第五章-4 高等植物基因工程-10.8
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8 高等植物基因工
• 图 T-DNA 从农杆菌的Ti 质粒转移到植物细胞中，接着TDNA 整合到细胞核基因组中进行表达，对宿主细胞进行 遗传转化。
Ti质粒诱导植物生瘤的机理
• 图8-3
• 1、信号分子的激活作用，virD基因编 码的一种核酸内切酶, • 2、先在T-DNA的RB序列中的第3和第4 碱基之间切开一个单链缺口,
• 由根瘤土壤杆菌的染色体基因组编码的，其表达产物的功能是使细菌 细胞结合到感染植物的创伤部位。
8.2 高等植物的基因转移系统
• Ti质粒简介（tumor-inducing）
• 1、一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子，约200-800kb
• 2、存在于根瘤土壤杆菌细胞中
• 3、它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体。Ti是英文肿 瘤诱发的缩略式。
Ti质粒的分子结构－－Vir区结构
• virD基因
• 编码一种核酸内切酶，先在T-DNA的RB序列中的第3和第4 碱基之间切开一个单链缺口，随后在T-DNA同一条链的LB
序列中切出第二个单链缺口。于是T-DNA便以单链形式释 放出来，并在RB序列的引导下定向地从根瘤土壤杆菌细胞 转移到寄主植物细胞。这条转移的单链T-DNA特称为T-链。
物细胞核中，占Ti质粒DNA总长度的10％左右，
在T-DNA上的基因控制的。
Ti质粒有可能用作植物基因克隆 的载体
图 在Ti 质粒的两端，T-DNA 有两个几乎完全相同的25bp 的重复。右端重复对于TDNA 的转移和整合是必需的。T-DNA 与植物基因组中的右接口拼接相当精确，右边接 口保留有1-2bp 的右端重复，但左边接口处序列变化较大，有大约100bp 以内的序列来
8.2 高等植物的基因转移系统－Ti质粒
基因工程及其应用【可编辑PPT】
E. coli B含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
当λ(k)噬菌体侵染E. coli B时，由于其DNA中 有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E. coli B的DNA中虽然也存在这种特异序列， 但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫 氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特 定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲 基化的序列。
基因重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因 与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受 体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或 新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
供体、受体和载体是重组DNA技术的三大基本元件。
基因工程的目的：
分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 大规模生产生物活性物质 设计、构建生物的新性状甚至新物种
反应必须ＡＴＰ和Ｍｇ２＋，具有特异性识别部位 并切割。 如EcoR I、Hinf III III 型限制酶的基本特点：
可以识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端2426bp处切开DNA，切割位点没有特异性。
2、限制性核酸内切酶的命名原则
第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一 个字母。 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、 二个字母。 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。
⑶核酸内切限制酶对生物基因组的消化作用
小分子量的片断-----少 （电泳-容易分离目的片 断）cheria coli RY13的第一个限制
酶。
3、限制性内切酶作用后的断裂方式
形成粘性末端； 形成平末端；
