2.腹泻症候群监测技术方案 091214

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腹泻监测工作计划

腹泻监测工作计划腹泻监测工作计划应当包括以下几个关键部分：1. 目标设定：- 明确监测腹泻的目的，如预防疾病传播、评估公共卫生措施效果等。

2. 监测范围：- 确定监测的地理区域、人群、年龄段等。

3. 数据收集：- 确定收集数据的方法，包括病例报告、实验室检测、流行病学调查等。

4. 监测指标：- 定义腹泻的诊断标准，包括症状、持续时间、严重程度等。

5. 监测周期：- 确定监测的频率，如每日、每周或每月。

6. 数据管理：- 建立数据收集、存储和分析的系统。

7. 风险评估：- 评估腹泻传播的风险因素，如水源、食物安全、环境卫生等。

8. 预防措施：- 制定预防腹泻的策略和措施，包括公共卫生教育、疫苗接种等。

9. 应急响应：- 制定腹泻爆发时的应急响应计划。

10. 培训与教育：- 对相关人员进行腹泻监测和预防的培训。

11. 合作与协调：- 与医疗机构、公共卫生部门和其他相关组织建立合作关系。

12. 监测结果的反馈与应用：- 将监测结果用于改进公共卫生政策和实践。

13. 持续改进：- 根据监测结果和反馈，不断优化监测计划。

14. 预算与资源：- 确定实施监测计划所需的预算和资源。

15. 监督与评估：- 定期对监测计划的执行情况进行监督和评估。

16. 报告与发布：- 制定监测结果的报告流程，确保信息的及时发布。

17. 法律与伦理：- 确保监测工作符合相关法律法规和伦理标准。

通过上述步骤，可以建立一个全面、系统的腹泻监测工作计划，以提高疾病预防和控制的效率。

上海市腹泻病监测技术方案2

上海市腹泻病监测的实验室检测标准操作程序第一部细菌学检测的技术方案一）霍乱弧菌检测操作程序1.标本检测流程图：.2. 操作步骤：2.1 增菌：用无菌拭子采集少量粪便（约0.5g），放入碱性蛋白胨水（APW）培养基中36±1℃增菌6-8h。

2.2分离及二次增菌：增菌后从菌液生长最茂盛的菌膜下表层，取一接种环，划线接种于双洗平板，TCBS或弧菌显色平板。

37℃培养18～24h后，选择单菌落做血清凝集实验。

标本含菌量少时，为提高检出率，实行2次增菌，取第1次碱胨水增菌6h～8h的培养物的表层液0.1mL～0.2mL，接种于8mL～10mL的碱胨水中，37℃培养6h～8h再做分离。

2.3血清学鉴定：从平板上挑取可疑菌落5-10个。

双洗平板上为湿润、黑芯、光滑菌落。

TCBS上为黄色发亮、表面光滑、稍凸起的菌落。

弧菌显色平板上为蓝色，菌落中心略有凹陷的菌落（注意该平板上可疑菌落易发生自凝）。

取少许培养物（TCBS和弧菌显色平板上的疑似菌落需转种到营养琼脂小斜面或非选择性平板后进行血清学鉴定）与O1群+O139群霍乱多价诊断血作玻片凝集试验，如很快出现肉眼可见的明显凝集即为阳性反应，阳性者必须用生理盐水按同样方法作对照试验，以排除因自身凝集而导致的假阳性反应。

并继续用小川和稻叶单价血清分型。

对O1群不凝集的可疑菌落，再用O139群诊断血清作玻片凝集。

2.4生化鉴定：在双洗平板、TCBS琼脂或弧菌显色平板上的疑似菌落转种在普通琼脂平板上，选取单菌落做生化初筛，选择单菌落做KIA和MIU实验。

进一步生化鉴定选用梅里埃生化检测卡（API20E或API20NE），或全自动生化鉴定仪鉴定。

具体操作按产品操作说明。

2.5 PCR检测：可使用商品化的试剂盒或按照合成引物及探针后进行PCR检测。

2.5.1 O1和O139双重实时PCR验证检测，引物和探针序列见表1和表2：表2 O1和O139双重实时荧光PCR检测的引物及探针引物名称核苷酸序列（5’～3’）产物长度（bp）O1 F GGAATAACTCAAGGCGATGAAGTG 117O1 R TAGAGACTCACCTTCGATTTCAGCO1 P FAM-AAACGGGTAACGCACCACACTGGACT-BHQ1O139 F CGATGGCGTGTTCATTAGAAGG 104O139 R TCCCTTTCCACCTCGGTATTTCO139 P HEX-CGGCAAACTGGCAGCAAACTCAGCA-BHQ1反应体系和反应条件为：20μL反应体系，2×PCR buffer 10μL , O1 rfb基因上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.4μL；O139 rfb基因上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.4μL；去离子水5.6μL，DNA模板2μL。

