IL-31重组腺病毒载体的构建及鉴定
人白介素24基因重组腺病毒载体的构建与鉴定
人白介素２４基因重组腺病毒载体的构建与鉴定【摘要】目的构建含有人白介素24（hIL-24）基因的重组腺病毒载体，为下一步病理性瘢痕的基因治疗研究奠定实验基础。
方法采用基因工程技术将hIL-24基因的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,鉴定正确后在PAdEasy系统中进行细菌内同源重组，通过脂质体将正确重组体包裹并转染293A 细胞以包装并扩增病毒。
采用酶切及PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。
结果酶切和PCR结果证实hIL-24基因重组腺病毒载体构建成功并可在293A细胞中表达，病毒滴度达107pfu/ml。
结论成功构建了有较强感染能力的含hIL-24基因的重组腺病毒载体。
【Abstract】ObjectiveTo construct and identify the recombinant adenovirus vector of human IL-24 gene for future gene therapy of pathological scar tissue. MethodsThe human IL-24 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pAdTrack-CMV to form the transfer vector by the method of homogenous recombination in bacteria of PAdEasy system. Then the right recombinant adenovirus was transfected into 293A cells using Lipofectine 2000. The recombinant adenovirus vector was identified by restriction enzyme digestion and polymerase chain reaction (PCR). ResultsRestriction endonuclease and PCR analysis confirmed that the human IL-24 gene was successfully inserted into the adenovirus vector. The titer of the recombinant adenovirus was 107pfu/ml. ConclusionThe recombinant adenovirus vector of hIL-24 was successfully constructed with highly infection.【Key words】Human IL-24 gene; Adenovirus; Pathological scar人白介素24基因（hIL-24）是一种肿瘤抑制基因，通过多种途径抑制、诱导、细胞的生长，对肿瘤细胞有选择性杀伤作用而对正常组织几乎无毒副作用，并且具有调节免疫系统的功能，是当今人们研究的热点[1]。
重组腺病毒常见问题解答(FAQs)解析
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Q8.重组腺病毒的推荐存储条件是什么？
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Q2.怎么确定我所用的细胞模型可以感染腺病毒？
答：腺病毒有很广泛的宿主范围。它可以感染人类或者其他哺乳动物细胞系或原代细胞，包括可分裂的和不可分裂的细胞。只有少数细胞系不被感染。一些淋巴细胞系对腺病毒有更强的抵抗性，因此需要大量的病毒来感染细胞。为了客户的方便，我们提供含有报告基因的病毒，如Ad-CMV-B-gal和Ad-CMV-GFP从而方便的进行您的预实验。
终点稀释实验的生物学原则类似于空斑形成实验，尽管二者过程和测量是不同的，而该法计算病毒滴度的公式则较之复杂。
尽管空斑形成实验和终点稀释实验给出了有感染能力或者有作用的病毒的滴度，但它们是通过人眼给出分值的，并受人及过程的变化的影响。对于相同的病毒源，不同人给出显著不同的滴度读值是很普遍的。
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Q7.对于体外实验（细胞实验）CsCl纯化或层析柱纯化有必要么？
答：对于长期存储，病毒应该被保存在-80°C，特别是在经过CsCl或层析柱纯化后。在-80°C,病毒可以稳定保存6个月到一年，在某些情况下甚至可以达到2年。如果病毒是在添加血清或BSA的DMEM中储存在-80°C,它能够稳定储存更长的时间并可以经受多次冻融过程。