粘性未端：切开后的两段DNA各留下一个尾，这2 个尾的核苷酸顺序完全一样，方向相反。它们之 间是互补的，在适当条件下可以再连接一起。
高等植物基因工程PPT课件
细胞中。
辅助Ti质粒
微型Ti质粒
2019/12/5
14
根癌农杆菌转化的一般步骤
转化程序 （1）选择外植体
叶片、子叶、胚轴、… 选择转化能力较强幼期外植体 最佳感受态时期 外植体易于组培，再生 外植体要暴露分生组织细胞，增加农杆菌
与分生组织细胞接触面。
HE Wenxing
UN2IV0E1R9S/IT1Y2/O5F Jinan
2019/12/5
2
Ti质粒（Tumor induced plasmid）
T-DNA
ห้องสมุดไป่ตู้
25 bp 重复区
Vir
分裂素
Opine 合成
25 bp 重复区
Ti 质粒 tra
(160-250 kb)
分解
Rep
tra
2019/12/5
3
T-DNA
T-DNA长约23kb （ 15kb-30kb ） ，共 有三套基因：
15
（2）共培养
农杆菌溶液接种到外植体损伤切面浸泡一段时间。然后洗 掉非伤面菌液转到培养基上共培养（将接种农杆菌的外植体 置于诱导培养基上，此时农杆菌随外植体的细胞分裂而繁殖 并进行侵染，T-DNA转移整合，此过程叫共培养）。
植物中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了一 元载体系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分 子重组操作的困难。
HE Wenxing
UN2IV0E1R9S/IT1Y2/O5F Jinan
9
用于植物基因转化的Ti质粒载体系统
一元载体系统/共整合载体系统 双元载体系统
HE Wenxing
c. Ti质粒过大，重组操作非常困难，也很难找到单一的 酶切位点。
辅助Ti质粒
微型Ti质粒
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根癌农杆菌转化的一般步骤
转化程序 （1）选择外植体
叶片、子叶、胚轴、… 选择转化能力较强幼期外植体 最佳感受态时期 外植体易于组培，再生 外植体要暴露分生组织细胞，增加农杆菌
与分生组织细胞接触面。
HE Wenxing
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2
Ti质粒（Tumor induced plasmid）
T-DNA
ห้องสมุดไป่ตู้
25 bp 重复区
Vir
分裂素
Opine 合成
25 bp 重复区
Ti 质粒 tra
(160-250 kb)
分解
Rep
tra
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3
T-DNA
T-DNA长约23kb （ 15kb-30kb ） ，共 有三套基因：
15
（2）共培养
农杆菌溶液接种到外植体损伤切面浸泡一段时间。然后洗 掉非伤面菌液转到培养基上共培养（将接种农杆菌的外植体 置于诱导培养基上，此时农杆菌随外植体的细胞分裂而繁殖 并进行侵染，T-DNA转移整合，此过程叫共培养）。
植物中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了一 元载体系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分 子重组操作的困难。
HE Wenxing
UN2IV0E1R9S/IT1Y2/O5F Jinan
9
用于植物基因转化的Ti质粒载体系统
一元载体系统/共整合载体系统 双元载体系统
HE Wenxing
c. Ti质粒过大，重组操作非常困难，也很难找到单一的 酶切位点。
3_基因工程的基本条件
OH-A-C-G-T-C-C-T-C
…
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 3‘ 5’
P OH
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G …
3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 3‘
5‘ … G-C-T-G-OH
3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-P 3‘ 5’
Klenow
P-A-A-T-T-C-G-A-G
OH-G-C-T-C
…
…
dATP dTTP
P-A-A-T-T-C-G-A-G OH-T-T-A-A-G-C-T-C
