膜片钳技术与离子通道药理学
膜片钳技术与离子通道药理学
膜片钳在药理学研究中的应用
膜片钳技术不仅对于细胞生物学领域的 发展以及对于阐明各种疾病的机制具有革 命性意义，而且开辟了一条探索药物作用 机制和发展新的更为有效药物的途径。正 如 诺 贝 尔 基 金 会 在 颁 奖 时 所 说 :“Neher 和 Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理, 为研制新的更为特效的药物开辟了道路” 。
药理学研究： 研究的药物，阻断剂、激动剂 或其它调制因素对通道活动的影响情况。
综合分析得出最后结沦．
膜片钳技术的优点
膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封 接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平 大大降低，相对地增宽了记录频带范围， 提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械 稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使 对单个离子通道进行研究成为可能。
膜片钳技术与离子通道药理学
（Patch clamp techniques & Ion channel pharmacology）
马腾飞
药理教研室
1991 Nobel基金会的颁奖评语：
膜片钳技术点燃了细胞和分子水平 的生理学研究的革命之火，为细胞生理 学的研究带来了一场革命性的变化，它 和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学 研究带来了巨大的前进动力。
OUTLINE
1、细胞电生理学 2、膜片钳技术及其应用 3、离子通道药理学
细胞电生理学 Electrophysiology
离子、离子通道
细胞兴奋
生物电信号
细胞电生理学
测量
细胞电生理学：揭示细胞的生理过程，用电 生理方法记录生物电活动
膜的“流动镶嵌模型”
细胞膜和离子学说建立（Hodgkin，et al . 1946年 ）
膜片钳实验室基本设备
细胞生物学的研究技术
单细胞凝胶电泳技术的操作步骤
1.制备第一层胶：100ml 0.8％正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min 2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000 个细胞的0.6％低熔点胶（cell与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4℃固 化10min； 3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10％ DMAO，1％Triton X-100），4℃裂解1h； 4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电 泳缓冲液（没过玻片2-3min），放置20min（黑闭）。 5.电泳：电压20V，300mA，30min 6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min； 7.染色：胶上滴加3ulEB，加盖盖玻片，24h检测。或者4℃，潮湿，闭光 的条件下保有胶片，观察时再染色，镜检。
光镜免疫金银细胞化学 原理示意图
பைடு நூலகம்
（一）水解酶 水解酶可分为五类即磷酸酶类、脂酶类、芳香基硫酸酯酶类、 糖苷酶类以及作用于肽键酶类。水解酶是催化水解的酶类，在超微结构水 平上显示酶的细胞化学方法都是以孵育阶段为中心，孵育液中一般都有酶 的反应底物和捕捉剂，反应的基本原理可分为两个步骤：1底物经过酶的 分解形成初级反应产物；2 初级反应产物和相应的捕捉剂形成一种不溶性 的化合物称为最终反应产物，这些最终反应产物是一些不溶性重金属沉淀 物（如铅、铜、钡等），在电镜下容易被检出。一般来说这些沉淀物在细 胞的位置就代表了酶促反应的位置。（二）氧化还原酶 氧化还原酶可分为 （ 氧化酶和脱氢酶两种。在氧化酶细胞化学反应中含有两个即分开又紧密联 系的底物，一个是生理底物如氧或过氧化氢；另一个是捕捉底物，通常是 四盐酸3，3’二氨基联苯胺（DAB）。DAB很容易氧化，经过一系列的化学 变化生成强嗜锇性的聚合物，在经锇酸固定就形成了锇黑。脱氢酶常用在 捕捉剂为铁氰化物，它在酶的作用下被还原为亚铁氰化物，在铜离子的存 在下进一步形成高度不溶的亚铁氰化铜沉淀。 。