另外，如果病毒经过CsCl纯化并被保存在PBS或Tris溶液(10mM Tris PH8.0, 2-3%甘油或蔗糖),应该避免反复冻融，因为这将导致滴度显著下降。
Q7.对于体外实验（细胞实验）CsCl纯化或层析柱纯化有必要么？
多药耐药基因-腺病毒重组表达载体的构建及鉴定
多药耐药基因－腺病毒重组表达载体的构建及鉴定【摘要】目的构建多药耐药（multidrug resistance，MDR）基因-腺病毒重组表达载体。
方法将MDR1基因插入到腺病毒载体，用磷酸钙沉淀法将此重组载体转染到293细胞，制备重组病毒悬液并感染靶细胞进行鉴定。
结果构建的MDR1-腺病毒载体在293细胞中大量产生，病毒滴度达109 PFU/ml，此病毒感染靶细胞后，在靶细胞中有MDR1基因的表达。
结论成功构建了MDR1-腺病毒重组表达载体。
【Abstract】Objective Construction of multi-drug resistance gene (MDR) - adenoviral recombinant expression vector．Methods MDR1 gene will be inserted into the adenovirus vector，by calcium phosphate precipitation method the recombinant plasmidtransfect into 293 cells．Recombinant virus suspension is made and infeced target cells and to indentify．Results Constructed MDR1- adenovirus vector produces a large number in 293 cells，the virus titer is up to 109 PFU/ml．After the recombinant virus infectedtarget cells in the target cells have the expression of MDR1 gene．Conclusion MDR1- recombinant adenorirus vector has been successfully constructcd．【Key words】Multi-drug resistance gene (MDR1)；Adenovirus vector；Transfection多药耐药性（multidrug resistance，MDR ）是指肿瘤细胞能对多种结构、功能及杀伤机制均不同的化疗药物产生耐受。
〖医学〗重组腺病毒载体的构建
BTEB2简介
基本转录元件结合蛋白2－转录因子 功能：促进VSMC增殖和表型转化
外源性基因的制备
VSMC中提取总RNA RT－PCR得到BTEB2 cDNA 体会：从目的基因丰度高的组织或细胞
中提取。
重组穿梭质粒的构建－－将 PCR产物克隆到穿梭质粒
用BamH I 和 EcoR I 双酶切穿梭质粒 pDC315及BTEB2 cDNA
用T4连接酶将BTEB2 cDNA反向连接到 穿梭质粒 定向克隆
体会：设计引物时引入需要的酶切位点 可使基因定向克隆的程序简化
重组穿梭质粒的鉴定
酶切鉴定：用BamH I 和 EcoR I 双酶切 重组穿梭质粒pDC315ASBTET2，电泳
目的片段测序
重组腺病毒的制备
脂质体介导重组穿梭质粒和腺病毒基因组质粒 共转染293细胞
腺病毒载体的包装细胞
HEK293细胞的培养 高糖型DMEM 10%FBS（构建），10%NBS（扩增）
HEK293细胞的传代次数与腺病毒载体构 建和扩增 构建：＜20代－－构建成功的关键 扩增：无特殊要求
重组原理
重组腺病毒载体构建
以反义BTEB2腺病毒表达载体为例 介绍重组腺病毒载体的构建过程
重组腺病毒的鉴定
病变293细胞于液氮、37°C反复冻融， 离心
取上清提取重组病毒DNA 用目的片段引物和病毒基因组特征片段
引物作PCR
病毒滴度测定
24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加
PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至 第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液 0.2ml。 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
小鼠SIGIRR基因重组腺病毒的构建及鉴定
１ ． ２ 方 法