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH 3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-P 3‘ 5’
识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G …
3‘ … C G A C T T A A G C T C … 3’
EcoRI等产生的5‘粘性末端 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 3‘
3’ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 3‘
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C … 3‘ P OH nick 5’
关于植物基因工程课件
第一节 植物基因的克隆与分离
一、根据基因的功能分离目的基因 从蛋白到DNA
一种比较有效的分离高等植物基因的策略， 它涉及目的基因编码产物蛋白质的分离、纯化 及突变体表型的互补克隆。
在纯化相应的编码蛋白后，构建cDNA或基因组， DNA中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行：
(1) 将纯化的蛋白质进行氨基酸测序
转基因植物(Transgene plant)是拥有来自其 他物种基因的植物。该基因变化过程可以来自 不同物种之间的杂交，但现在该名词更多的特 指那些在实验室里通过重组DNA技术人工插 入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物。
第一节 植物基因的克隆与分离 第二节 植物基因工程研究常用的基因 第三节 植物基因转移的病毒载体 第四节 植物基因转移的质粒载体 第五节 植物基因转化方法 第六节 转基因植物的检测鉴定
三、根据DNA的插入作用分离目的基因
当一段特定的DNA序列，插入到植物基因组中目的基因的 内部或其邻近位点时，便会诱发该基因发生突变，并最终导 致表型变化，形成突变体植株。如果此段DNA插人序列是 已知的，那么它便可用来作为DNA杂交因A序列相 当于人为地给目的基因加上一段已知的序列标签，因此 DNA插入突变分离基因的技术，又叫做DNA标签法(DNAtagDgiNnAg)标。签法克隆植物组织中的基因是较为常用的一种方 法，T-DNA（T-DNA tagging）和转座子（transposon tagging）均可作为基因标签。
1.转座子标签法（Transposon tagging）
转座的结果是使被转入的基因失活，从而有效地诱导产生 表型突变株。然后构建一个对应于突变株的基因库，用作标 签的转座子作为探针从基因库中筛选相对应的克隆，分离得 到相对应于变异的基因，这就是转座子标签克隆基因。
基因工程转基因植物PPT课件
。操作简便、成本低。
1.2.2 载体介导转移系统
最常见的转基因方法,具体方法有农杆菌介导法、 病毒介导法等。
将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外 源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复 制和表达。
农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(rootindcing plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最 多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。
农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中 。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外 源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生 出转基因植株。
关键特征:主要适用于双子叶植物和祼子植物 实例: 农杆菌转化法示意图：
到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数 禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上获得转基因 植株。
(3) 微注射法
细胞操作：
