宋内氏痢疾菌侵袭相关基因的克隆与表达The Cloning and Expression of Invasion Associated Genes

用粘粒ＰＢ Ｊ８ 为载体，构建了 宋内氏 痢疾茵Ｉ 相大质粒基因库．用菌落原位杂交，Ｗｅｅ ｂ ｐＡ Ｂ ， ４种蛋白的重组子．经重组质粒酶切和 Ｓ ｕｈｒ ｂｏ 等方 ， ｏｔｅｎ ｔ ｌ 法对宋内氏菌和福氏 ２ 痢疾菌的侵袭相关基因片段作了初步比较分析。 ａ
Ｌ ｏ ｅ ｇ ｕ Ｚ ｎ ｅ Ｇ Ｊ ｙｎ ｈ ａ ｉ ｉｇ Ｋｏ ｇ ａｇ ｉｇ Ｓ Ｘｉ ｏ ｅ ｎ Ｘｉ ｙｎ ｎ ｕ ｎ
（ ｓｔｅ ｃ ｂ ｌ ｙ Ｅ ｉ ｍｏ ｇ， Ａａｅ ｙ ｌ ｒＭｅｉ ｌ ｎｅ， ｉ １ ８灼 Ｉ ｔ ｔｏＭｉｏｉｏ ａｄ ｄ ｉｏｙＴ ｅ ｄ ｏＭｉａｙ ｄ ａＳｉ ｃ Ｂｉ ｇ ５ ｎｉ ｆ ｒ ｏｇ ｎ ｐ ｅ ｌ ｕ ｈ ｃ ｍ ｆ ｉ ｔ ｃ ｃ ｓ ｅｎ ０ ｅ ｊ ０
（ ） ａ ， １ ｅ ａ ． １ ８１ Ｊ． ｃ ｅ ｌ ， ４５ １ ５ ５ Ｋ ｄｏ Ｃ．． ｌ： ｔ ９ ． Ｂａ ｔ ｒｏｌ １ ：３６ ．
（ ） ａ ｒｌ ． ｅ ａ ． １ ８ ． ｃ． ｍｍｕ ， ９ １ ４ ６ Ｍ ｕ ｅｌ Ｔ． ｌ ９ ５ Ｉ 介 ｔ Ｉ ｉ ｔ ： ｎ ｎ ４ ：６ ． （ ） ｋ ． ７ Ｏａ ｓ ＥＮ ． ａ ． １ ８ ． ｆｃ ． ｅ ｌ ９ ６ Ｉ ｅ ｔＩ ｔ ： ｎ ｍｍｕ 二 ５：７ ３５ （ ） ｋ ｉ Ｔ． ａ ． １ ８ ． ｅ ｔ Ｉ ８ Ｓ ａ ， ｅ ｌ： ６ Ｉ ｆｃ ． ａ ｔ ９ ｎ ｍｍｕ ． ５ ：７ ． ｎ， １４ ６
本文于 １ ９ 年 ６ ２ ５１ 月 ２日收到 。
・１ ・ ９
关挂词 宋 内 氏痢 疾菌 ，Ｉ 大 质粒 ，粘 粒 ，基 因库 ，侵袭 相关 基 因 相
痢疾菌的毒力是由多因子决定的 ‘ ，其中由 １ －２０ｂ ８ ） ８ ３ｋ 大质粒编码的侵袭相关蛋白 ０
（ａ Ｉ ）可被不同型痢疾菌感染的猴恢复期血清识别，是痢疾菌的重要毒力决定簇．在侵袭肠上皮 ｐ
细胞过程中 起着关键作用 〔 ． 存在于菌体外膜，虽然在菌体总蛋白中 ａ Ｉａ ） ｐ 所占 例较小，但 的比 Ｗｅｅ ｔ ｓｒｂ 显示它们具有较好的免疫原 〔 ．有报道认为具侵袭力的活菌苗有较好的免疫保 ｔ ｌ ｎ ｏ 性 ７ ） 护作用 〔 ”。因此 侵袭相关蛋白 （ ａ Ｉ ）在痢疾活菌苗构建中 ｐ 可能具有潜在的价值． 本文介绍用