中国腹泻病诊断治疗方案

2、适用于重度脱水的患者，需立即静脉输液
第一阶段 20/kg/1h 等张液第二阶段 80/kg/5-6h 2/3张或1/2张液见尿注意补钾
继续饮食
* 继续母乳喂养 * 给予易消化的平常饮食，如粥、面片等
合理用药
* 合理使用抗生素水样便，一般不用抗生素粘液便、脓血便可选用抗生素
*微生态疗法 *肠粘膜保护剂
发病机制
*渗出性腹泻：肠粘膜的完整性受到炎症、溃疡的破坏时，可造成大量的渗出并引起腹泻。
ⅰ病原体吸附于肠粘膜表面 ⅱ病原体吸附侵入肠粘膜 ⅲ病原体侵入肠粘膜上皮细胞引起炎
性细胞浸润。
临床表现
1.消化系统症状：腹泻、呕吐 2.全身症状：体温、精神状态、面色、神
志 3.水、电解质及酸碱平衡紊乱
⑴脱水 ⑵代谢性酸中毒 ⑶钠代谢紊乱、钾代谢紊乱、钙代谢紊
霍乱的临床表现
• 为甲类烈性传染病，起病急骤，传播迅速，从1817年至今已发生过七次世界大流行，临床上以剧烈泻吐大量米泔水样排泻物、严重脱水、肌肉痉挛及周围循环衰竭为特征。
霍乱的临床表现
典型临床表现病程可分为三期 1.泻吐期：无痛性腹泻(100%)---先
无恶心性呕吐(83%)---后泻吐物米泔水样
病程在2周至2个月。 1.3慢性腹泻病（Chronic Diarrhea Diseases）:
病程在2个月以上。
诊断
（二）小儿腹泻病分类
2.病情分类 2.1 轻型：无脱水、无中毒症状。 2.2 中型：有些脱水或有轻度中毒症状。 2.3 重型：重度脱水或有明显中毒症状。
（烦躁、精神萎靡、嗜睡、面色苍白、高热或体温不升、外周白细胞计数明显增高等。）
病因
（一）内因

