Real time PCR 从原理到实验方法及数据分析

• 什么是IPC？IPC是一种阳性内对照，它被用在阳性/阴性实验中，用 于监测PCR过程并确定阴性结果不是因为PCR失败而造成。，IPC包 括一个模板、一组引物和一个荧光标记（VIC）的探针，被加到反应 板的每一个孔中。
阴性结果示例
阳性结果示例
microRNA
• MicroRNA(miRNA)是一种 22个碱基左右的内源性单链 小分子RNA
正常与突变探针在同一管里反应的点突变检测
基因分型检测
FAM
VIC Homozygote for FAM-specific allele
VIC
FAM Homozygote for VIC-specific allele
FAM VIC
Heterozygote for both alleles
等位基因自动识别软件
• 由带茎环结构的双链RNA前 体剪切而成
• 具有高度保守性、时序性和 组织特异性
• 通过与特异mRNA结合，抑 制目标基因表达或降解 mRNA
miRNA Expression
1. Transcription 2. Hairpin release in
the nucleus 3. Export to
T=24hr
IL-2 18S ΔCt 24 9 15 24 10 14 23 11 12
28 10 18
ΔΔCt 0 -1 -3
3
2-ΔΔCt 1.0 2.0 8.0
0.1
Relative Quantity of Expression
10
8.0
8
6
4
2.0
2
1
0.1
0
t=0 t=1h t=6h t = 24 h
• 加速数据分析 • 等位基因分组识别 • 每一个孔的质量评分 • 用户自定义的质量评分
标准 • 基于每一个标记的识别 • 限制用户的主观干扰
阴性阳性鉴定
• 定义：阳性/阴性实验是一种终点分析，它可以确定某个样本中是（阳 性，用加号表示）否（阴性，用减号表示）存在一个特异性目标序列。 在终点分析中，数据是在PCR过程结束时获得的。
cDNA cDNA
cDNA cDNA
相对定量：内对照 Endogenous Control
用以标准化样品操作
time
t =0
t=12
t=24
t=48
total RNA total RNA total RNA total RNA
cDNA cDNA
cDNA cDNA
T=0 (calibrator) T=1hr T=6hr
• However, how to design a TaqMan real-time PCR assay on a ~22 base polynucleotide fragment? (但是, 如何设计这样一个靶物只有22个碱基 TaqMan real-time PCR?)
Solution: TaqMan® MicroRNA PCR Assays
为何研究miRNA？
• miRNA已被确认为一类新的基因调控因子，参 与了细胞的发育、分化和联络
• 对miRNA功能的研究将有助于设计siRNA干扰 实验
• miRNA有可能成为新的生物分子标记 • 有重要的临床应用价值
miRNA 分析的技术挑战
Northern Blot (杂交法) • Homegrown technology and easy to access (易于操作) • Large sample amount requirement (ug scale) (需大量样品) • Low dynamic range (two orders of magnitude) (可测范围低) • Mismatch hybridization often cannot distinguish well between miRNAs
Workflow
mirVana™ miRNA Isolation Kit
TaqMan® MicroRNA RT kit TaqMan® MicroRNA Assays
TaqMan® Universal Master Mix,No UNG
Five Fully Integrated Systems for Real-Time PCR
Real-time PCR
Xiao Jin Applied Specialist Molecular & Cellular Biology
Real-time PCR 原理
数学原理 化学原理
Real-time PCR 应用
绝对定量 相对定量 等位基因分型 阴阳性判定 microRNA
荧光定量PCR数学原理
• 定义：等位基因分型(AD)分析是一种多重（每个反应包括一个以上的 引物和探针对）、终点（在PCR过程的终点收集数据）分析实验，用 于检测某个核酸序列的变异。
• 每个反应中包括两个引物和探针对，允许在一个目标模板序列的单核 苷酸多态性（SNP）位点上出现两个可能的变异基因型。
• 目标序列的实际量不确定。
CT
= − log X O log(1 + E X )
+
log(RT − RB ) − log RS log(1 + EX )
即 CT = - k lg X0 + b （线性方程）
标准曲线：CT值对[DNA]0作图
CT值
CT = - k lgX0 + b
lg [起始DNA]
成功的定量PCR
荧光定量PCR化学原理
TaqMan 探针
R
Q
5’
3’
下游引物
R
Q
5’
3’
1. 每产生一条DNA链，就切断一条探针
2. 每切断一条探针，就产生一个单位信号
3. 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
Real-time PCR 应用
• 绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
• 病原体检测 • 转基因食品检测 • 基因表达研究
• 相对定量(Relative Quantification，RQ)
• 基因在不同组织中的表达差异 • 药物疗效考核 • 耐药性研究
• 等位基因分型(Allelic Discrimination，AD)
• 基因突变分析 • SNP研究 • 物种鉴定、菌株鉴定
• 阴性阳性鉴定(Plus/Minus with IPC，+/-)
基线 阈值 Ct值 [DNA]0
由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品 扩增结果存在很大的差异
同时扩增96的相同样品的结果
线性图谱
扩增曲线：四个阶段
平台期
线性增长期 指数增长期 基线期
平台期 线性增长期 指数增长期
基线期
对数图谱
基线 阈值 Ct值
什么是基线？
基线就是扩增曲线中的水平部分。
[A]0
cytoplasm 4. Dicer processing 5. Strand selection
by RISC 6. Translational
repression
*mature active strand
Mechanisms of Small RNA-Induced Gene Regulation
线性图谱
对数图谱
基线 阈值 Ct值 [DNA]0
什么是阈值？
1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。 2. 偶然误差的结果满足对数分布。 3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差 x 10。 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10－5。 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。
Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System
mirVana™ miRNA Isolation Kit
• 专业高效回收小分子RNA • 富集小于200 nt RNA，提高下游试验灵敏度 • 方便快捷，30分钟完成整个过程 • 理想的 miRNA, siRNA, shRNA, and snRNA 分析
基线 阈值 Ct值 [DNA]0
什么是CT值？
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数
线性图谱
对数图谱
CT值
CT值
为什么CT值 ∝ [DNA]0 ？
N = N0 x (1+e)n
N：产物分子数；N0：起始分子数 e： 扩增效率； n: 循环次数
PCR理论方程只在指数期成立
线性期
lg [DNA]
指数期 y = x(1+e)n
Quantitative Real-Time PCR (实时定量PCR) • Dramatically less sample requirement (只需微量样品) • Significantly wide dynamic range (7 logs) (非常宽的可测范围) • High sensitivity and specificity (高灵敏度, 高特异性)
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
绝对定量：从荧光到拷贝数
The well contains 400 target copies
Y= mx+b
Ct‘s