一种适于PCR和LAMP检测的松木中松材线虫DNA快速提取方法
松材线虫病分子检测鉴定技术规程
松材线虫病分子检测鉴定技术规程松材线虫病是由松材线虫引起的一种严重的林木病害，对林业生产造成了严重的危害。
为了及时发现和控制松材线虫病，科研人员开发了分子检测鉴定技术，以提高病害的检测效率和准确性。
下面将介绍松材线虫病分子检测鉴定技术规程。
1. 样品采集和处理。
首先，需要采集受感染的树木或土壤样品作为检测的对象。
对于树木样品，可以选择受感染的树皮、树脂或树液作为检测样品；对于土壤样品，可以选择受感染树木周围的土壤作为检测样品。
采集的样品需要进行处理，如粉碎或提取DNA等操作，以便后续的分子检测。
2. DNA提取。
从样品中提取松材线虫的DNA是分子检测的关键步骤。
常用的DNA提取方法包括CTAB法、酚/氯仿提取法等。
提取的DNA需要经过纯化和浓缩处理，以保证后续的PCR反应的准确性和灵敏度。
3. PCR扩增。
PCR（聚合酶链式反应）是分子检测中常用的技术手段，可以扩增目标DNA序列，从而进行检测和鉴定。
设计特异性引物对松材线虫的DNA进行扩增，以获得特异性的PCR产物。
4. 凝胶电泳分析。
通过凝胶电泳分析PCR产物，可以判断样品中是否存在松材线虫的DNA。
在凝胶电泳中，目标DNA序列会呈现特异的条带，从而进行鉴定和分析。
5. 数据分析与结果判读。
最后，对凝胶电泳分析的结果进行数据分析和结果判读。
根据PCR产物的大小和特异性条带的出现，可以判断样品中是否存在松材线虫的DNA，从而进行病害的鉴定和诊断。
总之，松材线虫病分子检测鉴定技术规程是一项重要的技术手段，可以提高对松材线虫病的检测效率和准确性。
通过标准化的操作流程和技术规程，可以有效地应用于病害的监测和防控工作中，为林业生产提供有力的技术支持。
松材线虫群体密度调控及其PCR检测体系特性研究的开题报告
松材线虫群体密度调控及其PCR检测体系特性研究的开题报告一、课题背景松材线虫是松树的重要病原虫之一，能够引起松树死亡。
其在森林和林木栽培中造成了严重损失和经济损失。
因此，对松材线虫进行有效的防控和监测是极为必要的。
松材线虫的群体密度是影响其致病能力的重要因素之一，因此对其密度的调控非常重要。
另外，PCR技术是一种灵敏、快捷、准确、特异、无需培养的检测方法，已经成为松材线虫的重要检测方法之一。
二、研究目的本研究旨在研究松材线虫群体密度的调控及其PCR检测体系特性，为松材线虫的有效防控和监测提供理论依据和技术支持。
三、研究内容1.松材线虫群体密度调控的影响因素研究：通过对不同幼虫密度下松材线虫的饥饿度、繁殖力及致病能力等指标的测定，分析不同幼虫密度对松材线虫的影响。
2.松材线虫PCR检测体系的优化：优化引物、反应体系和条件等参数，建立灵敏度高、特异性强、稳定可靠的PCR检测体系。
3.松材线虫种群差异的PCR检测：对不同受感染程度的松树样本进行PCR检测，探究松材线虫种群的差异性，并分析其对松树的感染程度以及致病能力的影响。
四、研究方法1.松材线虫群体密度调控的影响因素研究：采用不同幼虫密度下的饥饿度、繁殖力及致病能力等指标的测定，分析不同密度下松材线虫的生物学特性变化。
2.松材线虫PCR检测体系的优化：优化PCR反应引物、反应体系、条件等参数，采用特异性强、灵敏度高的PCR检测体系检测松材线虫。
3.松材线虫种群差异的PCR检测：对不同受感染程度的松树样本进行PCR检测，分析松材线虫的种群差异性，并探究其对松树的影响。
五、预期成果通过本研究，预计可以深入了解松材线虫群体密度调控的作用和影响因素，建立特异性强、灵敏度高的PCR检测体系，并通过比较不同受感染程度的松树样本，分析松材线虫种群的差异性及其对松树的感染和致病能力的影响，并为松材线虫的有效防控和监测提供理论依据和技术支持。
松材线虫分子检测快速制样方法[发明专利]
![松材线虫分子检测快速制样方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/9d1e6733a7c30c22590102020740be1e650ecc67.png)