并检测 Ｓ Ｉ ＧＩ ＲＲ ｍＲ ＮＡ 及 蛋 白在 感 染 细 胞 中 的表 达 。通过 多次 扩 增后 ， 大 量 制 备 高 滴 度 腺 病 毒 以备 作 研究 Ｓ Ｉ ＧＩ Ｒ Ｒ在 ＡＬ Ｉ 中的保 护作 用 。
１ ｒ ｅ ｃ ｅ ｐ ｔ ｏ ｒ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ， Ｓ Ｉ ＧＩ ＲＲ） 是 新 近 发 现 的
司产 品 ； 小 量质 粒 抽 提 试 剂 盒、 Ｔｒ ａ ｎ ｓ ２ Ｋ Ｐ ｌ ｕ ｓⅡ
ＤＮＡ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ ， 北京 全时 金 生 物公 司产 品 ； 琼 脂 糖 凝
样 受体 （ ＴＬ Ｒ ）
中图分类号 ： Ｑ７ ８ ４ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ７ — ５ ０ ３ ８ （ ２ ０ １ ３ ） １ ０ — ０ ０ ０ １ — ０ ８
急性肺 损 伤 （ ａ ｃ ｕ ｔ ｅ ｌ ｕ ｎ ｇ ｉ ｎ ｊ ｕ ｒ ｙ ， ＡＬ Ｉ ） 是 临床 上
常 见 的急危 重 症 之 一 ， 其 危 害 主 要 由炎 症 失 控 而 引
委员 会 的批 准 ） 。
１ ． １ ． ２ 主要 试 剂 兔抗 鼠 Ｓ Ｉ ＧＩ Ｒ Ｒ抗 体 、 ＨＲ Ｐ标
记 羊抗 兔 二 抗 ， 美 国 Ａｂ ｃ ａ ｍ 公 司产 品 ； 苏木 素 伊 红 （ ＨＥ ） 染色 试剂 盒 、 免 疫 组织化 学试 剂 盒 （ Ｓ Ｐ法 ） ， 为
（ 第 四军 医 大 学 唐 都 医 院胸 腔 外 科 ， 陕西西安 ７ １ ０ ０ ３ ８ ）
摘 要 ： 拟 构建 小 鼠 Ｓ Ｉ Ｇ Ｉ ＲＲ基 因重 组腺 病毒 并进 行鉴 定 ， 为Ｓ Ｉ ＧＩ ＲＲ在 小 鼠急性 肺损 伤 预 防及 治 疗方
蛋白激酶Nemo样激酶基因重组腺病毒载体的构建与鉴定
蛋白激酶Nemo样激酶基因重组腺病毒载体的构建与鉴定程筱雯;梁俊波;缪时英;王琳芳【摘要】目的构建含有蛋白激酶Nemo样激酶(NLK)的重组腺病毒载体.方法采用RT-PCR方法在人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增NLK基因及其突变体K155M、T286V和C425Y,同时在目的基因的C端添加便于蛋白表达检测的FLAG tag,经与载体pAdTrack-CMV连接、转化、筛选、鉴定后,将Westernblot检测表达正确的重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体再经酶切、电转入BJ5183感受态细胞(已包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1)同源重组,并筛选、鉴定、扩增.通过Pacl酶切后,以快速简便的乙醇沉淀法替代传统的酚-氯仿-异戊醇法回收酶切产物,用高效低毒高稳定性的FuGENE HD转染试剂替代传统的lipofectamin 2000转染低代数的HEK293A包装细胞,进行病毒包装.包装后的重组腺病毒感染结直肠癌细胞HCT 116,Western blot检测以确认NLK及其突变体蛋白的表达.结果经PCR、测序及Western blot检测证实,成功构建了携带NLK基因及其突变体的腺病毒载体,PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组成功,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液,扩增后感染结直肠癌细胞HCT 116能正确表达NLK蛋白及其突变体蛋白.结论成功制备NLK基因及其突变体重组腺病毒,可进一步用于NLK生理功能的研究.%Objective To construct the nemo-like kinase ( NLK) gene recombinant adenovirus vector. Methods The AdEasy system was used to construct the recombinant adenovirus vector. Using reverse transcriptase polymerase chain reaction ( RT-PCR) , the full-length gene of NLK and its mutants (K155M, T286V, and C425Y) were amplified from HEK293 cells. The FLAG tag was appended at the C-terminal of NLK. After ligation and