军团菌属检验标准操作规程
细菌总数检查标准操作规程
细菌总数检查标准操作规程1目的建立规范细菌总数检查标准操作规程，确保检查操作正确。
2范围适用于本公司的细菌总数检查操作。
3职责4术语及定义无5 内容5.1实验5.1.1仪器设备：电热恒温培养箱、电动移液器、生物安全柜、电子天平、PH计。
水浴锅、研钵、玻璃珠、三角瓶。
5.1.2试剂：生理盐水、卵磷脂吐温80-营养琼脂培养基、吐温80、液体石蜡、0.5%氯化三苯四氮唑。
5.1.3耗材：10 mL刻度移液管、90mm培养皿5.2实验前准备5.2.1检查样本是否保持原有的包装状态。
容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。
5.2.2接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。
5.2.3若只有一个样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做微生物检验，再将剩余样品做其他分析。
5.2.4在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。
5.2.2供试品处理5.2.2.1液体样品5.2.2.1.1.水溶性的液体样品，用灭菌吸管吸取10mL 样品加到90mL 灭菌生理盐水中，混匀后，制成1：10 检液。
5.2.2.1.2油性液体样品，取样品10g，先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80，在40℃—44℃水浴中振荡混合10min，加入灭菌的生理盐水75mL（在40℃—44℃水浴中预温），在40℃—44℃水浴中乳化，制成1：10 的悬液。
5.2.2.2膏、霜、乳剂半固体状样品5.2.2.2.1亲水性的样品：称取10g，加到装有玻璃珠及90mL 灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15min。
用其上清液作为1:10 的检液。
5.2.2.2.2疏水性样品：称取10g，置于灭菌的研钵中，加10mL 灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加入10mL 灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70mL 灭菌生理盐水，在40℃—44℃水浴中充分混合，制成1：10 检液。
军团菌检验方法实施细则
军团菌检验方法实施细则1适用范围：本细则适用于各类样品中军团菌的检测鉴定。
2检测依据：国家《传染病诊断标准》WS195-2001 军团病诊断标准及处理原则军团病诊断标准及处理原则，卫生部，2002年上海市卫生防疫站1979；卫生防疫细菌检验，第一版，上海科技出版社3设备与材料3.1冰箱：4～-20℃。
3.2恒温培养箱：36±1℃。
3.3振荡器3.4显微镜40x 100x3.5离心机12000rpm3.6架盘药物天平：0 g -500g, 精度0.5g。
3.7锥形瓶：100 mL、500 mL。
3.8灭菌吸管：1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。
3.9灭菌平皿：直径90 mm。
3.10灭菌试管：16 mm×160 mm.。
一般用的是18*180mm3.11 温水浴箱：36±1℃3.12 二氧化碳培养箱：5%CO236±1℃3.13 紫外灯3.14 过滤器4培养基和试剂4.1 BCYEα琼脂成份：N-2-乙酰胺基-2-氨基乙烷磺酸（ACES） 10.00 克氢氧化钾片（85%KOH 试剂级） 2.80 克活性炭（Norit A） 1.50 克酵母浸膏（Difco） 10.00 克琼脂（Difco） 17.00 克α-酮戊二酸（单钾盐） 1.00 克L-半胱氨酸盐酸盐（溶于10毫升蒸馏水中） 0.40 克焦磷酸铁（溶于10毫升蒸馏水中） 0.25 克蒸馏水 1000 毫升4.2甘氨酸、万古霉素、多粘菌素B（GVP）琼脂成份：除上述每升BCYEα琼脂成份外，再加：甘氨酸 3.00 克万古霉素 5.00 毫克多粘菌素B 10 万单位4.3 明胶酶试验培养基：此培养基的制备，除用明胶（每100ml 中加3g ）代替琼脂外，其它同BCYE α培养基。