[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101153334A [43]公开日2008年4月2日[21]申请号200710092787.9[22]申请日2007.09.29[21]申请号200710092787.9[71]申请人重庆大学地址400030重庆市沙坪坝区沙正街174号[72]发明人殷幼平 王中康 刘裕兰 袁青 曹月青夏玉先 彭国雄 [74]专利代理机构重庆市前沿专利事务所代理人郭云[51]Int.CI.C12Q 1/68 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 7 页[54]发明名称松材线虫分子检测快速制样方法[57]摘要本发明涉及一种松材线虫分子检测快速制样方法，是专门针对对林业影响巨大的松材线虫而建立起的快速制样的方法。
利用该方法，不需要分离线虫，就可以直接提取疫木中松材线虫DNA用于分子检测。
配合PCR技术，可以检测出1.5克木屑中的1条松材线虫，时间仅需要3h，效果稳定可靠。
该方法克服了传统松材线虫检测制样方法时间较长、效果不稳定的缺点；适用于进出口通关木质材料松材线虫的快速检验检疫和林间病害早期诊断中大批量样品的检测。
200710092787.9权 利 要 求 书第1/1页 1.一种松材线虫分子检测快速制样方法，其特征在于，按以下步骤进行： [1]用直径为7～10mm的电钻在待测木质材料上钻取木屑，将所得木屑混合均匀，取1～8克木屑放于5～20ml离心管中；[2]将裂解液按每克木屑2～3毫升溶液的比例加入步骤[1]的离心管中，62～68℃水浴1～2小时；所述裂解液由0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)，0.4M乙二胺四乙酸(EDTA)，1％十二烷基磺酸钠(SDS)在常温下的混合物，pH值为8.0；[3]将步骤[2]所得混合液经5000rcf离心10min后，将其上清液600μl～1ml转入另一2～3ml离心管中，加入一定量的变性液，使变性液的终浓度为4M，混合均匀后，室温下放置8～15min，10000rcf离心8～10min后将上清液转入DNA吸附柱中，10000rcf离心1～2min，弃滤液；所述变性液是12M异硫氰酸胍；[4]在上一步的DNA吸附柱中加入清洗液600～800μl，10000rcf离心1～2min清洗DNA，弃滤液；所述清洗液是70％乙醇(V/V)；[5]重复步骤[4]一次；[6]再次离心除去所述的清洗液；[7]DNA吸附柱中加入溶解液50～60μl溶解DNA，10000rcf离心1～2min，收集滤液，即为松材线虫DNA样品，直接用于PCR检测。
一种松材线虫的快速制备方法[发明专利]
![一种松材线虫的快速制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/91d0f5fc6bd97f192379e9c4.png)
专利名称：一种松材线虫的快速制备方法专利类型：发明专利
发明人：申茂军
申请号：CN201410581037.8
申请日：20141027
公开号：CN105613425A
公开日：
20160601
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种松材线虫的快速制备方法属于线虫制备技术领域，尤其涉及一种松材线虫的快速制备方法。
本发明提供一种灵敏、快速的松材线虫的快速制备方法。
本发明包括以下步骤。
（1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫。
将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用。
申请人：申茂军
地址：110179 辽宁省沈阳市浑南新区新明街11号3楼2号
国籍：CN
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松材线虫检疫鉴定方法
松材线虫检疫鉴定方法
松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）是一种寄生性线虫，可能对松树造成严重危害。
为了及时检测和防治松材线虫的传播，
科学家们发展了一系列松材线虫检疫鉴定方法。
1. PCR技术（聚合酶链式反应）：PCR技术是一种常用的
