小GTP结合蛋白rab3B和rab3C在牛嗜铬性细胞中生理功能的研(精)
Rab蛋白在黑素小体合成及转运中的作用
Rab蛋白在黑素小体合成及转运中的作用王敏;宋秀祖【摘要】Rab蛋白家族是小G蛋白超家族中最大的亚家族,广泛存在于动物、植物和微生物等真核生物中,是囊泡运输重要的调节因子,具有调节囊泡的靶向运输、囊泡的拴系、与靶膜泊位与融合、囊泡的芽生等作用.皮肤的颜色与黑素小体的合成和转运密切相关.哺乳动物的Rab蛋白大约有60种,其中的Rab32/38和Rab9a 在黑素小体的合成过程中发挥了重要作用;Rab27a、Rab21、Rab17及Rab36在黑素小体的转运过程中具有重要意义;Rab7及Rab11即参与了黑素小体的合成,又参与了黑素小体转入角质形成细胞的过程.因此,这些Rab蛋白基因的突变将会引发相应的遗传性色素性疾病.【期刊名称】《中国中西医结合皮肤性病学杂志》【年(卷),期】2017(016)005【总页数】3页(P469-471)【关键词】黑素小体;Rab蛋白;囊泡运输;效应蛋白;皮肤病【作者】王敏;宋秀祖【作者单位】安徽医科大学附属杭州临床学院,杭州310009;浙江省杭州市第三人民医院,杭州310009【正文语种】中文【中图分类】R758.4真核细胞生物学功能的维持依赖于蛋白的精确定位与表达，蛋白在细胞内的运输有赖于囊泡运输来完成。
Rab蛋白是囊泡运输的重要调节因子，在真核细胞的膜运输中发挥重要作用[1]。
皮肤色素沉着的过程依赖于黑素小体在黑素细胞内的合成，并进一步转运到角质形成细胞中。
目前研究证实:Rab蛋白在黑素小体的合成及转运过程中发挥了重要作用。
以下对参与黑素小体合成及转运过程的Rab蛋白进行综述。
Rab蛋白是小G蛋白家族中最大的蛋白家族，广泛存在于动物、植物和微生物等真核生物中。
Rab蛋白通过与GDP或GTP结合的转换，在非活性与活性形式之间进行循环。
在鸟苷酸交换因子（Guanine nucleotide exchange factor，GEF）的作用下，Rab 可由GDP结合转换为GTP结合的活性形式；在GTPase激活蛋白（GTPase activating protein，GAP）的作用下，Rab又可由GTP结合转换为无活性的GDP结合形式，从而调控细胞内吞或分泌过程中囊泡的识别、转运、锚定及与质膜融合等过程，发挥分子开关的作用。
《不同小分子抑制剂对牛类胚胎干细胞多能性维持的作用研究》范文
《不同小分子抑制剂对牛类胚胎干细胞多能性维持的作用研究》篇一一、引言胚胎干细胞（ESC）因其具有自我更新和多能性，在再生医学和生物科学研究领域具有广泛的应用前景。
然而，如何有效维持胚胎干细胞的多能性以及避免其异常分化一直是该领域的研究重点。
近年来，小分子抑制剂在胚胎干细胞培养及多能性维持方面显示出潜在的应用价值。
本研究以牛类胚胎干细胞为研究对象，探讨不同小分子抑制剂对其多能性维持的作用。
二、材料与方法1. 实验材料本实验所使用的牛类胚胎干细胞购自某生物科技公司，小分子抑制剂包括PD0325901、AZD2460、BIO等，均来自Sigma-Aldrich公司。
2. 实验方法（1）将牛类胚胎干细胞分别在含不同浓度（0、1、5、10μM）的小分子抑制剂培养基中培养；（2）通过实时荧光定量PCR技术检测细胞内相关基因的表达情况；（3）通过流式细胞术检测细胞表面标记物的变化，以判断细胞的分化情况；（4）通过克隆形成实验和细胞周期分析等方法，评估小分子抑制剂对细胞多能性的影响。
三、实验结果1. 小分子抑制剂对牛类胚胎干细胞基因表达的影响实验结果显示，在PD0325901和AZD2460的作用下，牛类胚胎干细胞中多能性相关基因（如OCT4、SOX2等）的表达水平显著提高。
而BIO抑制剂则对基因表达的影响较小。
2. 小分子抑制剂对牛类胚胎干细胞分化的影响流式细胞术检测结果显示，PD0325901和AZD2460能够显著降低牛类胚胎干细胞的分化比例，而BIO对细胞分化的影响不明显。
3. 小分子抑制剂对牛类胚胎干细胞多能性的影响克隆形成实验和细胞周期分析表明，PD0325901和AZD2460能够有效促进牛类胚胎干细胞的增殖和自我更新能力，维持其多能性。
而BIO的作用则相对较弱。
四、讨论本研究结果表明，不同小分子抑制剂对牛类胚胎干细胞多能性的维持具有不同的作用。
PD0325901和AZD2460能够显著提高多能性相关基因的表达水平，降低细胞分化比例，促进细胞的增殖和自我更新能力。
《不同小分子抑制剂对牛类胚胎干细胞多能性维持的作用研究》范文
《不同小分子抑制剂对牛类胚胎干细胞多能性维持的作用研究》篇一一、引言胚胎干细胞（ESC）因其具有自我更新和多能性，在生物医学研究领域具有广泛的应用前景。
牛类胚胎干细胞作为重要的研究模型，在农业、生物医学以及再生医学等多个领域中均发挥着重要作用。
然而，维持其多能性并确保其稳定传代一直是研究的重点和难点。
近年来，小分子抑制剂在维持胚胎干细胞多能性方面的应用逐渐受到关注。
本文旨在研究不同小分子抑制剂对牛类胚胎干细胞多能性维持的作用。
二、材料与方法1. 材料实验所使用的牛类胚胎干细胞来自本实验室的胚胎干细胞系。
不同的小分子抑制剂，如DKA（多功能抑制因子）、LDN（双酚单核糖甙抑制剂）等购自相关试剂供应商。
2. 方法（1）建立牛类胚胎干细胞培养体系，并分别添加不同浓度梯度的小分子抑制剂；（2）通过细胞增殖实验、细胞周期分析、多能性相关基因表达分析等方法，评估不同小分子抑制剂对牛类胚胎干细胞多能性的影响；（3）通过克隆形成实验、免疫荧光染色等手段，观察细胞形态和分化潜能的变化；（4）采用统计学方法对实验数据进行处理和分析。
三、实验结果1. 细胞增殖实验结果显示，在适宜浓度下，不同小分子抑制剂对牛类胚胎干细胞的增殖具有促进作用；其中，DKA在低浓度下效果最佳，而LDN在高浓度下效果更明显。
2. 细胞周期分析表明，不同小分子抑制剂能够显著改变牛类胚胎干细胞的细胞周期分布，其中部分抑制剂能够使细胞停留在G1期或S期，从而提高细胞的多能性。
3. 多能性相关基因表达分析显示，不同小分子抑制剂能够显著上调或下调多能性相关基因的表达水平，从而影响细胞的多能性。
其中，DKA能够显著上调OCT4、SOX2等基因的表达水平，而LDN则能够显著下调这些基因的表达水平。
4. 细胞形态和分化潜能的观察结果表明，不同小分子抑制剂对牛类胚胎干细胞的形态和分化潜能具有显著影响。
其中，某些抑制剂能够促进细胞形成更紧密的克隆结构，提高细胞的分化潜能；而其他抑制剂则可能对细胞的形态和分化潜能产生负面影响。
翟中和细胞生物学第4版考研真题题库
翟中和细胞生物学第4版考研真题题库翟中和细胞生物学第4版考研真题题库 1下述有关细胞质膜结构模型的说法错误的是（）A.光学显微镜发现细胞后，人们并未同时观察到细胞质膜，直到电镜下显示出质膜的超微结构，人们才证明了质膜的存在B.用有机溶剂抽提人红细胞质膜的膜脂成分，并测定膜脂单层分子在水面的铺展面积，发现它为红细胞表面积的两倍，提示质膜是由双层分子组成C.三明治模型和单位膜模型得到了X射线衍射分析与电镜观察结果的支持D.细胞膜结构模型都有相关的实验证据支持，但都不够完善、充实，【答案】A【解析】20世纪初，对细胞内渗透压的研究已经证明质膜的存在。
2膜脂最基本的热运动方式是（）A.沿膜平面的侧向运动B.脂分子围绕轴心的自旋运动C.脂分子尾部的摆动D.双层脂分子之间的翻转运动【答案】A【解析】膜脂最基本的热运动方式是沿膜平面的侧向运动，这种方式的运动是完成多种生理功能所必需的，因此具有重要的生物学意义。
3某跨膜蛋白的氨基酸序列已被测定，发现它除具有N-端信号肽之外，还存在14个疏水性肽段，其中7段各含25个氢基酸残基，3段各含16个氨基酸残基，4段各含10个氨基酸残基。
经过上述分析可知，此肽链最有可能形（）个α螺旋。
A.14个B.11个C.10个D.7个【答案】D【解析】a螺旋跨膜结构域含有20~30个氨基酸残基。
只有7段含有25个氨基酸残基，因此这7段每段都可能形成1个a螺旋。
其他7段不可能形成。
4有关膜蛋白的流动性，下列哪项说法错误的是（）A.用药物抑制细胞能量的转换，膜蛋白的扩散速率下降B.降低温度，膜蛋白的扩散速率显著下降C.膜蛋白在脂双层二维溶液中的运动是自发的热运动D.用阻断微丝形成的药物细胞松弛素B处理细胞后，膜蛋白的流动性大大增加【答案】A【解析】膜蛋白的运动是自发的热运动，不需细胞代谢产物的参加，也不需要提供能量。
用药物抑制细胞的能量转换，对膜蛋的运动没有影响。
5有关膜的不对称性，下列说法错误的是（A.无论是膜内在蛋白还是膜外在蛋白，在质膜上都呈不对称分布B.膜蛋白的不对称性是指每种膜蛋白分子在细胞膜上都具有明确的方向性C.膜蛋白和糖类在细胞内外层是不对称分布的，但膜脂是对称分布的D.膜蛋白的不对称性是生物膜完成复杂的各种生理功能的保证【答案】C【解析】膜脂分子呈不对称分布，膜脂的不对称性是指同一种膜脂分子在膜的脂双层中呈不均匀分布。