利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方 式将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将 供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。
子房注射法或花粉管通道法： 具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作
Ti Plasmid
T-DNA region
auxin
Left border
Right border
vir genes oriቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
已知农杆菌 附着到植物 细胞后，只 留在细胞间 隙中。TDNA首先在 细菌中被加 工、剪切、 复制，然后 转入植物细 胞。
（2） Ti质粒的功能区域
※ T-DNA区（transferred-DNA regions）： 农 杆 菌 侵 染 植 物 细 胞 时 ， 从 Ti 质 粒 上 切 割 下 来 转 移 到 植 物 细 胞 的 一 段 DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。
1.2.2 载体介导转移系统
最常见的转基因方法,具体方法有农杆菌介导法、 病毒介导法等。
将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外 源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复 制和表达。
农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(rootindcing plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最 多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。
农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中 。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外 源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生 出转基因植株。
关键特征:主要适用于双子叶植物和祼子植物 实例: 农杆菌转化法示意图：
到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数 禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上获得转基因 植株。
(3) 微注射法
细胞操作：
利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方 式将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将 供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。
子房注射法或花粉管通道法： 具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作
Ti Plasmid
T-DNA region
auxin
Left border
Right border
vir genes oriቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
已知农杆菌 附着到植物 细胞后，只 留在细胞间 隙中。TDNA首先在 细菌中被加 工、剪切、 复制，然后 转入植物细 胞。
（2） Ti质粒的功能区域
※ T-DNA区（transferred-DNA regions）： 农 杆 菌 侵 染 植 物 细 胞 时 ， 从 Ti 质 粒 上 切 割 下 来 转 移 到 植 物 细 胞 的 一 段 DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。
植物基因工程课件ppt
微管注射法
利用显微操作技术将外源 基因直接注入植物细胞， 实现基因转移。
基因表达与调控
启动子选择
选择合适的启动子，以调 控外源基因在植物中的表 达水平。
转录因子应用
利用转录因子调控植物基 因的表达，实现植物性状 的改进。
表观遗传修饰
通过DNA甲基化、组蛋白 修饰等手段，调控植物基 因的表达。
基因编辑技术
植物基因工程课件
汇报人： 202X-12-30
目录