建立基于新型RPM的腹泻症候群多病原检测方法-医学检验论文-基础医学论文-医学论文

建立基于新型RPM的腹泻症候群多病原检测方法-医学检验论文-基础医学论文-医学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——腹泻是世界范围内最常见的感染性疾病之一[1].中国疾病预防控制中心2011年发布的报告显示[2],引起腹泻病例的病毒主要包括轮状病毒(Rotavirus A,RVA)、诺如病毒GI和GII型(No-rovirus,NoVGI、GII)、札如病毒(Sapovirus,SaV)、肠道腺病毒(Enteric adenoviruses,EAds)、人星状病毒(Human Astrovirus,HAstV)等.能引起腹泻的细菌包括志贺菌(Shigella),沙门菌(Salmonel-la),副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus),大肠杆菌(Escherichia coli),耶尔森菌(Yersinia),霍乱弧菌(Vibro cholerae)和弯曲菌(Campylobacter)等.以上这些病原体所造成的腹泻具有相类似的流行特征,无法通过临床症状诊断出确切的病毒或者细菌.由于缺少病原学证据,这些病例通常被定义为不明原因性疫情.据文献报道,婴幼儿的腹泻病例中的80%都不能得到明确的诊断和鉴定[3].当不明原因性疫情在某个国家或地区出现时,能否在第一时间对病原体的检测分离鉴定,是一个国家传染病应急防控能力和水平的标志[4].因此,建立一种高通量,高特异性,高灵敏度的准确鉴定未知病原体的技术储备是非常必要的.多重PCR技术(multiplex PCR)在保留了PCR高敏感性这一核心优势的基础上,通过优化多种引物和探针的设计策略以及检测方法,近年来已被广泛应用于消化道多病原的检测.目前已有研究者分别针对腹泻病毒[5-6],腹泻细菌[7-9]和可以导致腹泻的寄生虫[10-11]建立了分子检测方法,市面上也出现了可以同时检测多种腹泻病原体的商业化试剂盒,例如基于液相芯片技术的Luminex xTAG GPP[12]和基于毛细管电泳技术的SeeplexR○DiarrheaACE[13].以上这些技术与病毒培养,ELISA,电子显微镜技术,单重PCR等传统的方法相比较,在灵敏度,特异性,时间和费用上都有了明显的优势.但是这些方法的检测通量都相对较低,只能对常见的病原体进行鉴定,无法应对突发疫情.再测序芯片(RPM)具有传统基因芯片高通量、高灵敏度的优点,同时具备测序能力,具有很高的特异性,于2010年获得了美国FDA的紧急使用授权令(EUAs).中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所中心实验室已经建立了基于呼吸道症候群RPM检测呼吸道病毒的方法[14],并对其灵敏度和特异性进行了验证.在一次不明原因呼吸道感染的检测工作中[15],RPM对8例阴性样本进行了筛查,并从5例样本中分别检测到鼻病毒,呼吸道合胞病毒以及副流感病毒.由于呼吸道症候群RPM的良好表现,尽早的建立其他症候群的RPM方法显得尤为重要.本研究建立了一种基于新型RPM的腹泻症候群多病原检测方法,能同时检测14种轮状病毒,7种杯状病毒,8种星状病毒,28种肠道病毒和16种少见致泻病毒.并且对RPM方法进行了特异性和灵敏度的评估,同时对10份不明原因腹泻的核酸样品进行了检测.材料与方法1、试剂本实验所用试剂的种类和品牌与以前发表的研究相同,详细内容可以参考文献[15].2、仪器本实验所用仪器的种类和品牌与以前发表的研究相同,详细内容可以参考文献[15].3、标本的来源及处理所有标本均由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所腹泻室提供和鉴定,包括15份已知病毒阳性样本和10份病毒阴性腹泻临床样本.轮状病毒的鉴定采用商业化ELISA试剂盒,NoV、EAds、SaV和HAstV的鉴定采用文献中发表的方法[16-18].样品为便悬液,用QIAampMiniElute Virus Spin Kit提取,按照产品说明书进行操作,最终的洗脱体积为45l,分装冻存于-80℃冰箱.4、引物的验证以阴性样本为阴性对照,以水为空白对照,以病毒阳性样本为模板,用嵌合引物进行单一模板单一引物的PCR反应.采用Qiagen公司生产的OneStep RT-PCR Kit进行一步法逆转录扩增(RT-PCR),25l反应体系为:OneStep RT-PCRBuffer 5l,dNTP mix 1l,10mM引物 2.5l,En-zyme Mix 1l,用Rnase-free H2O补足至50l,50℃30min,95℃15min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,40个循环;72℃ 10min.将PCR产物进行Qiaxcel毛细管电泳,根据峰图或者电泳图的信号强度判断引物的扩增效率.针对不工作的引物,或者扩增效率不好的引物,参考病原体的基因组序列,通过软件Primer Primer 5.0重新设计引物.5、多重PCR和检测方法采用SuperScript IIIFirst-Strand Synthesis System进行逆转录反应(RT-PCR),试剂盒购自Invitrogen公司,20l 的反应体系为:Random hexamers 1l,10mM dNTPsmix 1l,RNA 1l,反应条件为65℃ 5min,冰浴5min;10xRT buffer 2l,0.1M DTT 2l,25mMMgCl24l, 逆转录酶SuperScript III RT 1l,RNaseOUT 1l,并用Rnase-free H2O补足至20l,反应条件为50℃50min,85℃5min.将验证过的嵌合引物分成A(38对引物,包括轮状病毒和冠状病毒)、B(33对引物,包括腺病毒、星状病毒、杯状病毒和小RNA病毒)、C(36对引物,全部为小RNA病毒)共三组,将每组嵌合引物配制成多重混合引物(Primer mix,1mol/L each),将通用引物配制成10mol/L,25l反应体系为:2xQIAGEN Multi-plex PCR Master Mix 12.5l,上、下游的混合引物各取1.25l,上、下游的通用引物各取1.25l,RT产物取2l,再用Rnase-free H2O补足至25l.反应条件为:95℃ 15min;94℃ 30s,55℃ 90s,72℃75s,10个循环;94℃30s,67℃90s,72℃75s,10个循环;94℃ 30s,50℃ 90s,72℃ 75s,30个循环;72℃10min.用QIAquick PCR Purification Kit对PCR产物进行纯化,纯化后用GeneChip Rese-quencing Assay Kit进行片段化、标记,过夜杂交16h,用GeneChip Hybridization,Wash buffer A Band Stain Kit进行洗染,最后用AffymetrixGene-chip Scanner进行扫描,GSEQ4.0软件进行分析.6、特异性用已验证的阳性病毒样本为模板来评估该方法的特异性.包括RPM检测病原谱范围内的RVA,NoV GII,SaV,EAds 41,HastV 1,新肠道病毒71型(EV71),柯萨奇病毒A16(CV A16)和RPM检测病原谱以外的呼吸道合胞病毒(RSV),甲型流感病毒(Flu A),乙型流感病毒(FluB)和博卡病毒(HBoV).7、灵敏度以体外转录的RNA(DNA病毒采用重组质粒)评估该方法的灵敏度.以特异性引物扩增靶基因的目的区域,分别针对DNA病毒和RNA病毒,将PCR的阳性产物连接至PMD18-T或者pGEM-T 载体,提取单克隆质粒.用RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒对线性化之后的RNA病毒的重组质粒进行体外转录,RNeasy MinElute Cleanup Kit纯化体外转录的RNA,用Eppendorf BioPhotometer核酸蛋白分析仪定量,根据核酸浓度和分子量计算重组质粒或者体外转录RNA的拷贝数.将体外转录RNA梯度稀释至2105、2104、2103、2102、2101拷贝/L,各取1l作为模板进行RT-PCR,再取2lRT-PCR产物进行多重PCR,检测单模板的灵敏度.非同日2次平行试验.为了模拟混合感染,将体外转录标准品等拷贝混合,并梯度稀释成2105、2104、2103、2102、2101拷贝/L,其余反应成分和反应程序与单模板反应相同.非同日2次平行试验.8、临床样本检将提取的10份便悬液核酸合并成两份混合样品,每份混合样品取2l进行RT-PCR,再分别取2l RT-PCR产物加入A、B、C 管进行多重PCR,最后将三管产物进行合并,纯化、片段化、标记,用再测序芯片杂交16h进行检测.根据再测序芯片的结果,再对10份样品进行单引物单模板的检测,并对阳性样品进行测序.结果1、特异性对于RVA,NoV GII,SaV,EAds 41和HAstV1,每个反应只出现特异杂交信号,并且能准确鉴定出病原株.EV 71和CV A16检测结果均有EV,CV 和埃可病毒(ECHO)的杂交信号,未提示其他病原体.