某理工大学生物工程学院《细胞生物学》考试试卷(483)
某理工大学生物工程学院《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（15分，每题5分）1. 通过选择性剪接产生的一套蛋白质，它们的结构、功能完全不相同。
（）答案：错误解析：一般情况下通过选择性剪接所导致的外显子改变并不产生根本不同的蛋白质，而是一套结构相关人员、功能相似的蛋白质异形体。
2. 通过重组DNA技术使表达的溶酶体蛋白C端加上KDEL序列，那么重组蛋白将从高尔基体返回内质网，不能进入溶酶体。
（）答案：正确解析：KDEL为回收信号序列，C端含有该序列的多肽将通过COPⅠ有被小泡运回内质网。
3. 早期胚胎细胞的细胞周期短，随着卵裂球数量增加，其总体积也随着增加。
（）答案：错误解析：卵细胞在成熟过程中已积累了大量的物质基础，既定满足早期需要有胚胎发育的物质需要，子细胞在G1、G2期并不生长，越分裂体积越小，但圣索弗朗代兰县体积并不增加。
2、名词解释（20分，每题5分）1. respiratory chain答案：respiratory chain的中文名称是排泄链：又称电子传递链，由一系列能可逆接受质子和释放电子或质子的化学物质组成，它们在线粒体内膜上形成的有序排列，以进行电子传递、H＋的传递和氯的利用。
解析：空2. 光脱色荧光恢复技术（fluorescence recovery after photobleaching）答案：光脱色荧光恢复技术（fluorescence recovery after photobleaching）是糖蛋白指将荧光素标记膜蛋白或膜脂，然后用激光束照射光照细胞表面某一区域，使被照射区的荧光逐渐急剧变暗，停止照射后，由于膜的流动性，变暗区域的亮度逐渐提高，最后恢复，根据荧光恢复的音速可推算出膜蛋白或膜脂的扩散速率的一种技术。
小g蛋白名词解释
小g蛋白名词解释小G蛋白是一种嵌合蛋白，通常由小G结构域和其他结构域组成。
它是一种重要的细胞信号调控分子，在细胞内起着多种生理功能。
小G蛋白是一类低分子量的鸟苷酸结合蛋白。
它通过鸟苷酸的结合和释放完成其功能。
小G蛋白通过激活或抑制一系列靶标分子，从而调节细胞的生理过程，如细胞分裂、细胞凋亡、细胞迁移和细胞粘附等。
小G蛋白的活性状态通常分为两种：活化态（GTP结合态）和非活化态（GDP结合态）。
在非活化态下，小G蛋白与GDP结合形成一个稳定的复合物。
当外界的信号（如激素或生长因子）与细胞膜上的受体结合时，会激活细胞内的GTP 酶，将小G蛋白上的GDP转化为GTP，使其由非活化态变为活化态。
活化态的小G蛋白具有一定的生物活性，可以与多个靶标分子结合并影响它们的活性。
一个典型的例子是Rho蛋白家族，它可以调节细胞骨架的重排和细胞迁移。
另外，Cdc42和Rac等小G蛋白也参与细胞形态的改变和胞吞作用的调控。
小G蛋白在细胞凋亡中也发挥着重要的作用。
Bcl-2家族蛋白是调控细胞凋亡的主要调节器，其中Bcl-2蛋白通过与Bax蛋白结合来抑制凋亡。
近年来的研究表明，小G蛋白Rap1能够与Bcl-2蛋白相互作用，抑制Bcl-2与Bax的结合，从而抑制细胞凋亡。
此外，小G蛋白还参与细胞周期的调控。
Cyclin依赖性激酶（CDK）是调控细胞周期的重要因子，而小G蛋白RhoA和CDC42是CDK活性的调节器。
当RhoA和CDC42活化时，它们能够促进CDK活性的抑制，限制细胞周期的进程。
总之，小G蛋白是一类重要的细胞信号调控蛋白，通过激活或抑制一系列靶标分子，调节细胞的生理过程。
它参与细胞分裂、细胞凋亡、细胞迁移、细胞适应等重要生命活动，并在多个疾病的发生和发展中发挥着重要作用。
名词解释g蛋白
名词解释g蛋白
嘿，你知道啥是 G 蛋白不？这 G 蛋白啊，就像是身体里的一个小
魔法师！它在细胞信号传导的过程中可起着超级重要的作用呢！比如说，你想想看，身体就像一个庞大的王国，细胞们就是这个王国里的
臣民，而 G 蛋白就是在臣民之间传递重要信息的使者。
G 蛋白全名叫鸟苷酸结合蛋白，它能结合鸟苷二磷酸（GDP）和鸟
苷三磷酸（GTP）。
这就好像它有两种不同的“魔法状态”一样。
当它结合 GDP 时，就像安静地休息着；可一旦它和 GTP 结合，哇哦，那就
像被激活了，开始忙碌地工作啦！
咱来打个比方吧，细胞就像是一个个小家庭，G 蛋白呢，就是在各
个家庭之间跑来跑去传递消息的人。
当有外界的信号来了，比如激素
啥的，就像有人在外面敲门，G 蛋白就赶紧去开门，然后把消息传递
到细胞里面，让细胞做出相应的反应。
这不就跟我们生活中有人来传
达重要事情一样嘛！
在身体里，G 蛋白参与了好多重要的生理过程呢。
比如调节心跳啊、控制血压啊，这些可都离不开它呢！它就像是一个默默工作的幕后英雄。
我再给你举个例子啊，就像一场盛大的音乐会，指挥家就是 G 蛋白，乐队成员就是细胞，指挥家通过指挥棒（就像 G 蛋白传递信号）让乐
队演奏出美妙的音乐（细胞做出反应）。
总之啊，G 蛋白虽然看不见摸不着，但它在我们身体里可起着至关重要的作用呢！它就像一个神奇的小开关，控制着身体的各种机能。
你说，它是不是超级厉害呀！
我的观点就是：G 蛋白是细胞信号传导中不可或缺的重要角色，对维持身体的正常生理功能有着极其关键的作用，我们应该好好了解它呀！。
牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用
畜牧兽医学报 2023,54(6):2436-2447A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.06.022开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):牦牛L C 3B 蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用焦正兴1,潘阳阳1,2,王 萌1,2,王靖雷1,马文斌1,高 翔1,张 晖1,崔 燕1,2,余四九1,2,王立斌1,2*(1.甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;2.甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070)摘 要:旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B (m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e d p r o t e i n 1l i gh t c h a i n 3B ,L C 3B )基因,制备牦牛L C 3B 多克隆抗体,为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础㊂本研究通过基因克隆方法获得牦牛L C 3B 基因序列,利用原核表达㊁亲和层析法纯化牦牛L C 3B 重组蛋白,使用纯化的蛋白为抗原免疫10月龄日本大耳白兔,S e p h a r o s e 4B 柱层析法纯化制备牦牛L C 3B 多克隆抗体,利用酶联免疫吸附试验(E L I S A )测定抗体效价,并使用蛋白质免疫印迹(W B )㊁免疫组织化学法(I H C )和免疫荧光技术(I F )检测牦牛生殖器官中L C 3B 蛋白的表达㊂结果显示,本研究成功克隆了牦牛L C 3B 基因(登录号:O P 572227),构建的重组质粒p E T -32a -L C 3B 能够诱导产生重组蛋白,并且在包涵体和上清中均有表达;所纯化的牦牛L C 3B 重组蛋白大小为34k u (含T r x 和H i s 标签),符合预期结果㊂通过免疫日本大耳兔后得到的兔抗牦牛L C 3B 蛋白血清,抗体效价分别为1ʒ640000和1ʒ320000,特异性良好,表明牦牛L C 3B 蛋白多克隆抗体制备成功㊂纯化后的抗体应用于牦牛生殖器官中L C 3B 的表达检测,L C 3B 在牦牛卵巢㊁输卵管和子宫中表达,并且能识别L C 3B -Ⅰ和发生脂化后的L C 3B -Ⅱ,主要表达于细胞质及细胞核周㊂本研究通过成功克隆牦牛L C 3B 基因制备了牦牛L C 3B 多克隆抗体,使用抗体检测发现L C 3B 蛋白在牦牛生殖器官中均有表达,表明所制备的多克隆抗体特异性良好,能够应用于牦牛L C 3B 蛋白的检测和细胞自噬水平的研究㊂关键词:牦牛;L C 3B ;原核表达;多克隆抗体;生殖中图分类号:S 823.85 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)06-2436-12收稿日期:2022-10-26基金项目:国家自然科学基金(32160850);甘肃省自然科学基金(22J R 5R A 864);甘肃省重点人才项目(2022-0623-R C C -0307)作者简介:焦正兴(1998-),男,甘肃永靖人,硕士生,主要从事动物生殖生理学研究,E -m a i l :1264847838@q q .c o m *通信作者:王立斌,主要从事动物生殖生理学和胚胎工程研究,E -m a i l :w a n gl b @g s a u .e d u .c n P r e p a r a t i o n o f P o l y c l o n a l A n t i b o d y a g a i n s t Y a k L C 3B P r o t e i n a n d I t s A p pl i c a t i o n i n D e t e c t i o n o f E x p r e s s i o n i n R e p r o d u c t i v e O r ga n s J I A O Z h e n g x i n g 1,P A N Y a n g y a n g 1,2,WA N G M e n g 1,2,WA N G J i n gl e i 1,MA W e n b i n 1,G A O X i a n g 1,Z H A N G H u i 1,C U I Y a n 1,2,Y U S i ji u 1,2,WA N G L i b i n 1,2*(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,G a n s u A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,L a n z h o u 730070,C h i n a ;2.T e c h n o l o g y a n d R e s e a r c h C e n t e r o f G a n s u P r o v i n c e f o r E m b r y o n i c E n g i n e e r i n g o fB o v i n e a n d S h e e p ,L a n z h o u 730070,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o c l o n e t h e m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e d p r o t e i n 1l i gh t c h a i n 3B (L C 3B )g e n e o f y a k a n d p r e p a r e t h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y o f y a k L C 3B ,s o a s t o l a y af o u n d a t i o n f o r e x p l o r i ng th e r o l e o f a u t o p h a g yi n t h e r e p r o d u c t i v e p h y s i o l o g y of y a k .T h e s e q u e n c e o f y a k L C 3Bg e n e w a s o b t a i n e d b y g e n e c l o n i n g .Th e r e c o m bi n a n t p r o t e i n o f ya k L C 3B6期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用w a s p u r i f i e d b y p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n a n d a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y.T h e p u r i f i e d p r o t e i n w a s 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d i n i n c l u s i o n b o d i e s a n d s u p e r n a t a n t.T h e s i z e o f p u r i f i e d y a k L C3B r e c o m b i n a n t p r o t e i n w a s34k u(c o n t a i n i n g T r x a n d H i s t a g s).T h e r a b b i t a n t i-y a k L C3B p r o t e i n s e r u m o b t a i n e d b y i mm u n i z i n g J a p a n e s e b i g-e a r w h i t e r a b b i t s h a d a n t i b o d y t i t e r s o f1ʒ640000a n d1ʒ320000,r e s p e c t i v e l y,w i t h g o o d s p e c i f i c i t y,w h i c h s h o w e d t h a t t h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y o f y a k L C3B p r o t e i n w a s s u c c e s s f u l l y p r e p a r e d.T h e p u r i f i e d a n t i b o d y w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n s o f L C3B i n t h e r e p r o d u c t i v e o r g a n s o f y a k s.I t s h o w e d t h a t L C3B w a s e x p r e s s e d i n t h e o v a r i e s,o v i d u c t s a n d u t e r u s o f t h e y a k,a n d r e c o g n i z e d L C3B-Ⅰa n d L C3B-Ⅱa f t e r l i p i d a t i o n,i t w a s l o c a t e d m a i n l y i n t h e c y t o p l a s m a n d p e r i n u c l e a r.I n c o n c l u s i o n,L C3B p o l y c l o n a l a n t i b o d y w a s p r e p a r e d s u c c e s s f u l l y b y c l o n i n g L C3B g e n e i n t h i s s t u d y,a n d t h e e x p r e s s i o n o f L C3B p r o t e i n w a s d e t e c t e d i n t h e r e p r o d u c t i v e o r g a n s.I t i s s t a t e d t h a t t h e a n t i b o d y p r e p a r e d h a s g o o d s p e c i f i c i t y a n d i t c a n b e a p p l i e d t o d e t e c t L C3B p r o t e i n i n y a k s a n d f u r t h e r s t u d y o n t h e l e v e l s o f a u t o p h a g y.K e y w o r d s:y a k;L C3B;p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n;p o l y c l o n a l a n t i b o d y;r e p r o d u c t i o n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:WA N G L i b i n,E-m a i l:w a n g l b@g s a u.e d u.c n自噬(a u t o p h a g y)是一种细胞内成分自我清除和自我更新的过程㊂根据底物识别和作用方式不同分为分子伴侣介导的自噬(c h a p e r o n e-m e d i a t e d a u t o p h a g