• 植物基因工程简介 • 植物基因工程基本技术 • 植物基因工程应用 • 植物基因工程面临的挑战与前景 • 案例分析
01
植物基因工程简介
Chapter
定义与特点
定义
植物基因工程是利用重组DNA技术 对植物基因进行操作和修饰的一门科 学。
特点
具有高度精确性和可操作性，可以实 现植物性状的定向改进，提高抗逆性 、产量和品质等。
转基因玉米的研发与应用
总结词
转基因玉米是利用基因工程技术改进玉米性状，提高产量、抗逆性和品质的玉米新品种 。
详细描写
转基因玉米的研发主要针对抗虫、抗病、抗旱等性状进行改进。通过导入外源抗虫基因 和植酸酶基因等，转基因玉米表现出较好的抗虫性和产量。同时，转基因玉米还具有较 好的耐旱、耐盐碱等特性，能够适应不同环境条件下的生长。转基因玉米的应用提高了
安全性问题
对生态环境的影响
转基因植物可能成为入侵物种，破坏生态平衡。
对非目标生物的影响
转基因植物可能产生抗药性，影响农药效果。
食品安全问题
转基因食品的安全性尚未得到充分验证，可能对人体健康产生潜 伏风险。
法规与伦理问题
国际法规不统一
各国对转基因技术的法规和监管标准不统一，导致跨国合作困难。
植物遗传工程 五.高等植物遗传工程的载体
能， 而另一些则没有。 现在我们可以得到一 些在根癌农杆菌 中行使功能
了植物细胞的代谢， 以使其适合于细菌的需要。 感染 后的植物细胞的另一个非常重要的特征是它们可以在 无激素的培养基上生长， 而正常的植物细胞在培养时，
现和选出与 Ｔ 质粒或 Ｔ Ｄ Ａ结合的细胞。此外 ， ｉ －Ｎ 还
的不同的转座子 （ａｓ ｓ ） ｔｎｐ ｏ ，并可将它们插人到 Ｔ ｒ ｏｎ － Ｄ Ａ的不同位点上， Ｎ 特别是转座子Ｔ ７ ｎ 在这方面是非 常有效的。应用转座子突变技术可使Ｔ Ｄ Ａ用许多 －Ｎ
高我们所希 望的遗传性得到修 饰的 个体的频率。
这是一个十分吸引人的方法， 因为有很多与Ｔ Ｖ类似 Ｍ 的病毒， 它们有着广泛的寄主范围， 不仅可以感染双子 叶植物， 也可感染单子叶植物。 目前这个工作进展不
大。 现在 已经能够使 Ｔ Ｖ的 Ｒ Ａ经反转录 得到双链 Ｍ Ｎ
有关Ｔ 质粒的研究目前十分活跃， ｉ 它很有可能成
术分析这个修饰过的Ｄ Ａ了。用这个修饰过的Ｄ Ａ Ｎ Ｎ 为模板， 在一定的酶的作用下合成新的相应 的Ｒ Ａ Ｎ， 这个新的 Ｒ Ａ便包含了我们希望的基因。 这个新的 Ｎ
Ｒ Ａ 以在植 物体系中复制， Ｎ 可 但失去了原有的致病力。
我们要求把这个外源基因插人到最好的位置上，并且 要求用最好的方法处置包含这种修饰过的Ｄ Ａ的植 Ｎ 株， 以便使它能通过减数分裂而保持稳定的表型， 并提
基， Ｍ Ｔ Ｖ的 Ｒ Ａ用来作 为核糖体翻译的休系 ， Ｎ 这样在 Ｒ Ａ的末端就有了一个新的密码。Ａ Ａ编码 赖氨酸 。 Ｎ Ａ 这样 ， 加上一 个多聚 Ａ的尾巴后， 在 就可以得到 由赖氨
使它有可能在细菌里克隆。 作法是用Ｓｌ ａＩ 切细菌质粒 ｐＲ２（ Ｂ３２也只有一个切点）同时将ＣＭ ， ａ Ｖ也用Ｓｌ ａＩ 切，
了植物细胞的代谢， 以使其适合于细菌的需要。 感染 后的植物细胞的另一个非常重要的特征是它们可以在 无激素的培养基上生长， 而正常的植物细胞在培养时，
现和选出与 Ｔ 质粒或 Ｔ Ｄ Ａ结合的细胞。此外 ， ｉ －Ｎ 还
的不同的转座子 （ａｓ ｓ ） ｔｎｐ ｏ ，并可将它们插人到 Ｔ ｒ ｏｎ － Ｄ Ａ的不同位点上， Ｎ 特别是转座子Ｔ ７ ｎ 在这方面是非 常有效的。应用转座子突变技术可使Ｔ Ｄ Ａ用许多 －Ｎ
高我们所希 望的遗传性得到修 饰的 个体的频率。
这是一个十分吸引人的方法， 因为有很多与Ｔ Ｖ类似 Ｍ 的病毒， 它们有着广泛的寄主范围， 不仅可以感染双子 叶植物， 也可感染单子叶植物。 目前这个工作进展不
大。 现在 已经能够使 Ｔ Ｖ的 Ｒ Ａ经反转录 得到双链 Ｍ Ｎ
有关Ｔ 质粒的研究目前十分活跃， ｉ 它很有可能成
术分析这个修饰过的Ｄ Ａ了。用这个修饰过的Ｄ Ａ Ｎ Ｎ 为模板， 在一定的酶的作用下合成新的相应 的Ｒ Ａ Ｎ， 这个新的 Ｒ Ａ便包含了我们希望的基因。 这个新的 Ｎ
Ｒ Ａ 以在植 物体系中复制， Ｎ 可 但失去了原有的致病力。
我们要求把这个外源基因插人到最好的位置上，并且 要求用最好的方法处置包含这种修饰过的Ｄ Ａ的植 Ｎ 株， 以便使它能通过减数分裂而保持稳定的表型， 并提
基， Ｍ Ｔ Ｖ的 Ｒ Ａ用来作 为核糖体翻译的休系 ， Ｎ 这样在 Ｒ Ａ的末端就有了一个新的密码。Ａ Ａ编码 赖氨酸 。 Ｎ Ａ 这样 ， 加上一 个多聚 Ａ的尾巴后， 在 就可以得到 由赖氨
使它有可能在细菌里克隆。 作法是用Ｓｌ ａＩ 切细菌质粒 ｐＲ２（ Ｂ３２也只有一个切点）同时将ＣＭ ， ａ Ｖ也用Ｓｌ ａＩ 切，