对于RSV,Flu A,Flu B 和HBoV,RPM均无杂交信号.2、灵敏度多重检测体系单模板和多模板灵敏度试验,重组质粒或者体外转录RNA的检测下限均可达20~2 000拷贝/反应,见表1.3、不明原因样品检测结果在第一份合并样品中,检测到NoV GII和EV.在第二份合并样品中,检测到NoV GII,SaV,HAstV4型.根据芯片结果,再用NoV GII,SaV,HAstV4型的特异性引物对样品进行单重PCR并进行测序,其中NoV GII的引物有三对.用EV的通用引物做巢式PCR并测序确定其准确血清型[19].10份不明原因腹泻临床样品中,1份检出SaV GII,1份检出HAstV 4,1份检出CV B3,1份检出ECHO 30,4份检出NoV GII.其中1份为NoV GII,SaV GII和HAstV 4混合感染,5份为单一感染,4份为病毒检测阴性,见表2.000.讨论本研究中RPM的检测结果与单一引物单一模板的测序的结果完全一致,说明腹泻症候群RPM具有较好的特异性和灵敏度.方法的建立参考并沿用了本实验室已有的几种技术优势.①新型再测序芯片检测方法在PCR过程中采用了TSP技术,通过调节不同反应阶段退火温度,使通用引物和嵌合引物分别发挥作用,降低了了不同引物扩增效率不一致造成的扩增偏向性.本实验室已经成功的将这种策略应用于呼吸道症候群[20],腹泻症候群[6],手足口病[21]病原体检测方法的建立并取得了很好的效果.②将10份样品合并成2份进行芯片检测,再用普通PCR加测序单独检测每一份样品,比每一份样品都用芯片检测的成本降低了80%.再测序芯片提供的样品序列长度为200bp,单重PCR产物的序列长度普遍大于400bp,这使得BLAST比对的结果更加可靠.高通量是基因芯片一种强大的技术优势,这种优势在对不明原因腹泻样品的检测中得到了验证.在腹泻症候群RPM的引物体系中,共有三对引物(NoV2A,NoV2B 和NoV2C)是针对NoV GII基因组不同区域和位置设计的.多重PCR之后,产物还要进行片段化和杂交等过程,虽然芯片扫描结果为NoV GII,但是产物是由哪一对引物扩增而得到的就无从考证了.本次实验共检出4例NoV GII阳性样本,由表2中的单引物PCR的结果来看,引物A 在3例样本的扩增中均发挥了作用,1例样本是由引物B扩增得到的结果,引物C与引物A在1例样本中同时发挥了作用.在PCR反应过程中,由于引物设计不合理,反应条件不合理,基因组变异,都可能造成引物不工作而得到假阴性结果,甚至同一对引物针对不同地域的流行株都有扩增效率的差异.从本次实验的结果来看,单独采用某一对NoVGII的引物对样本进行筛查都会出现假阴性结果,相应的样本也会被鉴定为不明原因腹泻样本.而RPM具有高通量的优势,使得多对引物,多对探针同时检测同一种病原体甚至同一个基因位点得以实现,扩大了检测范围并减小了漏检的概率.本研究对EV的检测结果进行了分析并对检测流程做了优化.在对腹泻症候群RPM的特异性进行评估时,EV 71和CV A16的阳性样品虽然都能正确的被鉴定为EV,但不同型别之间会出现非特异性的杂交,说明该方法对于EV的鉴定只能精确到属,而不能准确的区分EV的型别和亚型.造成这种结果的原因在于探针和引物的设计,EV的5-UTR区序列是EV基因组中相对保守的区域,腹泻症候群RPM中EV的探针和引物全部针对该区域设计而成,可扩增EV核酸,准确的检测出样品中是否含有EV.但由于5-UTR区核苷酸序列和血清型之间无显著相关性,因此不适合EV的分型诊断.这种针对保守区域设计引物和探针的优点是检测范围广泛,不容易造成目的病原体的漏检,缺点是不能提供更详尽的分型信息.Ji n L Q[22]等建立了一种针对肠道细菌的基因芯片方法,以细菌的16SrRNA作为靶基因,对于同在肠杆菌科的沙门菌属,志贺菌属和埃希菌属难以准确鉴别,这与本研究中EV的情况相类似.根据RPM中对于EV阳性的提示信息,本研究采用了巢式PCR和测序的方法对样品进行了符合,分别检测到一份CV B3和一份ECHO 30阳性样本.这使得临床样本的检测结果更加详尽.美国Tessarae公司推荐的基因芯片阳性判定阈值为20,当某种病原体的C3信号值大于20时即判定为该病原检测阳性[23].为避免非特异性杂交引起的假阳性,Shen[14]等在建立呼吸道症候群RPM方法时,将阳性的判定阈值提高至45(即C3信号值大于45判定为阳性),通过比较再测序芯片和PLEX-ID的检测结果,没有出现假阴性.本次实验在评估各个病原体特异性的同时,通过对参考品RNA和参考品DNA浓度的调整,用不同浓度梯度的参考品摸索了较为合理的阳性判定阈值.结果表明腹泻症候群RPM方法可以将阳性判定阈值调整为60.笔者认为不同的RPM方法之所以需要对应不同的阈值,与样本类型有关.呼吸道症候群RPM检测的原始样本为口腔拭子,而腹泻症候群RPM的原始样本为粪便,虽然采取同样的总核酸提取方法,但粪便样本的成分更加复杂,含有大量的细菌基因组DNA.基因芯片是一种灵敏度很高的检测方法,在核酸的成分更加复杂的情况下,粪便样本会比咽试子样本产生更多的非特异杂交,继而造成背景信号更强,这说明根据不同RPM的情况,适当的调整阳性判定阈值是必要的.本研究建立了一种基于RPM的检测方法,不仅对其特异性和灵敏度进行了验证,还优化了实验流程.在对10份不明原因腹泻样品的检测中,有4份样品结果依然为阴性,这有可能是细菌或者寄生虫感染所造成的,受来源样本限制(不明原因样品为病毒核酸),本次试验未对这些病原体进行筛查.由于婴幼儿胃肠功能较弱,常常因喂养不当,食物过敏,气候变化等造成非感染性腹泻[24],这也是可能导致阴性结果的一种原因.新方法在其余6份样本中都检测到了致泻病毒,充分体现了该方法高通量,高灵敏度的技术优势,证明RPM适用于传染病疫情中不明原因腹泻样品的检测工作.有了这种技术储备,当不明原因性传染病突发疫情出现时,实验室就可以在很短的时间内发现和明确病原体,为控制疫情赢得宝贵的时间.参考文献:[1]van Maarseveen N M,Wessels E,de Brouwer C S,etal.Diagnosis of viral gastroenteritis by simultaneous de-tection of Adenovirus group F,Astrovirus,Rotavirusgroup A,Norovirus genogroups I and II,and Sapovirusin two internally controlled multiplex real-time PCR as-131 2期王佶等:一种基于新型再测序芯片的不明原因腹泻样品检测方法的建立和初步应用says[J].J Clin Virol,2010,49(3):205-210.[2]Liu H-X,Zhang J Analysis of reported infectious diar-rhea(other than cholera,dysentery,typhoid and para-typhoid)in China in 2011[J].Zhonghua Yu Fang YiXue Za Zhi,2013,47(4):328-332.[3]Vernacchio L,Vezina R M,Mitchell A A,et al.Diar-rhea in American infants and young children in the com-munity setting:incidence,clinical presentation and mi-crobiology[J].The Pediatric Infectious Disease Journal,2006,25(1):2-7.[4]徐建国.发现新病原、建立新病原学的技术与理论体系[J].微生物与感染,2010,05(3):129-134.[5]Khamrin P,Okame M,Thongprachum A,et al.A sin-gle-tube multiplex PCR for rapid detection in feces of 10viruses causing diarrhea[J].J Virol Methods,2011,173(2):390-393.[6]Liu Y,Xu Z Q,Zhang Q,et al.Simultaneous detectionof seven enteric viruses associated with acute gastroen-teritis by a multiplexedLuminex-based assay[J].J ClinMicrobiol,2012,50(7):2384-2389.[7]Nordstrom J L,Vickery M C,Blackstone G M,et al.Development ofa multiplex real-time PCR assay with aninternal amplification control for the detection of totaland pathogenic Vibrio parahaemolyticus bacteria in oys-ters[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(18):5840-5847.。