2023年细胞生理学和膜片钳技术解析
膜片钳技术
• 膜片钳技术：从一小片(约几平方微米) 膜 获取电子学方面信息的技术，即保持跨膜 电压恒定——电压钳位，从而测量通过膜 离子电流大小的技术。通过研究离子通道 的离子流， 从而了解离子运输、信号传递 等信息。
基本原理
• 利用负反馈电子线路, 将微电极尖端所吸附 的一个至几个平方微 米的细胞膜的电位固 定在一定水平上,对通 过通道的微小离子电 流作动态或静态观察, 从而研究其功能。
• Voltage clamp （ 电 压 钳 技 术 ） 由 Cole 和 Marmont 发明，并很快由Hodgkin和Huxley完 善，真正开始了定量研究，建立了H－H模型 （膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。
• 1948年，Katz利用细胞内微电极技术记录到了 终 板 电 位 ； 1969 年 ， 又 证 实 N － M 接 触 后 的 Ach以“量子式”释放，获1976年Nobel奖。
通道蛋白——离子通道
• 环核苷酸门控通道 气味分子与G蛋白偶联型受体结合，激活腺苷酸环化酶，
产生cAMP，开启cAMP门控阳离子通道（cAMP-gated cation channel），引起钠离子内流，膜去极化，产生神经 冲动，最终形成嗅觉或味觉。 • 机械门控通道
一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏 感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多 的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后 者仅发现于内皮细胞和心肌细胞 • 水通道 2003年诺贝尔化学奖： Pete Agre、 Roderick MacKinnon
• 1976年，德国的Neher和Sakmann发明Patch Clamp（膜片钳）。并在蛙横纹肌终板部位记 录到乙酰胆碱引起的通道电流。
离子通道药理学
3．内向整流钾通道（inward rectifier K+ channels）
这类钾通道都具有内向整流特性，其中 比较重要的有三种：内向整流钾通道 （KIR），ATP敏感的钾通道(KATP)及 乙酰胆碱激活的钾通道（KAch）。
（1）内向整流钾通道（inward rectifier K+ channels）：该通道在心肌细胞称为 KIR（Kir2.1），其电流为Ik1。在心肌 细胞（心室肌），KIR通道也参与AP的 3相复极，但主要维持4相静息电位，防 止由于Na+-K+泵的作用使膜超极化大于 钾平衡电位（EK）。
（3）起博电流（pacemaker channels, If）
If是非特异性阳离子电流，即由一种 以上单价阳离子，如K+和Na+共同携带 的离子电流。是窦房结、房室结和希浦 系统的起搏电流之一。 If电生理特性：①If是由膜超极化激 活的随时间而逐渐增加的内向电流，其 阈电位在-50~-70mV左右；②If对Cs+敏 感，0.5mM Cs+几乎将If完全阻滞； ③肾 上腺素（Adr）促进 If的激活，If电流增 加，这是交感神经刺激加快心率的离子 基础之一；④If受乙酰胆碱（Ach）的调 节，Ach可抑制If，使心率减慢，故一般 认为副交感神经或迷走神经减慢心率的 机制是因为Ach抑制If的结果。Ach的作 用与Adr正相反。
三、离子通道的分子结构及门控机制
1．电压门控离子通道的分子结构