4.4 酪氨酸BCYE α培养基：在BCYE α琼脂中除去碳粉，再于每升培养基中加0.45g 酪氨酸。
军团菌属
3. 抵抗力
1）对化学消毒剂、干燥、紫外线较敏感 2）对氯或酸有一定抵抗
二、致病性与免疫性
1. 致病物质：
多种酶：磷酸酯酶
毒素：细胞毒素
菌毛 微荚膜
2.所致疾病：军团菌病
* 传播途径：
1)主要通过呼吸道吸入带菌飞沫 2)中央空调冷却塔用水污染军团Biblioteka 菌而导致感染* 临床类型：
1)流感样型（轻症型） 2)肺炎型（重症型） 3)肺外感染
一、生物学性状
1. 嗜肺军团菌的形态学特征
* G－杆菌，常规染色不易着色
Giemsa染色：呈红色
Dieterle镀银染色：呈黑褐色
* 端生或侧生鞭毛，有微荚膜和菌毛
* 在组织中呈短杆状，人工培养基上呈
多形态性
2. 培养特性及抗原结构
* 需氧菌，营养要求高 * 抗原组成： 菌体抗原：分型依据，我国流行 1~6型 鞭毛抗原
军团菌属
检验系 刘涛
* 军团菌是引起军团病的病原体，首发于1976 年的美国退伍军人一次聚会，故称作军团病 * 军团菌在自然界普遍存在，在天然水源及人 工冷、热水管系统更多见 * 军团菌在1984年被正式列入变形菌门、γ-变
形菌纲、军团菌目、军团菌科、军团菌属，
其属下共有46个菌种。
嗜肺军团菌 L. pneumophila
3. 免疫性
* 嗜肺军团菌为胞内寄生菌
* 细胞免疫在抗感染中起主要作用
三、微生物学检查法
四、防治原则
谢谢
军团菌检验-金盛楠
根据WHO官方网站的数据，温度对军团菌生长的影响如下：
◆ Above 70 °C (158 °F) - 几乎立即死亡 ◆ At 60 °C (140 °F) - 90% 在2分钟内死亡 (Decimal reduction time (D) = 2) ◆ At 50 °C (122 °F) - 90% 在 80-124 分钟内死亡, 根据菌株不同而有所 区别 (Decimal reduction time (D) = 80-124) ◆ 48 to 50 °C (118 to 122 °F) – 能够生存，但不能繁殖 ◆ 32 to 42 °C (90 to 108 °F) – 理想生长温度 ◆ 25 to 45 °C (77 to 113 °F) – 生长温度范围 ◆ Below 20 °C (68 °F) – 能生存，处于休眠状态，即使在冰冻条件下
Etiologic agent
Legionella species
Legionella species
Attack rate*
< 5%
> 90%
Isolation of organism
Possible
Virtually never
Outcome
Hospitalization common Case-fatality rate: 5-30%**
流行病学特点
1、传染源 兼性厌氧保内寄生菌，广泛存在于自然界水源与人工管道水源中，
空调系统冷却塔、循环蓄水池等是军团菌的常住地。主要寄生在原核 生物细胞体内，如阿米巴。原核生物不但提供各种军团菌所需要的营 养成分，在环境不利的情况下也为军团菌提供了一个庇护的场所，也 是军团菌转移、迁徙与感染高等动物与人的载体。原虫被军团菌裂解 后大量的菌体被释放到水体、环境中，通过宾馆一些能产生气溶胶的 器件而被人体吸入感染。
淋浴水嗜肺军团菌检测原始记录
淋浴水嗜肺军团菌检测原始记录管理编号：xxx/XX-XXX报告编号：第页/ 共页检测项目淋浴水中嗜肺军团菌送检日期检毕日期检测环境温度：ºС 相对湿度：% 检测地点样品来源样品编号仪器型号及编号检测方法或依据参照GB/T 18204.5-2013 《公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统》和ISO11731-1998《水中军团菌检测方法》一、试验器材及试剂1、细菌培养皿2、BCYE培养基3、BCYE-CYS培养基4 、选择性培养基：GVPC培养基5、酸缓冲液6、灭菌水二、样品前处理1、采样：用高压灭菌的玻璃瓶取水样0.5L。
2 、送样：将样品避光避热一天内送达实验室，从采样到培养的时间间隔最大不超过15天。
三、检验步骤1、样品预处理水样：将水样mL用0.22μm微孔滤膜过滤，用镊子将滤膜转移到具帽容器中，加入15mL 灭菌水，在震荡器上震荡，时间不少于2min。
肉眼可见浑浊的污水水样可直接培养。