甘肃省武威市腹泻症候群病例监测分析

与其他年龄组相比差异有统计学意义（Ｚ２＝２６．０３，Ｐ＜０．０５）；２ —７月、１０ —１２月为病原阳性检出较高的月份。结论
２０１２－２０１４年甘肃省武威市腹泻症候群病例监测的主要病原体为沙门氏菌和Ａ组轮状病毒，婴幼儿是高发人群，扩大
１．１病例定义
腹泻，每日排便３次或以上，且大便
性状有改变，呈稀便、水样便、粘液便或脓血便等的门
西敏公司）、培养基及试剂都在有效期内使用。１．４数据分析所有符合定义的纳人病例均由专人录入传染病监测技术平台信息管理系统，将数据从该系统导入Ｅｘｃｅｌ２００３，并在Ｓｐｓｓ１７．０统计软件中进行分析，率和构成比用卡方检验，以Ｐ＜０．０５为差异有统
病毒学检测。所有检出阳性菌株均送往甘肃省疾病
在我国，感染性腹泻发病率多年居传染病前列，仍是严重危害人类健康的常见病、多发病。为了解
１．３实验方法及试剂实验方法按照 “ 十二五 ” 国家
科技重大专项传染病监测技术平台项目《腹泻症候群
计学意义
２结果
诊或急诊病例。１．２资料来源在武威市凉州区人民医院和永昌镇
中心卫生院两所哨点医院，对２０１２－２０１４年符合监测

紧急群体腹泻筛查应急预案

一、总则1.1 编制目的为提高本地区应对群体腹泻事件的应急处理能力，确保及时、有效地开展腹泻病例的筛查、诊断和治疗，降低腹泻疫情对人民群众健康和生命安全的危害，特制定本预案。