遗传 ＨＥ Ｅ Ｔ （ｅｉｇ １（） １－ ９ ９ Ｒ ＤＩＡＳ ｉ ） １ ７ １ １ ３ Ｂｊ ｎ ５ ： ９
宋内氏痢疾菌侵袭相关基因的克隆与表达
罗振革 高杰英 孔祥英 苏 新
（ 军事医学科学院 徽生物流行病研究所，北京 １ ８０ ０ ５） ０
Ｔ ｅ ｎ ｇ ｄ ｐｅｓ ｎ Ｉｖｓ ｎ ｓｃ ｔｄ ｈ Ｃｏ ｉ ａ Ｅ ｒｓ ｏ ｏ ｎ ａｉ Ａ ｏｉ ｅ ｌ ｎ ｎ ｘ ｉ ｆ ｏ ｓ ａ Ｇ ｎｓ Ｓ ｉｅａ ｎｉ ｅｅ ｏ ｈ ｌ ｓｎｅ ｆ ｇ ｌ ｏ
粘粒 ｐＢ 为载体克隆宋内氏菌的 ｉ 基因片段的过程，并对宋内氏和福氏２ 两种痢疾菌的 ｉ Ｊ８ ｐ ａ ａ ｐ ａ
基因片段作了初步 比较。
材 料 和 方 法
（ 一）菌株和质粒
实验中所用菌件和质粒列于表 １ ：
表 １ 菌株和质粒
菌株 或 质粒
Ｓｓ ｎ ｅ Ｓ ３ ．ｏ ｎ ｉ ６ Ｅ．ｏｉ ２ ０ ｃ ｌＫ－１ ＨＢ１ １
本 室 本 室 本 工 作
ｐＢ Ｊ８
ｐ ＹＳ ６ ０ Ｍ Ｈ ５３
ｐ Ｗ ６ Ｈ ６ ２ ｐ Ｍ Ｒ １ ７
法国巴斯德研究所馈赠 兰州生物制 品 所提供 日 本国立卫生研究所提供 澳大利亚 Ｔ ｙ ｒ ａｌ 提供 ｅ
１ ・ ７
（ 二）载体的制备 常规碱变性法提取粘粒 ｐＢ 质粒，两份样品分别经 Ｓ ｌ Ｈｉ Ｉ酶切，经碱性磷酸酶脱磷 Ｊ８ ａ ， ｎ Ｉ ｌ ｄ 酸后分别用 Ｂｍ Ｉ ａ Ｈ 酶切，收集 Ｓｆ Ｂｍ Ｉ ａ－ ａ Ｈ 酶切小片段，Ｈｉ Ｍ－ ａ Ｈ 酶切大片段作为载体 ｎ ｄ Ｂｍ Ｉ 两臂．载体两臂分别含一个被包装蛋白 识别的 。 位点．Ａ ｀ 。 ： ｐ基因位于 Ｈｉ Ｍ－ ａ Ｈ 酶切大 ｎ Ｂｍ Ｉ ｄ
片段上．
（ 三）外源Ｄ Ａ的制备 Ｎ
Ｋ ｄ Ｌｕ 法 〔 提取 Ｓ ｏｎ Ｓ３ ａｏ 改良 ５ ｉ 〕 ．ｎ ｉ 的大质粒，经Ｃｃ 密度梯度超离心纯化，ＳｕＡ部 ｓ ｅ６ ｓｌ ａ３
分酶切，回收３－５ｋ ０ ０ｂ的Ｄ ＮＡ片段． （ 四）体外包装及转导 ｐＢ 载体两臂与 ３－５ｋ Ｊ８ ０ ０ｂ的大质粒片段以ｌ ： ： ｌ ｌ 的比例 （ 摩尔比）经Ｔ 连结酶连接， ４ 连结反应物经包装蛋白休外包装形成噬菌体颗粒，感染受体菌Ｅｃｌ － ２ ＩＩ ． ｉ １ＨＢＯ ，被感染的受 ｏＫ
・１ ８