将预处理过的样品分成三部分，一部分不作处理，一部分热处理，一部分酸处理。
热处理：将1mL样品加入到无菌容器中50℃水浴处理30分钟。
酸处理：取1mL样品加入到无菌容器中，加入1 mL酸缓冲液，作用5min。
检测人：校核人：淋浴水嗜肺军团菌检测原始记录管理编号：xxx/XX-XXX报告编号：第页 / 共页2、接种各取0.1mL三种样品（未处理、热处理、酸处理）接种到GVPC培养基上，用无菌接种环将接种物均匀地涂抹于培养基表面。
热处理、酸处理的接种物处理过后立即进行接种。
3、培养待接种物水分被培养基吸收后，倒置培养基平皿，于5% CO2培养箱中37℃培养10天。
注意保持培养箱内湿度。
每隔三天观察培养的菌落的形态。
记下各种形态菌落的数目。
四、结果判定1、军团菌的鉴定从GVPC培养基上选择至少三个具有军团菌特征的菌落（未处理、热处理、酸处理的三种样品每个样品取三个菌落），接种于BCYE培养基和BCYE-CYS 培养基上，37℃培养2天以上。
军团菌诊断血清明书
军团菌诊断血清使用方法
经初步生化检查，疑似军团菌菌株时，应将可疑菌落制备成检测抗原，先用多价血清做玻片凝集实验，阳性反应时，再与相应的单价血清做玻片凝集实验，做出诊断。
具体方法如下：
1.产品在使用前最好恢复温度到室温。
2.将可疑菌落转接到BCYE平板中培养，在洁净玻片上用接种环滴加两滴彼此分离的生理盐水。
3.用接种环挑取一环用BCYE生长平板中培养2~3天的可疑菌落，分别与玻片上的生理盐水混匀。
4.用接种环滴加1~2滴血清于玻片上一个菌落与生理盐水的混合液中，另一个菌落与生理盐水的混合液中加入一滴生理盐水作为对照。
5.用接种环分别混匀玻片上的两种混合液。
6.凝集结果判断结果如下：
反应强度判断依据
4+ 反应澄清透明，凝集颗粒较多、较大
3+ 反应澄清透明，凝集颗粒较多、较小
2+ 反应有些混浊，但仍可见较多颗粒状凝集1+ 反应非常混浊，只有少许颗粒状凝集
- 反应完全混浊，未出现任何凝集。
关于军团菌
军团菌的历史一、1976年美国费城退伍军人协会会员中曾爆发急性发热性呼吸道疾病,经研究,发现一种细菌命名为嗜肺军团菌.随后,许多有关细菌暂被列入这一属,且追溯研究发现早在1943年即有军团人员病的病例.现已提出了超过30种军团杆菌,至少19种是人类肺炎的病原.其中最常见病原体为嗜肺军团菌(占病例的85%~90%),其次是L.micdadei(占5%~10%),再次是L.bozemanii和L.dumoffii.此类细菌形态相似,具有共同的生化特征,引起类似疾病.二、疾病的范围包括：(1)无症状血清变化；(2)自限性无肺炎的流感样病态,有时叫做庞提阿克热(Pontiac fever)；(3)军团人员病为最严重和最常见到的肺炎类型；(4)局限性,罕见的软组织感染.三、军团病占需住院治疗的社区获得性肺炎的1%~8%,占致死性医院内获得性肺炎的4%左右.大多数病例为散发性,多发生于夏末和秋初.人和人之间的传播尚未得到证实.当给水系统受到污染或形成气溶胶的病原体经空调系统冷凝器的蒸发气体,或污染的淋浴喷头传播时,嗜肺军团菌则暴发流行.军团病可发生于任何年龄,但大多数人都是中年男性.已确定的危险因素包括吸烟,滥用酒精和免疫抑制,特别是由皮质类固醇引起的免疫抑制.四、军团菌是隐藏在空调制冷装置中的致病菌，随冷风吹出浮游在空气中，吸入人体后会出现上呼吸道感染及发热的症状，严重者可导致呼吸衰竭和肾衰竭。
军团菌最早是由于部队室内密闭作业，导致群体发生上呼吸道感染而得名。
军团病是一种非常严重的、有时可以致命的肺炎。
军团病是由军团杆菌引起，这种细菌产生在自然环境中，在温水里及潮热的地方蔓延。
人工供水系统有时也能为军团杆菌的大量繁殖提供生存环境。
这些系统包括淋浴器、矿泉池、喷泉以及空调设备的冷却水塔。
人们通常是由于呼吸了被军团杆菌污染的水源散发的水雾而传染上军团病的。
据估计，在美国每年都有国每年都有8000~18000人感染上军团病。
循环冷却水中嗜肺军团菌的鉴定、培养基与试剂
附录 A（规范性附录）嗜肺军团菌的鉴定A.1 总则嗜肺军团菌作为军团菌中重要检测对象，在特定情况下应进一步用生化培养和血清学试验鉴定嗜肺军团菌。
A.2 生化培养法判定嗜肺军团菌A.2.1 氧化酶试验：使用铂/铱接种环或玻璃棒，挑取待测菌落于滤纸上，加一滴氧化酶试剂，如果在30s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性；2min不变色为阴性。