DNA分子生物学方法，用于检测松材线虫的存在。
该方法可通过
放置松树样品中提取的DNA与松材线虫的特定引物结合，从而扩
增目标DNA。
通过观察PCR反应结果，可以确定松树样品是否受到了松材线虫的感染。
2. 寄主植物检疫：松材线虫主要通过传染松树传播，因此寄主
植物检疫是一种常见的鉴定方法。
检疫人员通常会观察松树的枝干、树干和根系等部位是否存在松材线虫的病征，如褐变、水渗
出等。
同时，他们还会对松树样品进行松材线虫的提取、培养和
鉴定，以确认是否受到感染。
3. 间接检测方法：除了直接检测松树样品中的线虫外，科学家
们还开发了一些间接检测方法来鉴定松材线虫的存在。
例如，可
以利用诱捕树干中的甲醇作为挥发物质，吸引松材线虫进入陷阱。
研究人员还可以观察昆虫等受松材线虫影响的寄生生物，从而推
断松树样品中是否存在线虫。
这些松材线虫检疫鉴定方法的发展为我们及时发现和控制松材线虫的传播提供了有力的工具。
通过采用这些方法，我们能够更准确地识别和确认松树样品中是否存在松材线虫，并及时采取相应的防治措施，以避免松树病害的进一步传播。
松材线虫分离方法
松材线虫分离方法嘿，朋友们！今天咱就来唠唠松材线虫分离方法。
这松材线虫啊，就像是森林里的一个小捣蛋鬼，要是不把它给弄清楚，那咱的林子可就要遭殃啦！要想分离松材线虫，咱得先找到合适的样本。
就好比你要找个宝贝，得先知道去哪儿找不是？一般来说，那些看上去不太健康的松树，就是重点关注对象啦。
找到这样的树，就像找到了线索的开头。
然后呢，咱就得小心地把树砍下来一部分。
这可不是乱砍哦，得有技巧的。
就跟你切菜似的，得切得恰到好处。
砍下来后，把它带回实验室，这就好比把宝贝带回了家，准备好好研究。
在实验室里，咱把样本处理一下。
这时候就像是给它洗个澡，把杂质啥的都去掉，让松材线虫能露出来。
接下来就是关键步骤啦，要用专门的方法把线虫给分离出来。
你想想，这就好像在一堆沙子里找金子，得有耐心，还得有好方法。
可以用一些特殊的溶液啊，让线虫乖乖地浮出来。
这可需要点技巧和经验呢，可不是随随便便就能做到的。
要是没分离好，那可就像没抓住小偷一样，让它跑啦！那咱之前的努力不就白费了嘛。
所以啊，在这一步可得格外仔细。
等成功把松材线虫分离出来了，那感觉，就跟打了一场胜仗似的！心里那个美呀！这线虫虽然小，可它的影响力可不小呢。
咱只有把它研究透了，才能更好地保护我们的森林呀。
你说这松材线虫是不是很狡猾？藏在树里让人不好找。
但咱也不能怕它呀，咱得有办法对付它。
这就跟生活中遇到困难一样，咱不能退缩，得想办法解决。
朋友们，保护森林可是我们每个人的责任呀。
学会了松材线虫分离方法，咱就能更好地为森林健康出一份力啦！这难道不是一件很有意义的事情吗？所以啊，大家都行动起来吧，让我们的森林一直生机勃勃！。
一种快速筛选杀松材线虫细菌的方法[发明专利]
![一种快速筛选杀松材线虫细菌的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/1876b7450029bd64793e2c8e.png)
专利名称：一种快速筛选杀松材线虫细菌的方法专利类型：发明专利
发明人：朱丽华,章欣月,代善俊,杨帆,叶建仁
申请号：CN201810734443.1
申请日：20180705
公开号：CN108660183A
公开日：
20181016
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种快速筛选杀松材线虫细菌的方法，先将无菌松材线虫悬浮液与待测细菌菌株培养液在96孔板中共培养，然后离心，去除上清，再加入无菌水与线虫共培养，然后统计被击倒的线虫数量，根据被击倒的线虫数量来判断细菌是否是杀松材线虫细菌。
本发明的快速筛选杀松材线虫细菌方法，经过多个细菌菌株、多次重复结果表明，采用该方法对杀松材线虫进行筛选，准确率高，是一种快速且准确的杀线虫细菌筛选方法。
申请人：南京林业大学
地址：210037 江苏省南京市龙蟠路159号
国籍：CN
代理机构：南京申云知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：邱兴天