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冠瘿碱合成区 ：参与冠瘿碱合成； 冠瘿碱代谢区 ：参与冠瘿碱分解； 毒性区(Vir区) ：参与T-DNA转移、插入植物染色体。
tms left border tmr
T-DNA T-DNA
tmt right border
Ti plasmid
Vir区 opine 代谢区
ori
Ti 质粒致瘤的分子机制
O CH 3 C
度生长素、无分裂素
的固体培养基上，使
其根部发育。
5）3周后，将之移植 于土壤中，长成整株 植物。
农杆菌介导法、基因枪法回顾
5、植物基因工程中的选择标记和报告基因
1）植物基因工程中的选择标记：
新霉素抗性基因（neor）
庆大霉素抗性基因（gentr） 潮霉素磷酸转移酶基因（hpt） 膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）
四、高等植物基因工程
高等植物的遗传学特征 高等植物基因工程的基本概念
高等植物的基因转移系统
高等植物的基因表达系统
（一）高等植物的遗传学特征
植物的基本特征
遗传操作的简易性
整株植物的再生性 染色体的多倍体性
1、植物的基本特征
植物
低等植物
无根、茎、叶等分化器官
合子不经胚直接发育为个体
高等植物
含根、茎、叶、花、果分化器官
170万公顷发展至1.34亿公顷，14年间增长79倍。
最常见的转基因作物是转基因大豆、棉花、
玉米、油菜，其中转基因大豆占全球大豆种植总 面积的72%，转基因棉花占全球棉花种植总面积 的47%。
（三）高等植物的基因转移系统
根癌农杆菌介导的Ti质粒转化法 植物病毒介导的转染
植物细胞的直接转化
植物原生质体的再生 植物基因工程中的选择标记和报告基因
4、染色体的多倍体性
很多高等植物拥有比人类更大的基因组，
并以多倍体形式存在。
大约2/3的禾本科植物呈多倍体型，染色体 数目24-144。 多倍体植物在组织培养过程中呈现较高的 遗传不稳定性，导致体细胞变异。
（二）高等植物基因工程的基本概念
高等植物基因工程
高等植物转基因技术
高等植物细胞基因表达技术 植物工程细胞
中高效表达，被广泛用于构建转基因植株。
在高等植物基因工程中，外源基因的 时空特异性表达尤为重要，因为很多外源 基因的表达产物对植物早期的生长、发育
有影响，甚至会致死植株。
高等植物的基因表达系统
外源基因的四环素诱导系统 外源基因的乙醇诱导系统 外源基因的地塞米松诱导系统 外源基因的类固醇诱导系统
1、外源基因的四环素诱导系统
2）将原生体悬浮液滴
在无菌滤纸片上，置于
含普通植物细胞（滋养
细胞）的固体再生培养
基表面。
原生质体不直接接
触滋养细胞，但可吸收
其分泌扩散的植物生长
因子及其它化合物。
3）培养2-3周后，
将滤纸上的植物细
胞蔟转移至含高浓
度分裂素、低浓度
生长素的固体培养
基上，继续培育2-
4周，滤 纸片上 便
长出嫩芽。
4）将嫩芽置于含低浓
大规模生产蛋白多肽药物
转基因植株
改良农作物遗传性状
高等植物基因工程的发展历程
1983：美国和比利时科学家首次将外源基因导入 烟草和胡萝卜； 1994：世界上第一种耐储藏番茄在美国批准上市； 1995：转基因抗虫、抗除草剂玉米和棉花在美国 投入生产； 2000：美国转基因大豆的种植面积首次超过普通 大豆。
两种常用的植物病毒载体： 花椰菜花叶病毒(CaMV)：双链DNA病毒 双生病毒(Geminivirus)：单链DNA病毒
利用植物病毒载体转化植物细胞的战略：
转染植物细胞原生质体 转染植物组织
1）转染植物细胞原生质体
以双链DNA病毒花椰菜花叶病毒(CaMV)
基因组为载体，去除有关的致病基因，换上外
构建的转基因植株再生效率高；
外源基因在整合入植物基因组中后，不发生修 饰改变（如基因重排）。
农杆菌介导的Ti质粒转化法的缺点：
转入的外源基因拷贝数低，大多数为单拷贝。
宿主局限性，主要用于双子叶植物的遗传转化。
农杆菌极少能感染单子叶植物，一些重要的 农作物（如水稻、小麦、玉米等）对其不敏感。
根癌农杆菌介导的Ti质粒转化法是 目前转基因植物最常用的方法，80%的
Tc-on型四环素诱导系统
TetR
CaMV 35S P E.coli tetR Plant nos T
四环素阻遏蛋白基因表达盒
tet操作子 CaMV 35S P
-葡萄糖苷酸酶基因GUS
Plant nos T
四环素诱导型报告基因表达盒 四环素 显色反应
tet操作子 CaMV 35S P
GUS
Plant nos T
所有涉及植物原生质体的转化方法（农杆菌
介导法、植物病毒转化法、电穿孔法、多聚物介
导法）均存在一个难题：原生质体很难再生出整
株植物。