transformation, the NLK gene and its mutants were cloned into the pAdTrack-CMV vector. It was detected by PCR, sequencing, and Western blot analysis. Using DNA recombination and homogenous recombinantion, the normally expressed plasmids were linearized by the restriction enzyme-PmeIand Pad, then the enzyme-digested products were recycled by using ethanol precipitation. The purified product was transfected to HEK293A packaging cells with FuGENE HD transfection reagent. After amplification of the recombinant adenovirus, Western blot analysis was performed to detect the expression of NLK gene and its mutants. Results The successful construction of pAdtrack-CMV-NLK ( and mutants) was confirmed by PCR and sequencing. Western blot analysis showed that the target genes and the recombinant adenovirus were obtained. This recombinant virus was able to express NLK protein and its mutants correctly in HCT 116 cells. Conclusion The NLK gene recombinant adenovirus vector was successfully constructed and identified.【期刊名称】《中国医学科学院学报》【年(卷),期】2011(033)006【总页数】6页(P632-637)【关键词】蛋白激酶Nemo样激酶;重组腺病毒载体;同源重组【作者】程筱雯;梁俊波;缪时英;王琳芳【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京100005;中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京100005;中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京100005;中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京100005【正文语种】中文【中图分类】Q-31Nemo样激酶 (nemo-like kinase,NLK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。
(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
CRTMAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开题报告
CRTMAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开题报告一、选题背景及意义腺病毒（Adenovirus）是一种双链DNA病毒，具有广泛的细胞感染性和高水平的表达能力。
由于其易于构建和高效的转染能力，腺病毒成为广泛应用于基因工程领域的载体。
目前，腺病毒载体已广泛应用于基因治疗、基因转染、疫苗制备等方面，在治疗疾病、研究疾病机制、开发新药等领域具有广阔的应用前景。
CRTMAGE-A3（Cancer-Testis Antigen MAGE-A3）是一种抗原，主要在人类癌症细胞中表达。
研究表明，利用CRTMAGE-A3进行基因治疗或疫苗制备可以有效地诱导人体免疫系统对癌症细胞产生特异性杀伤作用，达到治疗肿瘤的效果。
因此，CRTMAGE-A3成为热门的研究对象，利用腺病毒载体构建CRTMAGE-A3基因表达系统能够为该领域的研究提供有力支持。
本研究将构建CRTMAGE-A3重组腺病毒载体，并系统研究其在体外表达特性，为基因治疗或疫苗制备提供有力支持。