y,C MA)㊁微自噬(m i c r o a u t o p h a g y)和巨自噬(m a c r o a u t o p h a g y)㊂自噬发生时,细胞内衰老或损伤的成分被具有双层膜结构的自噬体包裹,进而与溶酶体结合并降解,完成细胞内的自我清除和自我更新[1]㊂微管相关蛋白1轻链3(m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e d p r o t e i n1l i g h t c h a i n3,L C3)蛋白是自噬发生过程中表达的重要蛋白之一,在胞浆内以L C3-Ⅰ的形式存在,自噬发生时L C3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合形成L C3-Ⅱ并定位于自噬体膜上㊂当自噬体与溶酶体结合时,自噬体内膜上的L C3-Ⅱ蛋白被降解,外膜上的L C3-Ⅱ蛋白被切割修饰后变为L C3-Ⅰ蛋白[2]㊂L C3蛋白分为A㊁B㊁C三种亚型[3],其中L C3B在自噬过程中发挥双重作用,既作为吞噬细胞形成的重要细胞因子,又作为快速m R N A降解的R N A结合蛋白[4]㊂L C3B蛋白作为自噬体膜上的标记蛋白,与自噬体的发育和成熟有关,常用来监测自噬水平[5]㊂在哺乳动物的繁殖过程中自噬参与配子的分化㊁生成及早期胚胎发育[6-9]㊂在雄性动物生殖系统中,支持细胞在生精细胞生成过程中起保护和营养作用[10]㊂据报道,自噬缺陷会影响支持细胞的骨架结构,破坏支持细胞与生精细胞联系,进而抑制精子的生成[11]㊂此外,自噬参与顶体反应,对精卵融合起着重要作用[12]㊂在雌性动物生殖系统中,自噬促进黄体细胞分泌孕酮,维持妊娠[13]㊂在子宫内膜粘连的小鼠中,子宫内膜自噬水平低,并且以子宫内膜纤维化为特征[14]㊂子宫内膜发生自噬,对胚胎植入至关重要,并且在妊娠早期发挥着重要作用[15]㊂有试验证据表明,自噬相关基因A t g16L是小鼠子宫内膜蜕膜化的必需基因[16]㊂研究发现,自噬缺陷型小鼠表现为原发性卵巢功能不全,导致生育力低下[17]㊂通过低氧诱导颗粒细胞发生自噬,可以促进颗粒细胞发生分化和黄体形成[18]㊂颗粒细胞敲除B e c l i n1构建的自噬缺陷型模型中,小鼠分泌孕酮的量显著减少,从而导致流产[13]㊂研究表明,自噬完全缺陷型胚胎停滞在4细胞到8细胞阶段,最终导致胚胎死亡,且自噬缺陷型胚胎蛋白合成率也降低了30%[19]㊂L C3B蛋白作为自噬发生的标识蛋白,在相关研究中被用来检测自噬的发生和评估自7342畜牧兽医学报54卷噬通量㊂牦牛(B o s g r u n n i e n s)是我国青藏高原重要的动物资源,也是牧民经济收入的主要来源之一㊂由于自然条件恶劣,饲养水平低下,牦牛的自然繁殖率较低,如何提高牦牛的繁殖率越来越受到重视㊂目前有关L C3B蛋白在牦牛生殖活动中作用机理的研究较少,且未见商业化的牦牛L C3B蛋白抗体㊂为了进一步研究自噬在牦牛生殖活动中的作用,本研究通过基因克隆㊁原核表达和动物免疫的方法制备牦牛特异性L C3B蛋白多克隆抗体,并应用于牦牛生殖器官中L C3B蛋白表达检测,以期为牦牛体内L C3B蛋白和繁殖过程中自噬的研究提供依据㊂1材料与方法1.1试验动物与样品采集1.1.1试验动物日本大耳白兔购自中国农业科学院兰州兽医研究所,10月龄,室内饲养,饮水充足,健康状况良好㊂1.1.2样品采集本试验中所用牦牛睾丸㊁卵巢㊁子宫㊁输卵管等样品来自于青海省某屠宰场㊂健康成年牦牛经颈动脉放血屠宰后,30m i n内采集组织样,修剪周围结缔组织后用生理盐水冲洗干净,分别储存于液氮和4%多聚甲醛溶液中运回实验室备用㊂牦牛输卵管上皮细胞样品由甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心提供㊂1.2主要仪器与试剂P C R仪购自德国艾本德公司,超声波细胞破碎仪购自宁波新芝生物公司,酶标仪购自美国T h e r m o公司,显微拍照仪购自日本O l y m p u s公司,T a q P C R M a s t e r M i x㊁E v o M-M L V反转录预混型试剂盒购自湖南艾科瑞生物公司,T r i z o l试剂盒㊁R I P A裂解液㊁通用型D N A纯化回收试剂盒购自北京全式金公司,p M D T M19-T V e c t o r C l o n i n g K i t㊁J M109感受态细胞均购自日本T a K a R a公司, p E T-32a载体质粒购自美国T h e r m o公司,6ˑ蛋白上样缓冲液㊁氨苄青霉素(a m p i c i l l i n,A m p)㊁5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-b r o m o-4-c h l o r o-3-i n-d o l y l-b e t a-D-g a l a c t o p y r a n o s i d e,X-g a l),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷I P T G(i s o p r o p y l-β-D-t h i o g a l-a c t o p y r a n o s i d e,I P T G)均购自北京S o l a r b i o公司, W e s t e r n b l o t所用试剂均购自武汉博士德公司, G o a t A n t i-R a b b i t I g G/H R P a n t i b o d y㊁S P试剂盒及D A B试剂盒购自北京B i o s s公司,P r o t e i n m a r k e r 购自加拿大F e r m e n t a s公司,亲和层析柱料购自美国G E H e a l t h c a r e公司,佐剂购自上海S i g m a A l d r i c h公司,感受态细胞B L21(D E3)㊁P M S F购自北京碧云天公司㊂1.3牦牛L C3B基因克隆1.3.1引物设计参照G e n B a n k公布的牛(B o s t a u r u s)L C3B基因序列(NM_001001169.1),利用P r i m e r5进行引物设计,由上海生工进行引物合成,引物序列为L C3B-F:C A C G A G C C A A C T C G C, L C3B-R:A T C G G T G A T T A G A T G A A C T,产物长度为519b p,退火温度为54ħ,用于克隆牦牛L C3B基因㊂1.3.2总R N A的提取及反转录以体外培养的牦牛输卵管上皮细胞为材料,参照T r i z o l试剂盒说明书提取牦牛输卵管上皮细胞总R N A,并进行反转录合成c D N A,-20ħ保存㊂1.3.3L C3B基因的扩增与克隆以c D N A为模板对L C3B基因进行扩增㊂反应体系为20μL: 2ˑE x p T a q H S P C R M a s t e r M i x10μL,c D N A 2μL,上㊁下游引物各0.5μL,d d H2O7μL;反应条件:95ħ5m i n;95ħ45s,54ħ30s,72ħ2m i n; 4ħ保存㊂反应结束后用1%琼脂糖凝胶进行电泳验证㊂将胶回收产物与p M D-19T v e c t o r连接转化入D H5α感受态细胞(E s c h e r i c h i a c o l i)并涂布于L B(L u r i a-B e r t a n i)固体培养基(A m p,X-g a l, I P T G),过夜培养,挑取阳性单克隆菌落接种于L B 液体培养基(A m p)摇菌16h,吸取100μL菌液并送往北京擎科生物科技有限公司测序㊂1.3.4牦牛L C3B基因生物信息学分析用N C B I-B L A S T(h t t p s:ʊb l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/ B l a s t.c g i)对牦牛L C3B基因进行同源性比对;利用M E G A7.0绘制进化树;用N C B I在线软件进行开放阅读框分析(h t t p s:ʊw w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/ o r f f i n d e r);用在线软件预测L C3B蛋白的二级结构(h t t p:b i o i n f.c s.u c l.a c.u k/p s i p r e d)㊁三级结构(h t-t p s:ʊs w i s s m o d e l.E x p a s y.o r g),分析L C3B蛋白的理化性质(h t t p s:ʊw e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m),用在线软件分析L C3B蛋白亲疏水性(h t t p s:ʊw e b.e x-p a s y.o r g/p r o t s c a l e),用在线软件T M H MM S e r v e r V2.0预测跨膜结构域(h t t p:w w w.