原生质体的再生效率在植物转基因技术中至 关重要。
植物原生质体的再生程序
1）将植物嫩叶、幼 芽或愈伤组织切成 碎片，浸入含纤维 素酶的缓冲液中保
温，悬浮物离心去
除细胞碎片。
原因：冠瘿碱的合成大量消耗精氨酸、谷氨酸，
影响植物细胞的生长。
3）除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地
缩短载体长度。
4）安装E.coli复制子，使其能在E.coli中复制，以 利于克隆操作。 5）安装植物细胞筛选标记（如新霉素抗性基因 neor）、植物基因启动子、polyA化信号序列。 6）安装MCS，以利于外源基因的克隆。
将外源基因克隆在
外源基因
植物细胞筛选标记 Kmr
大肠杆菌-农杆菌
穿梭质粒的T-DNA区； LB 转化携带Ti辅助质粒 (只含vir区、不含 T-DNA区)的农杆菌； 重组农杆菌
大肠杆菌ori
农杆菌筛选标记
T-DNA
大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒
RB
农杆菌ori
大肠杆菌筛选标记
感染植物细胞。
重组农杆菌转化植物的方法：
T-DNA T-DNA
素(cytokinin)的酶系； tmt：编 码 合 成 冠 瘿 碱
ori
(opine)的酶系。
植物生长素、细胞分裂素：促使植物创伤组织无 限制生长与分裂，形成冠瘿瘤。
冠瘿碱：代谢物为氨基酸和糖类，是根癌农杆菌
生长必需的物质。
Ti质粒的功能区：
致瘤区 ：合成植物生长素、细胞分裂素；
T-DNA插入植物基因组中，随其复制而复制。
Ti质粒的结构：
160-240 kb T-DNA：12-24 kb tms：编码合成植物生长 素(auxin)的酶系； tmr：编码合成细胞分裂
Ti plasmid
Vir区 opine 代谢区
tms
left border
tmr
tmt
right border
2）植物基因工程中的报告基因：
-葡萄糖苷酸酶基因（gus）
胭脂碱和章鱼碱
氯霉素乙酰转移酶基因（cat ） 荧光素酶基因（luc） 绿色荧光蛋白基因（gfp）
（四）高等植物的基因表达系统
启动子是决定基因表达部位、时间、强度 的主要调控元件。 花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子能在 许多植物物种、几乎所有发育阶段、所有组织
合子经胚再发育为个体
藻类、地衣
苔藓门、蕨类门、裸子门、被子门
2、遗传操作的简易性
多数高等植物有自我授精的遗传特征， 能产生大量的后代；借助于如风、重力、昆 虫传播等自然条件，授精范围广、速度快、 效率高，即便是频率极低的基因突变和重组
事件，其遗传后果也易被观察。
3、整株植物的再生性
愈伤组织：植物损伤后，在伤口长出的软组织。 将一小片鲜嫩的愈伤组织置于含合适营养和 植物生长激素的组织培养基中，细胞会持续生长 并分裂。将这些细胞涂在特定固体培养基上，会 长出新的幼芽，并重新分化成叶、根、茎，最终 成为整株开花植物。
源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转 染植物细胞原生质体，由此再生成整株植物。
花椰菜花叶病毒载体：
1）即使切除基因组中的非必需序列，其承载外 源基因的能力还是有限，只能插入很小的片段。 2）宿主范围非常窄，主要是芸苔属植物，如芜 菁、甘蓝、花椰菜等。
2）转染植物组织
植物双生病毒(Geminiviruses)为单链DNA病毒，
转基因技术虽然只有27年的历史，但所涉及 的作物种类甚多。 包括：水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯
、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜
菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜
、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄
子、梨、苹果、葡萄。
至2009年底，全球已有25个国家批准了24种
转基因作物的商业化种植，种植面积由1996年的
Vir产物 T-DNA单链
产物与单链T-DNA结合成复合
物，后者转化植物根部细胞。
LB
RB
T-DNA
Vir 乙酰丁香酸、 羟基乙酰丁香酸
Ti质粒
Opine
诱导表达
特异性核酸内切酶
T-DNA LB RB 在LB和RB的第3、4个碱基之间切开
单链T-DNA整合于植物基因组上
Ti 质粒的改造
1）除去T-DNA上的生长素和分裂素生物合成 基因(tms和tmr)。 原因：大量的生长素和分裂素会抑制细胞再生 为整株植物。 2）除去T-DNA上的冠瘿碱生物合成基因(tmt)。