1.2 编制依据依据《中华人民共和国传染病防治法》、《突发公共卫生事件应急条例》及相关法律法规，结合本地区实际情况，制定本预案。

1.3 适用范围本预案适用于本地区发生的群体腹泻事件的应急处理工作。

二、组织体系与职责2.1 应急指挥部成立应急指挥部，负责应急工作的组织、协调和指挥。

2.1.1 指挥部组成指挥部由政府相关部门负责人、医疗卫生专家、疾控中心、医疗机构等组成。

2.1.2 指挥部职责（1）组织协调各部门开展应急工作；（2）制定应急工作方案和措施；（3）指导、监督应急工作的实施；（4）及时向上级部门报告疫情和应急工作情况。

2.2 应急工作组设立以下工作组，负责应急工作的具体实施。

2.2.1 疾控工作组负责病例的流行病学调查、病原学检测、疫情报告等工作。

2.2.2 医疗救治工作组负责病例的诊断、治疗、转诊等工作。

2.2.3 物资保障工作组负责应急物资的采购、调配、供应等工作。

2.2.4 保障协调工作组负责应急工作的后勤保障、信息报送、宣传报道等工作。

2.2.5 社会稳定工作组负责维护社会稳定，做好舆情监控和应对工作。

三、预警与信息报告3.1 预警（1）对腹泻病例进行监测，发现异常情况时，及时启动预警机制；（2）密切关注周边地区腹泻疫情动态，做好风险评估和预警。

3.2 信息报告（1）医疗机构发现腹泻病例时，立即向疾控中心报告；（2）疾控中心接到报告后，立即进行调查核实，并按程序报告；（3）应急指挥部接到报告后，及时启动应急预案。

四、应急处置4.1 早期处置（1）医疗机构对腹泻病例进行初步诊断，必要时进行病原学检测；（2）疾控中心对病例进行流行病学调查，查找疫情来源；（3）应急指挥部组织专家会诊，制定治疗方案。

4.2 中期处置（1）加强病例监测，对疑似病例进行隔离观察；（2）开展病原学检测，确定病原体；（3）对密切接触者进行医学观察；（4）开展健康教育，提高公众防护意识。

2023学校全员粪便检测工作预案

2023学校全员粪便检测工作预案目标：该工作预案的目标是实施全员粪便检测，以确保学校的健康与环境卫生。

通过提前做好准备工作和合理的组织安排，确保检测工作的高效进行。

任务：1. 制定检测计划：根据学校规模和资源情况，制定全员粪便检测的时间表和检测流程，确保每位学生、教职员工都能按时参与检测，并确保检测的全面性和准确性。

2. 确保隐私保护：在检测过程中，严格遵守隐私保护原则，采取措施保障被检测者的个人信息安全和隐私权。

3. 保障检测质量：严格执行检测标准和操作规程，确保检测结果的准确性和可靠性。

同时，采取必要的质量控制措施，防止误差和偏差的发生。

4. 信息管理与通报：建立合理的信息管理系统，确保检测结果的及时记录和保存。

同时，对有异常情况的检测结果进行及时通报，并采取相应措施进行处理和隔离。

责任分工：1. 校领导：负责决策、协调和监督全员粪便检测工作的实施，对检测结果负总责。

2. 校医院：负责制定检测计划、组织检测工作，提供相关技术指导和支持。

3. 学生与教职员工：配合参与全员粪便检测工作，并按照要求提供所需信息和样本。

4. 相关部门：协助校医院完成检测工作，提供必要的设备、场地和人员支持。

风险控制：1. 隐私泄露风险：加强对个人信息的保护，严禁将个人信息用于其他用途或泄露给未授权的人员。

2. 检测结果不准确风险：严格执行检测标准和质控措施，确保检测结果的准确性和可靠性。

3. 个人拒绝参与风险：通过加强宣传和教育，提高学生和教职员工的参与意识，减少个人拒绝参与的风险。

沟通与教育：1. 沟通与宣传：通过校内通告、校园广播等方式，向全校师生宣传和解释全员粪便检测工作的目的、意义和重要性。

2. 教育与培训：组织相关培训，提高检测操作人员的技术水平和质量意识，确保检测工作的准确性和可靠性。

以上是2023学校全员粪便检测工作预案的主要内容，通过做好准备工作、合理组织安排和严格控制风险，预计能够顺利实施全员粪便检测工作，保障学校的健康与环境卫生。

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内部资料“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项传染病监测技术平台项目腹泻症候群监测技术方案专项实施管理办公室二〇〇九年七月编写组责任人：阚飆编写组核心成员：段招军夏胜利目录I．流行病学设计 (1)一、监测目的 (1)二、监测网络的设置 (1)三、监测病例定义 (2)四、监测内容与方法 (2)五、数据收集、分析和反馈 (3)II．标本的采集、运输及保存 (4)一、标本的采集 (4)二、标本的保存与运送 (4)III．病毒检测内容及流程 (6)一、标本检测流程图 (6)二、标本的处理 (7)三、检测方法 (7)四、注意事项 (7)IV．细菌检测内容及流程 (9)一、标本检测流程图 (9)二、标本的处理 (9)三、检测程序 (9)四、注意事项 (13)V．寄生虫检测内容及流程 (14)一、标本检测流程图 (14)二、标本的处理 (14)三、检测方法 (15)VI．质量控制 (16)一、项目启动之前的质量控制要求 (16)二、病原谱调查质量控制要求 (18)三、病毒检测标本的处理和检测 (20)四、病原谱调查评价指标 (21)VII．信息管理方案 (25)一、原始表格的管理 (25)二、数据库的建立和管理 (25)三、标本检测结果的反馈 (27)VIII．附件 (31)附件一省医院腹泻病例个案登记表 (31)附件二腹泻病毒抗原和核酸检测SOP (33)附件三腹泻病原细菌检测标准程序 (41)附件四腹泻寄生虫检测操作程序 (73)I．流行病学设计一、监测目的（一）建立腹泻症候群病原谱监测网络和监测检测技术，获得我国监测地区的腹泻病原谱构成；（二）通过对腹泻症候群分离病原体的鉴定、分子分型、基因变异等特征分析，探讨主要病原体的变异和流行变迁规律；（三）提高监测实验室腹泻病实验室诊断、监测预警、突发腹泻疫情的处置能力。