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/ T MHMM-2.0/)和磷酸化位点(h t t p:w w w.c b s.d t u.d k/se r v i c e s/N e t P h o s)㊂83426期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用1.4L C3B重组质粒的构建与原核表达测序比对正确的L C3B基因由武汉戴安生物技术有限公司合成,与表达载体p E T-32a(该载体含有T r x和H i s标签蛋白,分子量约为20k u)连接㊂将构建好的阳性质粒转化到B L21(D E3)感受态细胞,接种氨苄抗性L B培养基,过夜;挑选转化平板的4个单克隆,分别接种3m L抗性液体培养基; 37ħ,220r㊃m i n-1培养至O D600n m为0.5~0.6,加入0.5mm o l㊃L-1I P T G20ħ诱导表达3.5h;离心收集菌体,超声破碎,S D S-P A G E检测表达情况㊂1.5L C3B重组蛋白的纯化选择原核表达良好的60μL菌株接种至200m L抗性液体培养基,37ħ,220r㊃m i n-1培养过夜㊂加入新鲜抗性培养基至800m L,培养2h至O D600n m为0.5~0.6㊂加入200μL的1m o l㊃L-1 I P T G37ħ诱导表达3.5h㊂4ħ离心收集菌体(66r㊃s-1,15m i n),弃上清,加入30m L P B S T悬浮菌体,加入终浓度1mm o l㊃L-1P M S F,超声波200W破碎6m i n之后摇床4ħ孵育1h㊂4ħ高速离心(133r㊃s-1,15m i n),取上清,加入400μL于镍柱中,4ħ过夜㊂收集镍柱(33r㊃s-1,5m i n),用20mm o l㊃L-1咪唑洗脱液洗涤磁珠,洗去杂蛋白(1m L,3次)㊂加入300μL300mm o l㊃L-1咪唑洗脱液与磁珠充分结合1h,离心收集上清㊂再次向磁珠加入300μL的洗脱液,洗脱1h,离心收集上清㊂两次洗脱液合为一管,对P B S缓冲液透析换液㊂进行S D S-P A G E鉴定蛋白质㊂1.6多克隆抗体的制备及效价检测用纯化后的400μg L C3B重组蛋白与弗氏完全佐剂1ʒ1融合乳化,背部多点注射免疫日本大耳白兔,分别在第一次注射后的28㊁42㊁47㊁54d进行4次加强免疫,每次150μg㊂第四次加强免疫10d 后采集兔子血液,置于4ħ冰箱,次日离心收集血清㊂10m L抗血清与S e p h a r o s e4B亲和纯化柱过夜孵育,p H为5.0H C l洗去杂抗体,p H为2.5, 0.15m o l㊃L-1甘氨酸缓冲液洗脱,10ˑP B S缓冲液中和,制备亲和纯化抗体㊂将牦牛重组L C3B蛋白包被液稀释至1μg㊃m L-1作为抗原加至96孔板(100μL㊃孔-1)于4ħ冰箱中过夜,次日弃去孔内液体,洗涤3次,每孔加200μL封闭液,室温静置1h㊂兔抗L C3B蛋白抗体按1ʒ10000稀释后作为一抗,未注射任何免疫原的兔子血清作为阴性对照,H R P 标记的羊抗兔I g G作为二抗,一抗㊁二抗皆于37ħ孵育1h,孵育抗体前后P B S T洗涤5次㊂每孔加50μL显色液,室温显色20m i n后用50μL终止液终止显色㊂以O D450n m阳性血清/O D450n m阴性血清>2.1的最大稀释倍数为抗体效价㊂1.7W e s t e r n b l o t鉴定牦牛L C3B多克隆抗体1.7.1蛋白变性经液氮快速冷冻后的组织样品充分研磨,每100m g组织样加入1m L高效R I P A裂解液和10μL P S M F,冰浴反应3h,4ħ, 1500r㊃m i n-1离心15m i n,取上清液,与6ˑ蛋白上样缓冲液3ʒ1混合,100ħ变性10m i n后冷却至室温,-20ħ保存㊂1.7.2W e s t e r n b l o t检测牦牛L C3B蛋白抗体特异性制备12%的分离胶与5%的浓缩胶,进行S D S-P A G E,电泳后转膜至P V D F上,用5%脱脂奶粉封闭3h㊂弃去封闭液,分别以所得的兔血清和牦牛L C3B抗体为一抗(1ʒ1000),4ħ孵育12h, P B S T清洗5次,10m i n㊃次-1,H R P标记的羊抗兔抗体为二抗(1ʒ7000),室温摇床孵育1h,P B S T清洗4次,10m i n㊃次-1㊂之后在P V D F膜上滴加电化学发光液,使用化学发光仪进行检测㊂1.8L C3B蛋白在牦牛生殖器官中的表达定位经4%多聚甲醛固定的睾丸㊁卵巢㊁输卵管㊁子宫样品进行脱水后,制作石蜡切片,用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复,滴加3%H2O2溶液37ħ作用10m i n,P B S洗涤3次,3m i n㊃次-1,后滴加封闭液,室温封闭15m i n,滴加牦牛L C3B抗体(1ʒ500),阴性对照滴加P B S,4ħ孵育12h㊂P B S洗涤3次(3m i n㊃次-1),滴加二抗,37ħ作用15m i n后P B S 洗涤3次,3m i n㊃次-1,滴加三抗,37ħ作用15m i n,P B S洗涤3次㊂滴加D A B工作液显色,蒸馏水终止,苏木精复染,脱水,透明,树脂封片,观察拍照㊂1.9免疫荧光鉴定0.25%胰酶消化原代输卵管上皮细胞,用P B S 清洗输卵管上皮细胞3次,制成细胞悬液,将4ˑ105个㊃m L-1接种至有盖玻片的六孔板中,温箱培养24h,进行细胞贴壁,取出爬片,用P B S洗涤3次, 3m i n㊃次-1㊂2%多聚甲醛进行固定,洗涤后加入含有0.1%T r i t i o n-X100室温透化20m i n后,P B S洗涤3次,5m i n㊃次-1,用牛血清白蛋白(B S A)室温封闭2h,弃去封闭液,加入牦牛L C3B抗体(1ʒ500), 4ħ过夜孵育,P B S洗涤3次,5m i n㊃次-1,加入F I T C标记的二抗(1ʒ1000)室温孵育1h,P B S洗涤9342畜牧兽医学报54卷后,用D A P I染色液染核4m i n,用抗荧光淬灭剂封片后,在荧光显微镜下观察并拍照㊂2结果2.1牦牛L C3B基因克隆P C R扩增结果显示,目的条带单一且特异性良好,大小为519b p,与预期产物大小一致(图1A)㊂将纯化后的牦牛L C3B片段连接至P M D-19T载体后挑取单克隆进行菌液P C R验证(图1B),目的条带大小与普通P C R结果一致㊂后使用菌液进行测序,结果进一步提示所得序列为牦牛L C3B序列㊂测序结果已提交至G e n B a n k,登录号为:O P572227㊂A.L C3B基因P C R扩增电泳:M.D N A相对分子质量标准,1~4.牦牛L C3B基因扩增产物㊂B.单克隆菌液P C R扩增电泳:1~6.菌液P C R扩增产物A.L C3B g e n e P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s:M.D N A m a r k e r;1-4.Y a k L C3B g e n e a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s.B.S i n g l e c o l o n y P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s:1-6.B a c t e r i a l i q u i d P C R a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s图1牦牛L C3B基因P C R扩增电泳与菌液P C R扩增电泳F i g.1Y a k L C3B g e n e P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s a n d b a c t e r i a l i q u i d P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s2.2牦牛L C3B基因生物学信息分析2.2.1牦牛L C3B基因开放阅读框分析和进化树构建结果表明牦牛L C3B的开放阅读框全长378b p,总共编码125个氨基酸㊂系统进化树结果显示(图2),牦牛L C3B基因与普通牛(B o s t a u-r u s)㊁野牦牛(B o s m u t u s)㊁印度牛(B o s i n d i c u s)亲缘性最高㊂图2牦牛L C3B基因的系统进化树F i g.2P h y l o g e