钠、钙和钾电压门控通道在分子结构上有许多相似之处，离子通 道蛋白是多亚基（subunits）构成的复合体。其中，构成孔道部分的 是α亚基。各种电压依赖的离子通道的α亚基均在膜上形成四个跨膜 区（D1-D4）,钠、钙通道的四个跨膜区由共价键连接成四倍体位于 同一肽链，整个亚基只有一个N-末端和一个C-末端。钾通道的α亚 基只有一个跨膜区，功能性钾通道是四个α亚基由非共价键连接而 成的四聚体。每个跨膜区由6个呈α螺旋式的跨膜片段 （transmembrane segmants, S1-S6）及其间的连结肽链所组成。连接 S5-S6的肽链部分贯穿于膜内，是形成亲水性孔道而有选择性地让离 子通过的部分，称为孔道区（pore region）或P区。另一个重要的肽 段是S4 , S4共带4～8个正电荷，当膜电位变化时，S4螺旋构型即发 生变化，通道开放，故S4被称为电压门控性离子通道的电压感受器 （voltage sensor）。
膜片钳的发展与应用
膜片钳技术的发展与应用崔梦梦（生命科学学院 1241410026）摘要：膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的，该技术的核心是能够记录单一离子通道的电流。
膜片钳可以测量到0.06pA的电流，它具有1um的空间分辨率和10us的时间分辨率。
作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究离子通道的“金标准”。
应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机稍等进行深入的研究。
此外，将膜片钳技术与其他一些先进的技术结合，使其在药理学、病理学、神经科学、脑科学、细胞生物学和分子生物学等生物科学方面,，得到了越来越广泛的应用。
关键词：膜片钳；离子通道；发展与应用在细胞膜上存在有许多的离子通道，这些离子通道是细胞兴奋性的基础，对细胞内以及细胞之间的信息传递起着非常重要的作用。
为探究离子通道的功能和结构，许多电生理技术被发明创造。
英国学者Huxley和Katz最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电流变化，但由于该技术钳制的细胞膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的离子通道，因而不能测定单一离子通道电流。
所以在1976年德国神经生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann 建立起一种新的技术，即膜片钳技术，并且逐渐取代了电压钳技术。
随着膜片钳技术的不断完善，自1981年以来, 该技术已经在不同动物的肝、脾、胃肠、心肌、骨骼肌、神经系统、内分泌等各类细胞上应用并取得了研究成果。
膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
一、膜片钳技术的基本原理膜片钳技术是利用玻璃微电极尖端经抛光后贴附于神经元膜上，与玻璃微电极尖端相接的膜仅含1—3个离子通道，然后通过负压吸引将这片膜与周围的膜实行高阻封接，因此在电极尖端覆盖下的那片膜，在电学上已于膜的其他部分相互分隔。
电极尖端下的膜通道开放所产生的电流流进玻璃微电极吸管，通过一极其敏感的膜片钳放大器，就可测量得到单一离子通道电流。
南京药理学膜片钳电生理技术原理
南京药理学膜片钳电生理技术原理
南京药理学膜片钳电生理技术是一种电生理研究技术，主要用于研究神经细胞或肌细胞的离子通道、离子泵等生理学特征。
该技术通过精细的电极制备和膜片吸附技术，可以在微小范围内对细胞膜上的离子通道做直接测量，从而探测细胞膜电位和电流。
该技术的原理是在一条微细的玻璃电极制成的药理学膜片上吸附悬浮的细胞，使细胞的膜紧贴于药理学膜片的通道上。
然后使用电生理技术进行实验，测量当细胞膜上某个离子通道开放时，离子的电流就会通过药理学膜片钳的电极进入记录器中，从而获得离子通道的电流、电位等信息。
同时，通过改变细胞膜上的离子浓度或加入药物，可以研究离子通道的特性，如激动、抑制、选择性等方面的生理学特征。