野生型宋内氏菌 Ｓ３ ６ 相对应的 Ｉａ ， Ｃ Ｄ蛋白带，分子量大小分别约 ７ｋ ５ｋ ｐＡ Ｂ ， ， ８Ｄ， Ｄ， ７ ４ｋ ， Ｄ．但表达水平低于野生株．菌落原位杂交显示 Ｓ ２ 与 Ｆ ２Ｄ ３ｋ ８ Ｈ９ 基因片段无同源性．克隆 株中缺少对ｉ 基因表达起正调控作用的Ｆ基因，导致其表达水平比野生菌低。另外，大肠杆菌 ｐ ａ 和痢疾菌胞内环境和遗传背景的差异也可能导致基因 表达的不同． （ 四）皿组质粒酶切及 Ｓｕ ｅ ｂ ｔ ｏｔ ｒ ｌ 分析 ｈ ｎ ｏ
交按分子克隆常规法操作。
（ 六）Ｗｅｔｒ ｂ ｔ ｓ ｎ 检测 ｅ ｌ ｏ
待检菌株接种贺氏肉汤，培养过夜．全菌抽提物作为样品进行聚丙烯Ｉ胺凝胶电泳，经转移 ｔ ｆ
电 将蛋白 转 硝 纤 膜 与 染 疾菌 猴 复 泳 带 移到 酸 维素 上， 感 痢 的 恢 期血清 应， 生 一 和 一 反 用 物素 亲 素
图 ２ 重组质粒的 Ｓｕ ｅ ｔ ｏ ｔ ｒｂ 分析 ｈｎ ｉ ｏ
１ ． 示 ＤＨ９ ， ２ ， ａ Ｓ ３ －４ １ ＨＳ９ Ｍ ， ６
经 Ｓ ｌ ａＩ 酶切后与 １ｋ 探针 ７ｂ 杂交，
侵袭相关蛋白的精确基因图和侵袭蛋白的生物学活性还有待深人研究。
参 考 文 献
（〕金 灵 ，苏 新 ：１ ９ ．徽生物学报 ．３ （） ４ ． １ ９０ ０ ： １ ８ （〕刘学 博等： １９ ． 中华徽生物 学和 免疫学杂志 ．１ （ ） １３ ２ ９０ ０ ： ． ３ ６
Ｄ ９为 Ｈ １ 本室以前 得到的可表达福氏２ 痢 ａ 疾菌４ 种侵袭相关蛋白 重组子‘ ， Ｈ ９ 本 的 ２ Ｓ ２为 ）
文中的表达宋内氏痢疾菌侵袭蛋白的重组子．用 Ｓｆ ａ 对两重组子质粒进行酶切，二者都有一个 １ｋ 左右片段 （ １． ｕｈｒｂｏ显示此片段与 １ｋ 探针呈阳 ５ｂ 图 ） Ｓ ｔｅ ｌ ｏ ｎ ｔ ７ｂ 性杂交 （ ） 图２。说明此片段 在两种痢疾菌中的保守区 域，可能与Ｉａ ｐ 的表达有关．
（ ） ｏ ｍａ， Ｂ ｅ ａ ． １ ８ ． ｅ ｔ Ｉ ３ Ｆ ｒ ｌ Ｓ ． ｌ： ４ Ｉ ｆｃ ． ． ｔ ９ ｎ ｍｍｕ ． ４ ：６ ． ｎ， ６４ ５ （ ） ａｅ Ｔ． ｅ ａ． １ ８ ． 介ｃ． ４ Ｈ ｌ， Ｌ． ｌ ９ ３ Ｉ ｔ ： ｎ ｔＩ ｍｍｕ ｎ， ４ ：４ ． ０３ ０
（ 一）宋内氏菌大质粒基因库的构建 ｐＢ 经双酶切法制备的载体两臂与 ３－５ｋ Ｊ８ ０ ０ｂ的Ｓ ｏｎｉ 大质粒片段连结，经体外包装 ．ｎｅＳ３ ｓ ６ 系统形成噬菌体颗粒感染受体菌 ＨＢ０，用氨节抗性筛选出含大质粒 ＤＮ １１ Ａ片段的重组子 ２０ ７ 多个．重组质粒大小约 ５ｋ ，符合 ｃｓ ｉ ０ｂ ｏｍｄ载容范围．