二、监测网络的设置（一）监测实验室的设置和任务腹泻症候群监测共包括12个监测网络实验室（见表1）。

每个监测实验室设置哨点医院。

哨点医院负责标本采集和相关信息的收集；监测实验室负责标本的检测等实验室工作以及信息的汇总和录入，负责对哨点医院的技术培训、管理和督导。

表1：各实验室每年承担的腹泻症候群标本监测任务量实验室名称监测标本数病毒细菌及其它中国CDC总计2300 病毒所传染病所800 寄生虫病所1500中国CDC传染病所2000中国CDC病毒病所1500医科院病原所军科院微生物所2000解放军CDC 3500武汉大学2500 500甘肃CDC 1000辽宁CDC 1000 1000云南CDC 1500 1500浙江大学2000 2000上海公共卫生临床中心1750 1750中山大学1500 1000（二）监测哨点医院的设置要求监测哨点医院需包括覆盖城市人口的医院（含社区医院）和农村人口的医院（卫生院），并至少包括一个儿童医院，保证来自覆盖城市人群和农村人群的监测标本量各占约50%。

根据监测实验室覆盖省的腹泻病既往流行病学三间分布特征以及医疗机构工作情况，选择哨点医院，数量由各监测实验室根据工作量和流行病学原则确定。

要求哨点医院有腹泻病监测的基础，能积极按方案和技术手册的要求完成腹泻病人就诊信息的收集和标本采集工作。

监测科室应包括内科、儿科和感染科的门诊、急诊和肠道门诊。

三、监测病例定义每日排便3次或以上、且大便性状有改变（呈稀便、水样便、粘脓便或脓血便等）的门诊病例。

四、监测内容与方法（一）监测对象：符合病例定义的各年龄组门诊病例。

（二）监测时间：2009年6月-2010年12月。

（三）监测的病原体种类：见表2。

表2. 腹泻症候群监测病原种类（四）监测任务根据每个监测实验室的工作任务确定监测标本量，每个监测实验室监测标本量不少于1500份（表1）。

采集标本的时间需覆盖全年各月，每周采集标本,每个月检测标本数均不能低于设计的标本总数量的5%。

（五）监测流程哨点医院监测科室的医生或护士在门诊或急诊发现符合监测病例定义的患者时，按照方案要求收集病例的基本信息、临床症状等（填写附件一病例信息个案调查表），并采集粪便标本；标本运送至监测实验室进行相关的细菌学、病毒学以及寄生虫检测；最后进行结果的分析以及整合。

监测流程图五、数据收集、分析和反馈（一）基本信息收集和报告监测工作中规定的各类报表均以电子文件形式上报。

（二）统计分析内容和指标1. 腹泻病人粪便中各类病原检出率。

2. 腹泻病人的年龄分布、性别分布、季节和月分布、地区分布等。

3. 监测病原的毒力、基因分型和血清分型。

（三）数据和信息反馈监测实验室每6个月将统计分析后的信息反馈给哨点医院。

II．标本的采集、运输及保存一、标本的采集（一）标本采集原则1. 优先采集就诊时未使用过抗生素的病例标本。

2. 填写病人信息个案登记表。

3. 按照规范（见本节“（二）标本的采集”）采集和分装处理标本。

4. 应尽快送至监测点实验室进行检测，如不能立即送检的，按照规范以适当方式保存（参见本节“二、标本的保存与运送”）。

5. 注意生物安全防护，防止污染、传播和自身感染。

6. 标本应按方案要求进行标记。

（二）标本的采集本方案所采集的标本仅限于粪便。

粪便的采集应由受过专门培训的人员来施行。

标本采集人员由各监测实验室结合实际自行决定，采集粪便应使用无菌容器（如痰盂内套无菌塑料袋）。

1. 用于病毒检测的标本采集：采集粪便5克（5毫升），置于无菌粪便采样杯（不加任何试剂）。

2. 用于寄生虫检测的标本采集：采集粪便5克（5毫升），置于无菌粪便采样杯（不加任何试剂）。

3. 用于细菌检测的标本采集：用5支无菌棉拭多点采集粪便标本（如有脓血或黏液应挑取脓血、黏液部分，液体粪便应取絮状物，使棉拭表面布满粪便），插入1支C-B运输培养基（50ml具旋盖密封的离心管）。