n e t i c t r e e o f y a k L C3B g e n e2.2.2牦牛L C3B蛋白理化性质分析和高级结构预测牦牛L C3B蛋白分子式为C659H1057N179O189S6,原子总数为2090,理论等电点(P I)为8.71,不稳定指数60.93,是一种不稳定蛋白㊂L C3B蛋白预测分子量大小为14.7k u,共编码19种氨基酸㊂牦牛L C3B基因编码的氨基酸中带正电的氨基酸总数为(A r g+L y s)19个,带负电的氨基酸总数为(A s p+G l u)17个,该蛋白带正电㊂牦牛L C3B基因编码的蛋白中α-螺旋共有37个氨基酸,占总数的29.6%,延伸链结构有22个氨基酸,占17.6%;无规则卷曲结构有66个氨基酸,占52.8%㊂牦牛L C3B蛋白的二级及三级结构结果如图3A㊁3B所示㊂2.2.3牦牛L C3B基因编码蛋白亲疏水性㊁跨膜结04426期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用构域和磷酸化位点分析牦牛L C3B蛋白为亲水性蛋白(图3C)㊂疏水性最强的为第79位的苯丙氨酸(P h e),其分值为1.556,亲水性最强的为第12位的苏氨酸(T h r),其分值为-2.867;L C3B蛋白不含跨膜区域,是非跨膜蛋白(图3D)㊂有4个丝氨酸(S e r)㊁3个苏氨酸(T h r)和1个酪氨酸(T y r)的磷酸化位点大于阈值,有成为蛋白质激酶磷酸化位点的可能(图3E)㊂A.牦牛L C3B蛋白二级结构预测;B.牦牛L C3B蛋白的三级结构;C.牦牛L C3B蛋白亲疏水性分析;D.牦牛L C3B蛋白跨膜结构域分析;E.牦牛L C3B蛋白磷酸化位点分析A.S e c o n d a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o n o f y a k L C3B p r o t e i n;B.T h e t e r t i a r y s t r u c t u r e p r o t e i n o f y a k L C3B p r o t e i n;C.H y d r o p h o-b i c i t y a n a l y s i s o f y a k L C3B p r o t e i n;D.A n a l y s i s o f t r a n s m e m b r a n e d o m a i n s o f y a k L C3B p r o t e i n;E.P h o s p h o r y l a t i o n s i t e s a n a l y s i s o f L C3B p r o t e i n i n y a k图3牦牛L C3B蛋白生物学信息分析F i g.3B i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s o f y a k L C3B p r o t e i n1442畜牧兽医学报54卷2.3重组质粒的构建及重组蛋白表达对重组质粒用B a m HⅠ和P s tⅠ进行双酶切验证,结果显示成功构建了p E T32a-L C3B重组质粒(图4A)㊂诱导蛋白表达结果如图4B所示,上清液和包涵体中都有牦牛L C3B重组蛋白的表达,大小为34k u,其中T r x标签蛋白大小约为20k u ㊂A.重组质粒双酶切验证:M.D N A相对分子质量标准;1.双酶切产物;2.p E T32a-L C3B重组质粒㊂B.重组质粒诱导表达: M.蛋白质量分子标准;1~4.全菌液诱导表达A.D o u b l e e n z y m e d i g e s t i o n v e r i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d:M.5000D N A M a r k e r;1.D o u b l e d i g e s t i o n p r o d u c t;2. p E T32a-L C3B r e c o m b i n a n t p l a s m i d.B.R e c o m b i n a n t p l a s m i d i n d u c e d e x p r e s s i o n:M.P r o t e i n m a s s m o l e c u l a r s t a n d a r d;1-4.W h o l e c e l l i n d u c e d e x p r e s s i o n图4重组质粒双酶切验证与诱导表达F i g.4V e r i f i c a t i o n a n d i n d u c e d e x p r e s s i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d b y d o u b l e d i g e s t i o n2.4牦牛L C3B蛋白的纯化使用亲和层析法纯化牦牛L C3B重组蛋白,咪唑洗脱液洗脱镍柱中的蛋白,S D S-P A G E检测结果显示(图5A),大约在34k u处出现较为单一的条带,表明纯化后的蛋白为牦牛L C3B重组蛋白,与预期结果一致㊂透析牦牛L C3B重组蛋白后经S D S-P A G E分析,获得3m g纯化蛋白(图5B)㊂A.上清诱导纯化蛋白S D S-P A G E:M.蛋白质量分子标准;1.300mm o l㊃L-1咪唑洗脱液一;2.300mm o l㊃L-1咪唑洗脱液二;3.B e a d s样㊂B.透析后蛋白S D S-P A G E:M.蛋白质量分子标准;1.B S A上样;2.透析后蛋白A.T h e s u p e r n a t a n t i n d u c e d p u r i f i e d p r o t e i n S D S-P A G E:M.P r o t e i n m a s s m o l e c u l a r s t a n d a r d;1.300mm o l㊃L-1i m i d a z o l e e l u e n t o n e;2.300mm o l㊃L-1i m i d a z o l e e l u e n t t w o;3.B e a d s.B.P o s t-d i a l y s i s p r o t e i n S D S-P A G E:M.P r o t e i n m a s s m o-l e c u l a r s t a n d a r d;1.B S A l o a d i n g;2.P r o t e i n a f t e r d i a l y s i s图5牦牛L C3B重组蛋白纯化F i g.5P u r i f i c a t i o n o f y a k L C3B r e c o m b i n a n t p r o t e i n24426期焦正兴等:牦牛L C 3B 蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用2.5 多克隆抗体的制备及鉴定根据O D 450n m 阳性血清/O D 450n m 阴性血清>2.1的最大稀释倍数为抗体效价,本试验制备的抗体效价为1ʒ640000㊁1ʒ320000(表1,图6A )㊂制备的血清(含T r x 和H i s 标签)能与牦牛L C 3B 蛋白发生特异性反应(图6B ),并且能识别L C 3B -Ⅰ(36k u )和脂化的后的L C 3B -Ⅱ(34k u )蛋白,表明该蛋白多克隆抗体特异性良好,可用于后续试验㊂表1 不同稀释度O D 450n m 值T a b l e 1 O D 450n m va l u e s o f d i f f e r e n t d i l u t i o n s 吸光值A b s o r b a n c e10K 20K 40K 80K 160K 320K 640K 1280K 2560K 5120K 10240K 阴性N e g a t i v e 1#兔多抗1#r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y1.0450.9860.8600.6720.4980.3610.2230.1450.1030.0700.0690.0582#兔多抗2#r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y1.0180.8970.7140.5150.3360.2200.1390.1000.0830.0710.0650.053A.不同稀释度的O D 450n m 值;B .免疫后血清特异性验证:1.卵巢;2.输卵管;3.