二、研究内容及方法2.1 研究内容本研究将完成以下研究内容：（1）设计合成CRTMAGE-A3基因片段并克隆到腺病毒载体中；（2）验证CRTMAGE-A3基因片段在载体中的稳定性和表达水平；（3）评价CRTMAGE-A3重组腺病毒载体在体外转染细胞的效率和毒性；（4）利用Western blot和免疫荧光等方法分析CRTMAGE-A3蛋白的表达和定位；（5）研究CRTMAGE-A3蛋白的生物学效应。
2.2 研究方法（1）设计、合成并克隆CRTMAGE-A3基因片段设计CRTMAGE-A3基因片段的引物，采用PCR技术扩增片段并纯化PCR产物。
使用限制酶切酶对PCR产物和载体进行双酶切，并通过连接酶将两者连接，构建CRTMAGE-A3基因重组腺病毒载体。
（2）构建CRTMAGE-A3重组腺病毒载体采用转染法将构建好的CRTMAGE-A3载体导入到腺病毒包装细胞中，并进行病毒包装。
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【 关键词 】 Ｉ ３ 重组腺病毒 Ｌ一 １
构建
表达
Ｃ ｎｔ ｃｏ ｎ ｅｔｉ ｔ ｎｏ Ｉ ３ ｅ ｍｂ ａ ｔ ｄｎｖ ｌ ｌ ｍｉ． Ｕ Ｎ ｎ — ｉ ｇ ， Ｈ Ｎ ａ —ｅｆ， Ｈ Ｎ ｈｎ— ｏｓ ｕｔｎａｄｉ ｎｉｃ ｉ ｆＬ一 １ ｃ ｉ ｎ ｅｏｉ ａ ｄ Ｈ Ａ ＧＪ ｑ ｎ Ｚ Ａ ＧＨ ｉ ｆ ｒ ｉ ｄ ｆａ ｏ ｒｏ ｎ ａ ａ ｃ ｐｓ ａ ｏ ｎ Ｚ Ａ ＧＣｕ
维普资讯
临床和 实验 医学杂 志 ２０ ０８年 ６月 第７卷
第６期
・ｌ ・ ７
Ｉ Ｌ一３ １重 组 腺 病 毒 载 体 的构 建 及 鉴 定
黄俊 琼 张海峰 章春 花 胡 永林 １遵 义 医学 院附属 医院检 验科 （ ２苏州 大学 医学 院细胞 与分子 生物学教 研 室 江 苏 苏州 ２５ ２ ） １ １ ３ 贵 州 遵义 ５３０ ； ６ ０ ３
【 摘要】 目的 构建并鉴定人 白细胞介 素 ３ （Ｌ ３ ） １Ｉ 一 １ 重组腺病毒 Ａ — Ｌ ３ ， ｄ Ｉ 一 １ 为下一 步 Ｉ ３ 功 能研 究奠定基 础。 Ｌ一 １
方法 以ｐ Ｅ Ｇ Ｍ—Ｔ—Ｉ ３ Ｌ一 １为模板 扩增 Ｉ ３ Ｌ一 １基 因， 其克隆到腺病毒 穿梭质 粒 ｐ ｄ ｒｃ 将 Ａ Ｔａｋ—Ｃ ＭＶ， ｍ Ｐ ｅＩ线性化后 与 腺病毒骨 架质粒共转化 Ｂ５ ８ Ｊ １３细菌， 获得重组腺病毒质粒 ｐ ｄ Ｌ一 １ 经 Ｐ ｃＩ线性化 后转 染 Ｑ Ｉ ９ Ａ细胞 ， Ａ —Ｉ ３ ， ａ Ｂ 一２ ３ 荧光 显微镜 下观察 细胞 内荧光， 测定病毒效价 ， 逆转录 一聚合酶链 反应 （ Ｔ—Ｐ Ｒ） Ｒ Ｃ 和蛋 白质印迹 （ ｅｔ ｌｔ分 析细胞 内 ｗｓ ｒ ｂ ） ｅ ｏ ｎ Ｉ ３ 信使核糖核酸（ Ｎ 和蛋 白质的表达。结果 Ｌ一 １ ｍＲ Ａ） ２３ ９ Ａ细胞 中有 Ｉ Ｌ一３ ｍＲ Ａ和蛋 白质表达。结论 １ Ｎ
ｉ Ｇ ｎａ ｋ ｈ ｉ ｒ ｆｅｏ ｉａｔ ｄｎｖｒｓ ｅｃ ｅ ． ｎ ｅ ｂｎ ．Ｔ ｅｔｅ ｃｍｂｎｎ ｅｏｉ ａｈｄ２ ６×１ ｐｕ ｍ１ ｌ一３ Ｒ Ａ ａｄｐｏ ｉ ｗ ｒ ｅｐｅｓｄｉ ＱＢ 一２３ ｅｌｉｆ — ｔ ｏｒ ａ ｕ ｒ ０ ｆ／ ．１ １ｍ Ｎ ｎ ｒｔ ｎ ｅｅ ｘ ｒｓ Ｉ ９ Ａｃｌ ｅ ｅ ｅ ｎ ｓｎ ｃ
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进一 步研究 Ｉ Ｌ一３ ｌ的功 能奠 定 了基础 。
经双酶 切及 基 因扩增仪鉴 定， 重组 穿梭质 粒和重 组腺 病毒质 粒
均见 ５ ０ｂ ０ ｐ插入 片段 ， 测序结果和基 因库 中的基 因序 列一致 ； 重组病毒 效价 为 ２ ６×１ ｐ ／ ｌ 重组病毒 感染后 ， Ｂ 一 ０ ｆ ｍ； ｕ Ｑ Ｉ 成功构建 Ｉ Ｌ一３ １重组腺 病毒 载体 ， 并在 Ｑ Ｉ ２ ３ Ｂ 一 ９ Ａ细胞 中表达 ， 为
Ｂｏｏ ｙ，Ｍｅ ｉａ ｃ ｏ ｌ ｕ ｈ ｕ Ｕｎｖｒｉ ｉｌｇ ｄ ｌＳ ｈ ｏ ，Ｓ ｚ ｏ ｉｅｓｔ ｃ ｙ，Ｓ ｚ ｏ ｉｎ ｓ １ １ ３， ｈｎ ． ｕ ｈ ｕＪ ｇｕ ２ ５ ２ Ｃ ｉ ａ ａ
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊ２ｖ Ｔ ｎｒｃａｄｉ ｎｆｈｍ ｎＩ ３ ｅ ｍ ｉ ｎａｅｏｉｓＭｅ ｏｓ Ｌ一 ｇｎ ａ ａ ｐｆｄｒ ｃｍ ｉ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂ￣ ｅ ｏ ｏｓｕｔ ｎ ｅｔ ｕ ａ Ｌ一 ｒ ｏ ｂ ａｔｄｎｖｕ． ｔ ｄ Ｉ ３ ｅｅ ｓ ｍ ｌｅ ｏ ｒ ｏ ｂ ｃ１ Ｊ ｃ ｔ ｄ ｉ ｙ １ ｃ ｎ ｒ ｈ １ ｗ ｉ ｆｍ ｅ ｉ —