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松木中松材线虫取样及PCR检测技术的优化研究的开题报告
松木中松材线虫取样及PCR检测技术的优化研究的开题报
告
一、研究背景与意义
松木中松材线虫是一种重要的林业有害生物，长期以来给林业生产带来严重的损失。
目前很多研究都集中在松材线虫的种类、生物学特性以及防治方法等方面。
然而，线虫的检测和鉴定对于预防和控制其扩散至关重要，且在检测和鉴定方面仍存在一些
问题和挑战。
因此，深入研究松材线虫的检测和鉴定方法，对于提高松木防治能力具
有重要的实用和应用价值。
二、研究目的
本研究旨在优化松木中松材线虫的取样和PCR检测技术，以提高检测精度和效率，并探究检测方法中存在的问题以及解决方案。
三、研究内容与方法
1.实验材料
采用不同龄期的松木样品为实验材料，并在不同的季节采集样品。
2.取样方法的优化
对不同龄期的松木样品进行采样，并比较不同取样方法对松材线虫检测结果的影响。
3.样品PCR检测方法的优化
首先优化提取线虫DNA的方法，然后对PCR反应条件进行优化，并比较不同PCR方法对线虫检测结果的影响。
4.方法的应用与实践
在实验基础上，对开发的检测方法进行应用与实践，并验证其在实际中的效果和可行性。
四、预期成果
1.建立一套可靠高效的松木中松材线虫PCR检测方法，提高检测精度和效率。
2.研究不同龄期的松木样品及不同的采样方法对检测结果的影响，为线虫的准确检测提供指导。
3.解决检测中存在的问题，为松木防治提供技术支持。
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快速 ， ２ ０ ａｉ ｒ ｎ内即可完成整个 Ｄ Ｎ Ａ的提取 ；经济方便 ， 试剂保藏 无特殊要求 ， 单个样 品提取耗费低 于 ３ ． ５元 。【 结
论 】Ｃ ｈ ｅ ｌ ｅ ｘ － ｌ ０ ０法 是 一 种 快 速 有 效 的 提取 松 木 中松 材 线 虫 Ｄ Ｎ Ａ 的方 法 ， 此方法结合 Ｐ Ｃ Ｒ和 Ｌ Ａ ＭＰ检 测 技 术 将 进 一
（Ｗ ／ Ｖ ） ， 最适冻融时间为 ５ ｍ ｉ ｎ ， 最 适 煮 沸 时 间为 ８ ｍ ｉ ｎ 。 与传 统 的 Ｃ Ｔ Ａ Ｂ法 和 蛋 白酶 Ｋ 法 比较 ， Ｃ ｈ ｅ ｌ ｅ ｘ 一 １ ０ ０法 提 取 的 Ｄ Ｎ Ａ得 率 高 ， 相同条件下 ， 该方法提取 的 Ｄ Ｎ Ａ 浓度 远 远 大 于 常 规 方 法 。３种 方 法 的 Ｏ Ｄ 。 比值 从 大 到 小 依 次 为Ｃ Ｔ Ａ Ｂ法 ＞蛋 白酶 Ｋ法 ≥Ｃ ｈ ｅ ｌ ｅ ｘ 一 １ ０ ０法 ， Ｃ ｈ ｅ ｌ ｅ ｘ － １ ０ ０法 的 Ｏ Ｄ ： 。 值显著低于 Ｃ Ｔ Ａ Ｂ法 ， 而 略 低 于 或 等 同于 蛋 白酶
Ｊ ｕ ｎ ． ， ２ ０ １ ５
一
种适 于 Ｐ Ｃ Ｒ和 Ｌ Ａ ＭＰ检 测 的松 木 中松 材 线 虫 Ｄ Ｎ Ａ快 速 提 取 方 法 木
苟 大 平 王 曦 茁 汪来 发 田 国忠 朱 天 辉 郭 民伟
雅安 ６ ２ ５ ０ １ ４ ； ２ ． 中 国林 业科 学 研 究 院 森林 生 态 环 境 与保 护 研 究 所 （ １ 四川 农 业 大 学 林 学 院
步提高松材线虫 的检测效率 、 灵敏 度和准确性 ， 可 为松 材 线 虫 的 野 外 检 测 提 供 可 靠 的技 术 依 据 。 关键词 ： 松 材 线 虫 ；Ｄ Ｎ Ａ提取 ； Ｃ ｈ ｅ ｌ ｅ ｘ 一 １ ０ ０ 中 图分 类号 ： ￥ ７ ６ ３ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ １— ７ ４ ８ ８ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ６—０ １ ０ ０—１ ｌ
Ａ Ｍｅ ｔ ｈｏ ｄ ｆ ｏ ｒ Ｒａ ｐｉ ｄｌ ｙ Ｅｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｎｇ ＤＮＡ Ｏ ｆ Ｂｕ ｒ ｓ ａ ｐｈ ｅ ｌ ｅ ｎｃ ｈｕ ｓ ｘ ｙ ｌ ｏ ｐｈｉ ｌ ｕ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ ｔ ｈｅ Ｉ ｎ ｆ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ Ｐｉ ｎｅ Ｗ ｏ ｏ ｄ ｏｒ ｆ ＰＣＲ ａ ｎｄ ＬＡ Ｍ Ｐ Ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ
Ｐ Ｃ Ｒ扩增 ， 扩 增 产 物 电 泳 依 然 有 清 晰 的条 带 。用 新 方 法 提取 病 木 中线 虫 的 Ｄ Ｎ Ａ后 进 行 检 测 ， 所 有 带 病 松 木 样 品 的 检 测 结 果 均 呈 阳性 ， 而健康黑松 、 马尾松 、 油松木屑及 盘多毛 孢样 品的检测 结果 均呈 阴性。此外 ， 该 提 取 方 法 简 便
Ｇｏ ｕ Ｄａ ｐ ｉ ｎ ｇ Ｗａ ｎ ｇ Ｘｉ ｚ ｈ ｕ ｏ Ｗａ ｎ ｇ Ｌ ａ ｉ ｆ ａ Ｔ ｉ ａ ｎ Ｇｕ ｏ ｚ ｈ ｏ ｎ ｇ Ｚｈ ｕ Ｔｉ ａ ｎ ｈ ｕ ｉ Ｇｕ ｏ Ｍｉ ｎ ｗｅ ｉ
（ １ ． Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｙ ， Ｓ ｉ ｃ ｈ ｕ ａ ｎ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ Ｙ ａ ’ ａ ｎ ６ ２ ５ ０ １ ４； ２ ．Ｋ ｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｆ ｏ Ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ｏ Ｓ ｔ ａ ｔ ｅ Ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｙ Ａ ｄ ｍｉ ｎ ｉ ｓ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｆ ｏ Ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ Ｅ ｃ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｎ ｄ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ， Ｃ Ａ Ｆ Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ １ ０ ０ ０ ９ １ ）
国家 林 业 局 森 林 保 护 学 重 点实 验 室 北 京 １ ０ ０探索 快速 、 简便地 直接从 病木 中提取 松材 线虫 Ｄ Ｎ Ａ 的方法 。【 方 法 】运用 Ｃ ｈ ｅ ｌ ｅ ｘ 一
１ ０ ０结 合 异 硫 氰 酸 胍 蛋 白变 性 缓 冲 液 建 立 新 的 高 效 快 速 提 取 微 量 木 块 中 线 虫 Ｄ Ｎ Ａ 的方 法 ， 并通过 普通 Ｐ Ｃ Ｒ 与 环
第 ５ １卷 第 ６期
２ ０ １ ５年 ６ 月 ｄ ｏ ｉ ：１ ０． １ １ ７ ０ ７ ／ ｊ ． １ ０ ０ １ ・ ７ ４ ８ ８ ． ２ ０ １ ５ ０ ６１ ２
林
业
科
学
Ｖｏ １ ． ５１． ＮＯ ． ６
ＳＣＩ ＥＮＴＩ Ａ
Ｓ Ｉ Ｌ ＶＡＥ
Ｓ Ｉ ＮＩ ＣＡＥ
介导等温扩增 （ Ｌ Ａ ＭＰ ） 对提 取的 Ｄ Ｎ Ａ进 行 检 测 验 证 。 【 结 果 】建 立 了 提 取 线 虫 Ｄ Ｎ Ａ 的新 方 法 Ｃ ｈ ｅ ｌ ｅ ｘ 一 １ ０ ０法 ， 并 对
影响提取效率 的 Ｃ ｈ ｅ ｌ ｅ ｘ ． １ ０ ０浓 度 、 冻 融 时 间 和 煮 沸 时 间进 行 了 优 化 。 Ｃ ｈ ｅ ｌ ｅ ｘ 一 １ ０ ０法 最 适 Ｃ ｈ ｅ ｌ ｅ ｘ 一 １ ０ ０终 浓 度 为 １ ． ５ ％
Ｋ法 ， 但这并不影响对提取 的 Ｄ Ｎ Ａ进行 Ｐ Ｃ Ｒ扩增 。采用 Ｃ ｈ ｅ ｌ ｅ ｘ 一 １ ０ ０法 提 取 松 木 中 松 材 线 虫 的 Ｄ Ｎ Ａ， 结 合 常 规 的
Ｐ Ｃ Ｒ和 Ｌ Ａ ＭＰ检 测 ， 检测 灵 敏 度 高 ， 特异性 强 ， 稳定性好 ； 提 取 的松 材 线 虫 Ｄ Ｎ Ａ的 ７ ５倍 稀 释 液 再 稀 释 ３ ２倍 后 进 行