按公式计算如果插人外源 Ｄ Ａ片段大小 Ｎ 为３－５ｋ ，则 １ ５ ０ ０ｂ ４ －２ 个重组子将有 ”％的机率包含所有的大质粒ＤＮ Ａ片段，我们得到的 重组子远超过此数，证明成功地构建了宋内氏大质粒的基因库． （ ｐ 阳性盆组子的筛选 二）ｉ ａ 用４ ｋ ， ｋ ． ｂ １ ｂ的 ｉ 相关基因探针和 １ ｋＦ基因探针与重组子进行菌落原位杂交，阳性 ｌ ７ ｐ ａ ．ｂ Ｏ 株中 含有与痢疾菌侵袭相关基因同源的Ｄ ＮＡ片段，共得到 １个探针杂交阳性的克隆子． ３ （ 三）皿组子的蛋白表达 用感染痢疾菌的猴恢复期血清对重组子进行 Ｗｅ ｅ ｂ ｔ ｓｒ ｌ 分析．重组子 （Ｈ ９ ｔ ｎ ｏ Ｓ ２）表达了与
ＳＨ ２ ９
特
性
来 ，ｒ ｙ ０ ｅｎ ｅ＇ ｓ
Ｆ， 一ｒ Ａ － －ｒＭＢ ｅ 一Ａ Ｂ ｃ
Ａ｀ ｐ 表达Ｉａ ， ， ， ｐＡ ＢＣＤ ，
Ａ ｀ ． ｂ ｍｄ ｐ ５ ｋ ｃｓ ｉ ， ｏ ４ Ａ ｀ Ｆａ Ｐ ２ ， 含 大质粒 ｌｂ Ｆ片段 ｋ的 Ｔ ＇ｍ 含 Ｓ ｏｎｔ ４ ｋ ｉ 基因片段 ｃ ‘ ． ｎｅ的 ． ｂ Ｃ ｓ １ ｐ ａ Ａｒ Ｖ 氏５ 的 １ｋｉ 基因片段 ， 含福 ｂ ７ｂ ａ ｐ
２ ．ｋｂ ３ １
１ｋ ５ ｂ
９４ ｂ ．ｋ ６６ ｂ ． ｋ
４４ ｂ ．ｋ
２３ ｂ ． ｋ
２ｄ ｂ ．ｋ
图 １ 重组质粒酶切分析 １Ａ Ｎ ． Ａ经 Ｈｉ １醉切作为分子蚤标准； Ｄ ｎ１ ｄ １ ２ ． ． ａ Ｓ ２， ９ 质粒分别经 Ｓｌ －５ Ｓ３ Ｆ ， ９ Ｄ １ ６ ２ Ｈ Ｈ ａＩ 酶切．
体 菌涂于含Ａ 的培养基上， ｐ 培养过夜， 长出 的菌落即为含有外源Ｄ Ａ片 Ｎ 段的重组子． 所用包 装蛋白 包装效率为２ １ ｆ／ Ｄ Ａ’ 外包装 Ｘ０ ｕ Ａ Ｎ ．体 丫 ｕ ｇ 和转导均按文献进行 （ ６ ）
（ 五）探针标记及菌落原位杂交
寡核昔酸引物法同位素标记分 别位于ｐ Ｗ６６ Ｒ ７ Ｈ ２ 和ｐ Ｍ１上的４ ｋ 及 １ ｂ ｐ 基因片 ． ｂ ７ 的ｉ １ ｋ ａ 段以 ＭＹ Ｈ ５３ ． ｂ 片 及ｐ Ｓ ６ 的１ｋＦ 段作为 ０ Ｏ 探针 （ 基因 ｐ 的 Ｆ 对Ｉａ 表达起正调控作用） 菌落原位杂 ．
酶法检测阳性蛋白带。具体操作见文献 〔） １， （ 七）皿组质粒陇切及 Ｓｕ ｅｎ 分析 ｏｔ ｒ ｂ ｔ ｈ ｌ ｏ 重组质粒经 Ｓｌ酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为０ ％，电泳后转移到硝酸纤维素膜 ａ ｔ ． ７