二、标本的保存与运送（一）标本的保存1. 用于病毒检测的粪便标本：标本采集后30分钟内立即将标本放置在-20℃冰箱中，如有特殊情况未能及时放入-20℃的冰箱，标本可在4℃短期储存，不能超过2天，保存期内避免标本发生反复冻融。

2. 用于寄生虫检测的粪便标本：参照用于病毒检测的标本保存方法。

3. 用于细菌检测的粪便标本：如不能立即送检，标本需保存于4℃冰箱或冷藏包，但不应超过24小时。

（二）标本的验收监测点实验室在接收标本后应对标本进行验收，标本合格接收。

如标本不合格，不接收。

合格标本：按方案要求采集、运送、保存的标本为合格标本。

不合格标本：没有按照要求采集（棉签数量不足、表面粪便很少、没有使用运输培养基等）、保存（未按照要求保存）。

（三）标本的运输1、将标本置于冷藏包（配备冰排），由标本运输人员运输至监测点实验室。

2、防止容器破碎、洒漏、颠倒，注意生物安全防护。

III．病毒检测内容及流程一、标本检测流程图二、标本的处理制备10％的便悬液：取0.2g（黄豆粒大小）或200ul粪便标本加到1.5mlEP 管中，加入标本处理液（PBS液或生理盐水），震荡3次，每次10秒。

然后静置10分钟，再以8千转/分钟离心5分钟，吸取上清进行下一步试验（包括抗原检测和核酸检测）或-20℃短期保存（不超过3个月）。

所有粪便标本和便悬液的处理在二级生物安全柜中进行，生物安全柜使用前应提前运转10-20分钟。

确保离心管上的标号与原始标本上的标号一致。

三、检测方法A组轮状病毒采用ELISA方法进行抗原检测，所有轮状病毒阳性的要进行G、P分型。

其他病毒均采用PCR或RT-PCR进行核酸检测，其中B组轮状病毒、C组轮状病毒、肠道腺病毒和星状病毒RT-PCR或PCR鉴定阳性的要进行序列确认和分型。

1、抗原的检测参见“附件二、腹泻病毒抗原和核酸检测标准程序”。

2、核酸的提取：取200-400µl处理好的粪便标本上清液，用于核酸的提取。

核酸提取后适当分装，至少在-70℃冰箱内保存1份备份核酸，便于后续研究和抽样检测。

核酸提取的方法使用公认的Geneaid /QIAGEN商品化核酸提取试剂盒。

3、核酸的检测：模板的制备：RNA病毒的检测需要将提取的RNA逆转录为cDNA，可用逆转录试剂盒或者一步法RT-PCR试剂盒。

DNA病毒直接PCR检测。

试剂及试剂盒的选择原则：可选包括Invitrogen、Roche、Qiagen、Promega、TaKaRa等公司提供的DNA聚合酶、逆转录酶等RT-PCR试剂(盒)；具体技术流程见“附件二、腹泻病毒抗原和核酸检测标准测序”。

4、质量控制：每一次实验中，抗原检测、核酸提取和检测过程必须设立阴性、阳性对照。

四、注意事项1、试验仪器PCR仪和紫外凝胶成像系统（紫外分析仪或手提紫外等）以及移液器都可能影响PCR检测的质量。

仪器的质量控制应该通过实验室质量认证来实施，定期进行仪器的校验。

没有质量认证的实验室可以定期请仪器生产厂家进行校验和保养，确保所有仪器处于正常的工作状态。

2、试验试剂与耗材试剂一定选择质量和信誉好的厂商，见推荐产品，一旦选定后不要轻易改换。

如果必须改换时应与原产品进行严格比对试验，包括敏感性、特异性、试剂保存期等试验。

并且要注意不同批次产品质量的差异。

在PCR检测中，最好全部使用试剂盒提供的试剂，对PCR检测质量控制有益。

在每次PCR检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。

阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA提取（RNA提取、RNA反转录）、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。

在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。

3、人员操作PCR检测试验需要熟悉和训练，不同的人员对检测结果有一定的影响。

加强人员的操作技能的训练是必须的，需要实验技术人员对PCR检测有一个熟练的过程。

4、场地选择、卫生消毒PCR污染控制是PCR检测操作人员必须非常注意的一项重要内容。

实验室设置上要分：配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。

物流应分：配液区、模板提取区、扩增区、电泳区顺序，严禁倒流。

人员操作也应非常注意，比如：及时、定期的（仪器和工作区）卫生消毒；移液器的定期清洗和消毒；操作时枪头要避免触及离心柱的滤过膜；试验要及时，操作要快速、准确等。

此外，EB可能致癌，要划定专门的EB污染区。

IV．细菌检测内容及流程一、标本检测流程图（见下页）二、标本的处理腹泻症候群细菌检测涉及到的为粪便拭子标本。

1．直接分离培养弯曲菌、志贺菌、致泻性大肠埃希菌的分离需要直接分离培养。

一般在患者使用抗生素之前采集，粪便标本需新鲜。

采集的标本立即（或接收的由C-B运输培养基转运的拭子）划线接种选择性平板进行培养。

2．增菌培养沾满粪便的棉拭子插入（或接收由C-B运输培养基转运的粪便拭子）9ml增菌液中（在生物安全柜内操作，将拭子沾有样品的一端浸入液面下反复震荡几次，旋转挤去多余液体后取出绵拭子），进行增菌培养。