A.2.2 硝酸盐还原试验：将待测菌接种到硝酸盐培养基上，在36℃±1℃培养1d～3d，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。
立刻或数分钟内显红色为阳性，培养基颜色无变化为阴性。
注：本试验阴性的原因有三个：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。
如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。
A.2.3 尿素酶试验：将待检菌以较大量穿刺接种在尿素琼脂培养基上，36℃±1℃培养2h、4h、24h，分别观察结果，培养基变为红色为阳性,颜色不变为阴性。
A.2.4 明胶液化：将待测菌穿刺接种在明胶培养基内，于36℃±1℃培养24h±2h,取出放置于4℃±2℃冰箱内10min-30min后再观察结果，仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试验阳性；凝固不溶者为阴性。
A.2.5 马尿酸水解试验：挑取待测菌落，加到盛有0.4mL1%马尿酸钠的试管中制成菌悬液。
混合均匀后在36℃±1℃水浴中温育或36℃±1℃培养箱中培养24h。
沿着试管壁缓缓加入0.2mL茚三酮溶液，在36℃±1℃水浴中温育或36℃±1℃培养箱中放置10min后观察结果。
15min内溶液出现蓝紫色变化则为阳性；溶液无颜色变化或15min之后出现蓝紫色变化为阴性。
试验时为了避免假阴性需用标准菌株做阳性对照。
A.2.6 生化培养结果判定：氧化酶（－/弱+），硝酸盐还原（－），尿素酶（－），明胶液化（+），水解马尿酸（+），即可确定为嗜肺军团菌。
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军团菌属检验标准操作规程
1. 概述
军团菌属细菌是一群病死率较高的急性呼吸道传染病的病原菌，该菌属包括45个种（60多个血清型），已从人体分离出的有嗜肺军团菌、米克戴德军团菌、波兹曼军团菌等20种。
嗜肺军团菌是军团菌属的代表种。
2. 标本类型
痰等标本。
3.鉴定
3.1 形态与染色革兰阴性纤细小杆菌。
荧光显微镜下可见被荧光抗体包被的发亮菌体。
3.2 培养特性在缓冲活性炭酵母提取物琼脂（BCYE）培养基上，本菌生长缓慢，应每日观察生长情况，在BCYE上需要3~5日方可见菌落，数日后增大到4~5mm，菌落呈灰白色，有光泽。
3.3 生化反应大部分菌株氧化酶试验阳性，不分解糖类，动力、明胶、马尿酸钠试验阳性，触酶试验阳性，多数菌株产生β-内酰胺酶。
3.4 鉴别要点
3.4.1 本菌属特征革兰阴性细小杆菌，有多形性，苏丹黑染色可显蓝黑色或蓝灰色脂肪滴。
在BCYEα平板上3~5日形成蓝灰色、有光泽的菌落。
普通琼脂平板上不生长。
3.4.2 根据在BCYEα琼脂上生长的菌落，在紫外线365nm 灯光照射下产生红色荧光可推断为红色军团菌；产生蓝白色荧光，如氧化酶阳性，则为博氏和其他军团菌，如氧化酶阴性，则为杜氏、戈氏、彻氏、图森山军团菌；产生无色荧光，则根据马尿酸水解、氧化酶及其他生化反应进一步鉴定。
3.5 操作步骤
3.5.1 涂片、染色革兰阴性杆菌。
3.5.2 鉴定直接荧光抗体染色，生化反应。
4.药敏
参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件。
5.质量控制
见《质量管理程序》。
6.检验结果解释与分析
本菌虽然营养要求和培养环境要求严格，但在外环境分布较广，并可长期存活，致使通过污染水源空气而传播致病。
从临床或环境标本中分离军团菌时，需先对标本作酸处理（军团菌耐酸而其他杂菌则易被酸杀灭），并使用选择性琼脂平
板（在BCYEα琼脂平板上加入抗生素等抑制杂菌），以提高军团菌的检出率。
军团菌对多种抗菌药物敏感，包括红霉素、利福平、氨基糖苷类抗生素、β-内酰胺抗生素、复方磺胺甲恶唑、多西环素和福喹诺酮类等。
7.临床意义
军团菌是一种以肺部感染为主的全身性疾病，嗜肺军团菌是军团菌病的病原菌，可通过空气传播进入肺脏，临床表现多种多样。
易于侵犯患有慢性器质性疾病、免疫功能低下的病人。
也可从河水、空调的冷却水、浴室和雾化器等处分离到，为医院感染的主要致病菌之一。
8.鉴定流程。