南京药理学膜片钳电生理技术在研究神经和肌肉等细胞膜上离子通道的生理学特征方面具有广泛的应用，如研究钙离子、钠离子、钾离子等离子通道的生理学特征，探索离子通道的结构及其功能解析等方面。
膜片钳实验与技术
汇报人：
通过施加电压或 药物刺激可以观 察到离子通道的 开放或关闭状态 从而了解离子通 道的电学特性和 药理学特性。
膜片钳实验原理的 应用广泛可用于研 究药物对特定离子 通道的作用机制和 效果以及研究细胞 生理和病理过程中 的离子通道变化。
准备实验器材：包括膜片钳放大器、微电极、细胞、溶液等
制作细胞膜片：使用微操纵器将微电极置于细胞膜表面形成封 接
膜片钳技术的未 来发展方向
神经科学：研究神经元电活动与行为之间的关系 药理学：筛选和验证药物作用靶点及效果 生理学：研究细胞生理功能及信号转导机制 病理学：探究疾病发生发展过程中细胞电生理变化
PRT THREE
膜片钳技术是通 过玻璃微电极记 录细胞膜单一离 子通道活动的技 术。
膜片钳实验原理 基于膜片钳夹持 技术能够将细胞 膜的某一离子通 道单独夹持在玻 璃微电极之间。
膜片钳技术将进一 步应用于研究神经 元功能和药物作用 机制
膜片钳技术有望在 基因治疗和细胞疗 法等领域发挥重要 作用
膜片钳技术将与新 型技术相结合提高 实验效率和精确度
膜片钳技术将为研 究生物电信号和离 子通道提供更深入 的见解
挑战：高精度的测量和控制技术 挑战：细胞类型特异性标记和分离技术 展望：结合新技术实现更高效和准确的膜片钳实验 展望：拓展膜片钳技术在生物医学领域的应用范围
膜片钳技术用于筛 选潜在药物候选物
膜片钳技术用于研 究药物对神经元信 号转导的影响
膜片钳技术用于研 究药物对心血管系动化与智能化：提高实验效率和准确度 新型材料的应用：提高膜片钳技术的稳定性和可靠性 跨学科融合：与其他领域的技术相结合拓展应用范围 标准化与规范化：推动膜片钳技术的普及和推广
PRT FIVE
膜片钳技术在心血管及药理学研究中的应用
．６９８．中国心血管病研究２００７年９月第５卷第９期Ｃｈｉｒ№ｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｒｄｉｏｖａｓｃ“胁Ｒｅｖ如＂，Ｓｅ，ｔｅ舶ｅｒ２０Ｄ７，Ｖ０１．５，Ⅳ０．９膜片钳技术在心血管及药理学研究中的应用李妙龄曾晓荣（审校）国家教育部重点项目资助（０３１０９）作者单位：６４６０００四川Ｉ省，泸州医学院心肌电生理学研究室中图分类号Ｒ３３１．３＊８文献标识码Ａ文章编号１６７２—５３０１（２００７）０９－０６９８－０３膜片钳技术…是～种以记录通过细胞膜上的各种离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多个的离子通道活动的技术。
通过微电极与细胞膜之间形成紧密接触，采用电压钳或电流钳技术对生物膜上离子通道的电活动进行记录。
可测量１ＤＡ的电流灵敏度，１／ｓ．ｍ的空间分辨率和１０ｕｓ的时间分辨率，为从分子水平了解生物膜离子通道的开启和关闭、动力学选择性和通透性等膜信息提供了直接的手段。
膜片钳技术的发展不过２０多年时间【２】，但却广泛的应用于心血管生理学、病理生理学及药理学的研究中，使人们对心血管系统生理调节、分子水平的病理学改变及药物的作用机制有了更深的认识和研究手段，解决了大量的理论和实际问题。
膜片钳技术应用的影响是深远的，它是一类应用范围非常广泛的电生理学技术，它给电生理学和细胞生物学以及神经生理学的发展乃至整个生物学研究带来了～场新的革命。
随着它的进一步发展，膜片钳与分子生物学、激光共聚焦等技术的结合应用拓宽了它的应用前景。
本文拟对膜片钳的基本原理和其在心血管及药理学研究中的应用作一综述。
１膜片钳技术基本原理膜片钳技术是用一尖端光洁，直径约１ｐ，ｍ的玻璃微管电极与细胞膜表面在负压吸引下紧密接触，引成千兆欧封接，将吸附在微电极尖端开口处的那小片膜与其余部分的膜在电学上完全隔离开来，使小片膜中只包含一个或数个通道蛋白质分子，在此基础上固定电位，这样便可研究单个离子通道的活动【３】。
对这一小片膜上的离子通道的离子电流进行检测记录，故称为小片膜电压钳位技术（简称膜片钳）。