为人凝血因子Ⅷ效价，IU/ml；
y为测得相应凝固时间，秒（s）。
7.3.2供试品及比较品效价计算：
将3个不同浓度的供试品所得到凝固时间（秒）分别代入方程式计算
x值；然后将所得x值分别乘以相应的供试品稀释倍数，即得到3个
相应的效价（IU/ml）；计算这3个效价值的平均值作为供试品中人凝
血因子Ⅷ效价。
7.4注意事项
7.4.1标准曲线直线回归相关系数应不低于0.98。
7.4.2每个稀释度的标准品或供试品平行测定2管，2管之差不得超过均值
10%，否则重测。
7.4.3直接接触标准品、供试品和血浆的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。
7.4.4应急预案
7.4.4.1仪器与电脑无法连接（仪器无法将实验数据传到电脑上不易于对
实验的考察及结果分析，试验过程中数据未能在电脑上读取）。
检
查线接口，重新连接仪器电脑。
7.4.4.2如遇到供试品还未上机检验停电，则待来电后，检验照常进行。
如遇上机过程中断电在不影响检验结果的情况下继续检验直到结
束，否则重新检验。
7.4.4.3电源无法关闭，可能是电路短路，会导致机器死机。
7.4.4.4长期频繁的开关会导致仪器电源的松弛，仪器不容易关闭，应减
少开机次数，按仪器使用说明书定期维护。
7.4.4.5针头堵塞，操作仪器点击清洗，将针头冲干净。
8判定基准
检验结果的判定依据相应品种的质量标准进行
9生效日期
本规定自2015年12月01日起正式生效。