子宫A.O D 450n m va l u e s o f d i f f e r e n t d i l u t i o n s ;B .V e r i f i c a t i o n o f s e r u m s p e c i f i c i t y a f t e r i mm u n i z a t i o n :1.O v a r y ;2.O v i d u c t ;3.U t e r u s图6 多克隆抗体效价及特异性检测F i g .6 P o l y c l o n a l a n t i b o d y t i t e r a n d s p e c i f i c i t y de t e c t i o n 2.6 兔抗牦牛L C 3B 多克隆抗体应用2.6.1 W e s t e r n b l o t 检测L C 3B 在牦牛睾丸㊁卵巢㊁输卵管和子宫中的表达 牦牛L C 3B 纯化抗体能与牦牛蛋白发生特异性反应,并且能够识别L C 3B 蛋白,包括L C 3B -I (16k u )和脂化后的L C 3B -I I (14k u ),与预测的牦牛L C 3B 蛋白大小一致(图7)㊂1.睾丸;2.卵巢;3.输卵管;4.子宫1.T e s t i s ;2.O v a r y;3.O v i d u c t ;4.U t e r u s 图7 W e s t e r n b l o t 检测L C 3B蛋白在牦牛生殖器官中的表达F i g .7 E x p r e s s i o n o f L C 3B p r o t e i n i n y a k r e p r o d u c t i v e o r ga n s d e t e c t e db y We s t e r n b l o t 2.6.2 免疫组织化学和免疫荧光染色检测L C 3B蛋白在牦牛生殖器官中的分布 L C 3B 蛋白在牦牛睾丸㊁卵巢㊁输卵管㊁子宫均有阳性表达㊂在睾丸中,主要表达于精子细胞(S P )㊁间质细胞(I C )㊁支持细胞(S C );在卵巢中,主要表达于黄体细胞(C L )㊁颗粒层(S G )和卵泡膜(T F );在输卵管中,主要表达于黏膜上皮(E M );在子宫中,主要表达于子宫腺(U G )和子宫内膜(E N )(图8)㊂免疫荧光显示,L C 3B 蛋白主要表达于牦牛输卵管上皮细胞的细胞核周和细胞质中(图9)㊂3 讨 论本试验通过基因克隆,获得了大小为519b p 的牦牛L C 3B 基因,该序列已提交至G e n B a n k ,登录号为:O P 572227㊂对牦牛L C 3B 基因序列在线比对3442畜 牧 兽 医 学 报54卷a ㊁b ㊁c .睾丸;d ㊁e ㊁f .卵巢;g ㊁h ㊁i .输卵管;j ㊁k ㊁l .子宫㊂a ㊁b ㊁d ㊁e ㊁g ㊁h ㊁j ㊁k 为阳性表达;c ㊁i ㊁l 为阴性对照㊂S P .精子细胞;S C .支持细胞;I C .间质细胞;S T.生精小管;S G.颗粒层;T F .卵泡膜;C L .黄体细胞;E M.黏膜上皮;U G.子宫腺;E N.子宫内膜a ,b ,c .T e s t i s ;d ,e ,f .O v a r y ;j ,h ,i .F a l l o p i a n t u b e ;j ,k ,l .U t e r u s .a ,b ,d ,e ,g ,h ,j ,k a r e p o s i t i v e e x p r e s s i o n ;c ,i ,l a r e n e g a t i v e c o n t r o l .S P .S pe r m c e l l s ;S C .S e r t o l i c e l l s ;I C .I n t e r s t i t i a l c e l l s ;S T.S e m i n if e r o u s t u b u l e s ;S G.G r a n u l a r l a y e r ;T F .T h e c a f o l l i c l e ;C L .L u t e a l c e l l ;E M.E p i t h e l i u m m u c o s a e ;U G.U t e r i n eg l a n d s ;E N.E n d o m e t r i u m 图8 L C 3B 蛋白在牦牛生殖器官中的分布F i g .8 D i s t r i b u t i o n o f L C 3B p r o t e i n i n y a k r e p r o d u c t i v e o r ga ns 图9 L C 3B 蛋白在牦牛输卵管上皮细胞中的分布F i g .9 D i s t r i b u t i o n o f L C 3B p r o t e i n i n o v i d u c t e pi t h e l i a l c e l l s o f y a k 44426期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用后发现,与普通牛㊁印度牛㊁野牦牛的L C3B基因序列高度一致,体现了L C3B基因的高度保守性,这与B a e k e n等[20]的研究结果一致㊂在前人的研究中提出,L C3B蛋白可发生脂化,表现为L C3B-Ⅰ和脂化后的L C3B-Ⅱ两种形式[21]㊂本研究通过理化性质分析后发现,牦牛L C3B共编码125个氨基酸,牦牛L C3B蛋白是非跨膜性的不稳定蛋白,提示牦牛L C3B蛋白也可发生脂化㊂该蛋白有4个丝氨酸㊁3个苏氨酸和1个酪氨酸成为磷酸化位点的可能㊂N i e t o-T o r r e s等[22]认为,L C3B蛋白发生磷酸化对自噬体与细胞核周围的溶酶体结合有重要意义㊂本试验成功构建了p E T-32a-L C3B重组质粒,经原核诱导表达后进行动物免疫,获得了免疫原性良好的抗牦牛L C3B血清,经纯化后制得了牦牛L C3B多克隆抗体㊂P E T-32a载体广泛应用于自噬相关蛋白表达,是较为稳定的原核表达载体[23-24]㊂但因p E T-32a标签蛋白分子量小,不利于小分子蛋白的诱导表达,因此,添加了T r x和H i s标签,以优化诱导表达条件㊂硫氧还蛋白(T r x)增强蛋白的可溶性表达,减少蛋白的浪费㊂牦牛L C3B重组蛋白的成功制备和高水平的表达是成功制备牦牛L C3B 多克隆抗体的关键㊂对该蛋白进行纯化后,制得牦牛L C3B多克隆抗体效价达到1ʒ320000和1ʒ640000,而余振兴等[25]制备的紫贻贝L C3B抗体效价仅为1ʒ25600,表明本研究所制备的兔抗牦牛L C3B多克隆抗体具有较高的灵敏性㊂通过W e s t e r n b l o t检测,本试验制备的牦牛L C3B多克隆抗体能正常识别L C3B蛋白,并且能够识别L C3B-Ⅰ和脂化后的L C3B-Ⅱ,证明本试验成功制备了特异性较好的牦牛L C3B蛋白抗体㊂将本试验制备的纯化抗体应用于L C3B蛋白的表达定位检测㊂W e s t e r n b l o t结果显示,L C3B在牦牛睾丸㊁卵巢㊁输卵管和子宫中均有表达,并且能够检测到L C3B-Ⅰ和脂化后的L C3B-Ⅱ蛋白㊂目前, L C3B-Ⅱ/L C3B-Ⅰ的比值常用来评估自噬[26]㊂因此,本研究结果提示所制备的兔抗牦牛L C3B多克隆抗体可用于牦牛自噬流的评估㊂免疫组织化学结果显示,L C3B蛋白在牦牛睾丸的精子细胞和支持细胞中表达㊂睾丸支持细胞在生殖细胞的存活和精子的生成中起着重要作用,与性腺的发育也有着紧密的联系[27]㊂Y i n等[28]已证实,自噬可抑制精母细胞凋亡,进而促进精子生成,说明牦牛L C3B蛋白也可能参与精子的生成过程㊂L C3B蛋白在山羊卵巢黄体类固醇生成细胞中表达[29],U l l a h等[30]检测L C3B蛋白表达,发现增强自噬可改变黄体类固醇细胞的亚细胞结构,有助于黄体功能的维持㊂本研究发现,L C3B蛋白在牦牛黄体细胞中表达,提示该蛋白可能参与牦牛孕酮的产生,与牦牛维持妊娠和调节发情和排卵有关㊂研究发现,促卵泡素(F S H)在促进卵泡发育的同时,伴有自噬的发生,在有腔卵泡中检测到L C3蛋白[31]㊂牦牛L C3B蛋白在颗粒细胞和卵泡膜中表达,说明L C3B蛋白参与牦牛卵泡的生长和发育㊂这与Z h e n g等[32]的报道一致㊂输卵管和子宫作为受精㊁早期胚胎的发育和妊娠的场所,在动物繁殖过程中起着重要作用㊂S u等[15]通过检测子宫内膜上L C3蛋白的表达,发现子宫内膜发生的自噬影响胚胎的着床㊂本研究发现,在牦牛输卵管上皮黏膜和子宫内膜中检测到了L C3B蛋白的表达,表明L C3B蛋白在卵子的输送过程㊁胚胎着床和妊娠中发挥着作用㊂总之,本研究所制备的牦牛L C3B多克隆抗体能识别牦牛L C3B蛋白,抗体特异性良好,可用于以牦牛为模型的分子试验;免疫组化和免疫荧光结果显示,L C3B在牦牛生殖器官中的表达部位与其他动物一致,提示L C3B蛋白在牦牛繁殖活动中发挥着重要作用,同时也进一步加深了对自噬在牦牛生殖生理中作用的理解㊂4结论本研究成功克隆了牦牛L C3B基因(G e n B a n k 登录号:O P572227),构建了重组质粒p E T-32a-L C3B,成功制备了特异性良好的牦牛L C3B多克隆抗体,该抗体可特异性识别牦牛L C3B蛋白㊂牦牛L C3B蛋白在睾丸㊁卵巢㊁输卵管和子宫中均有表达,且主要表达于细胞核周和细胞质中㊂研究结果提示,所制备的牦牛L C3B抗体可用于以牦牛为模型的分子试验,且发现L C3B蛋白参与牦牛生殖生理过程,为进一步研究牦牛L C3B蛋白和细胞自噬提供了基础资料㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] D E R E T I C V.A u t o p h a g y i n i n f l a mm a t i o n,i n f e c t i o n,a n d i mm u n o m e t ab o l i s m[J].I m m u n i t y,2021,54(3):437-453.[2] K UMA A,K OMA T S U M,M I Z U S H I MA N.A u t o p h a g y-m o n i t o r i n g a n d a u t o p h a g y-d e f i c i e n t m i c e[J].A u t o p h a g y,2017,13(10):1619-1628.5442畜牧兽医学报54卷[3] MA R U Y AMA T,N O D A N N.A u t o p h a g y-r e g u l a t i n gp r o t e a s e A t g4:s t r u c t u r e,f u n c t i o n,r e g u l a t i o n a n di n h i b i t i o n[J].J A n t i b i o t,2018,71(1):72-78.[4] HWA N G H J,HA H,L E E B S,e t a l.L C3B i s a nR N A-b i n d i n g p r o t e i n t o t r i g g e r r a p i d m R N Ad e g r a d a t i o n d u r i n g a u t o p h a g y[J].N a t C o mm u n,2022,13(1):1436.[5] Y O S H I I S R,M I Z U S H I MA N.M o n i t o r i n g a n dm e a s u r i n g a u t 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To study the physiological functions of two small GTP-binding proteins, rab3B and rab3C, we have isolated cDNA clones of these two genes from a bovine adrenal medulla cDNA library. Recombinant proteins of these cDNA clones were expressed in Escherichia coli using a GST-expression system. Polyclonal antibodies against synthetic polyptides containing the hypervariable domains of rab3B (amino acid 199-218) and rab3C (amino acid 207-226) were generated. We have used these antibodies to investigate the localization and subcellular distribution of rab3B and rab3C in bovine adrenal chromaffin cells and PC12 cells by immunocytochemical staining and immunoblot analysis. In chromaffin cells, rab3B was present in the plasma membrane and endoplasmic reticulum (ER) fractions. On the other hand, rabeC appeared in the plasma membrane, granule and cytosol fractions, but not in the ER fraction . In pc12 cells, only a very low level of rab3B was found. Stimulation of PC12 cells with NGF or an A2a-selective agonist (CGS21680) did not result in any significant change in the amount of rab3B protein. In contrast the rab3C protein level was increased by CGS 21680 and a cAMP analog (dibutyry -cAMP). Furthermore, rab3C was localized in the neurite terminal of the NGF- treated cells. We have also examined the tissue distribution of rab3B. Northern blot analysis indicated that rab3B is widely distributed in many tissues, except in pancreas. Among all of the tissues tested, rab3B is most abundant in adrenal medulla. In the future, our ultimate goal is to study the functions of rab3B and rab3C in neuronal cells using the molecular tools we have developed.
小GTP結合蛋白 rab3B 和 rab3C 在牛嗜鉻性細胞中生理功能的研究 THE MOLECULAR CLONING AND CHARACTERIZATION OF TWO SMALL GTP- BINDING PROTEINS IN BOVINE ADRENAL MEDULLA CHROMAFFIN
Ras-like的小分子GTP結合蛋白(G蛋白)在過去幾年中的研究已經迅速地蓬 發展。這些分子量在20-30KDa之間的G蛋白, 有著不同的生理功能。包括 控制細胞的增生, 訊息傳導物質的釋放和運輸等。為了得知rab3 小 G蛋 白的生理功能, 我們利用rab3基因序列相同的部分當做探針, 在牛腎上腺 髓質嗜鉻性細胞的cDNA基因庫中, 篩選到rab3B和rab3C的cDNA。而且 這 兩個cDNA已經送入大腸桿菌中表現出各別的蛋白質而且這兩種蛋白質可以 分別和GTP結合。此外, 我們還得到兩種專一性非常高的抗體, 分別對 抗 rab3B第199到218個胺基酸和rab3C 第207到226個胺基酸。因為這二個 小 G蛋白在這個區域胺基酸序列差異最。利用這兩種抗體,我們也在北方 點漬法的結果看出rab3B mRNA廣布於很多組織中, 最主要的為腎上腺髓 質, 而在胰臟中則沒有發現。同時透過免疫細胞、組織化學染色法及西方 點漬法等技術, 來分析這兩種蛋白在嗜鉻性細胞和PC12細胞中的分佈情形 。在嗜鉻性細胞中, rab3B在細胞膜及內質網上只有少量的表現。Rab3C蛋 白表現量則顯然比rab3B要多, 且集中在細胞膜、分泌兒茶酚胺的顆粒膜 上及細胞液中, 但是在內質網中則沒有存在。 而在另一個神經細胞模型 PC12中 ,rab3B及rab3C的表現都不高,細胞受到adenosine agonist CGS21680或 cAMP類化物如dbcAMP刺激時, 此時rab3C蛋白表現會隨之增 高, 而rab3B 蛋白量則沒有明顯的變化。此外, 在處理NGF的PC12細胞中, 可以在 neurite末端觀察到 rab3C 的表。未來, 我們利用目前已製備完 成的工具(包括抗體、CDNA及mutant 等)來繼續探討這二種小G蛋白的生理 功能。