成熟病毒呈双颗粒状，每个颗粒中含一条不同的
DNA单链。
A链能单独在植物细胞中复制，含一部分病毒包
衣蛋白基因；B链含另一部分包衣蛋白基因及感染性
基因。A、B两条链必须同处于一个植物细胞中，方
tms left border tmr
T-DNA T-DNA
tmt right border
Ti plasmid
Vir区 opine 代谢区
ori
Ti 质粒致瘤的分子机制
O CH 3 C
度生长素、无分裂素
的固体培养基上，使
其根部发育。
5）3周后，将之移植 于土壤中，长成整株 植物。
农杆菌介导法、基因枪法回顾
5、植物基因工程中的选择标记和报告基因
1）植物基因工程中的选择标记：
新霉素抗性基因（neor）
庆大霉素抗性基因（gentr） 潮霉素磷酸转移酶基因（hpt） 膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）
四、高等植物基因工程
高等植物的遗传学特征 高等植物基因工程的基本概念
高等植物的基因转移系统
高等植物的基因表达系统
（一）高等植物的遗传学特征
植物的基本特征
遗传操作的简易性
整株植物的再生性 染色体的多倍体性
1、植物的基本特征
植物
低等植物
无根、茎、叶等分化器官
合子不经胚直接发育为个体
高等植物
含根、茎、叶、花、果分化器官
170万公顷发展至1.34亿公顷，14年间增长79倍。
最常见的转基因作物是转基因大豆、棉花、
玉米、油菜，其中转基因大豆占全球大豆种植总 面积的72%，转基因棉花占全球棉花种植总面积 的47%。
（三）高等植物的基因转移系统
根癌农杆菌介导的Ti质粒转化法 植物病毒介导的转染
植物细胞的直接转化
植物原生质体的再生 植物基因工程中的选择标记和报告基因
4、染色体的多倍体性
很多高等植物拥有比人类更大的基因组，
并以多倍体形式存在。
大约2/3的禾本科植物呈多倍体型，染色体 数目24-144。 多倍体植物在组织培养过程中呈现较高的 遗传不稳定性，导致体细胞变异。
（二）高等植物基因工程的基本概念
高等植物基因工程
高等植物转基因技术
高等植物细胞基因表达技术 植物工程细胞
中高效表达，被广泛用于构建转基因植株。
在高等植物基因工程中，外源基因的 时空特异性表达尤为重要，因为很多外源 基因的表达产物对植物早期的生长、发育
有影响，甚至会致死植株。
高等植物的基因表达系统
外源基因的四环素诱导系统 外源基因的乙醇诱导系统 外源基因的地塞米松诱导系统 外源基因的类固醇诱导系统
1、外源基因的四环素诱导系统
2）将原生体悬浮液滴
在无菌滤纸片上，置于
含普通植物细胞（滋养
细胞）的固体再生培养
基表面。
原生质体不直接接
触滋养细胞，但可吸收
其分泌扩散的植物生长
因子及其它化合物。
3）培养2-3周后，
将滤纸上的植物细
胞蔟转移至含高浓
度分裂素、低浓度
生长素的固体培养
基上，继续培育2-
4周，滤 纸片上 便
长出嫩芽。
4）将嫩芽置于含低浓
大规模生产蛋白多肽药物
转基因植株
改良农作物遗传性状
高等植物基因工程的发展历程
1983：美国和比利时科学家首次将外源基因导入 烟草和胡萝卜； 1994：世界上第一种耐储藏番茄在美国批准上市； 1995：转基因抗虫、抗除草剂玉米和棉花在美国 投入生产； 2000：美国转基因大豆的种植面积首次超过普通 大豆。
两种常用的植物病毒载体： 花椰菜花叶病毒(CaMV)：双链DNA病毒 双生病毒(Geminivirus)：单链DNA病毒
利用植物病毒载体转化植物细胞的战略：
转染植物细胞原生质体 转染植物组织
1）转染植物细胞原生质体
以双链DNA病毒花椰菜花叶病毒(CaMV)
基因组为载体，去除有关的致病基因，换上外
构建的转基因植株再生效率高；
外源基因在整合入植物基因组中后，不发生修 饰改变（如基因重排）。
农杆菌介导的Ti质粒转化法的缺点：
转入的外源基因拷贝数低，大多数为单拷贝。
宿主局限性，主要用于双子叶植物的遗传转化。
农杆菌极少能感染单子叶植物，一些重要的 农作物（如水稻、小麦、玉米等）对其不敏感。
根癌农杆菌介导的Ti质粒转化法是 目前转基因植物最常用的方法，80%的
Tc-on型四环素诱导系统
TetR
CaMV 35S P E.coli tetR Plant nos T
四环素阻遏蛋白基因表达盒
tet操作子 CaMV 35S P
-葡萄糖苷酸酶基因GUS
Plant nos T
四环素诱导型报告基因表达盒 四环素 显色反应
tet操作子 CaMV 35S P
GUS
Plant nos T
所有涉及植物原生质体的转化方法（农杆菌
介导法、植物病毒转化法、电穿孔法、多聚物介
导法）均存在一个难题：原生质体很难再生出整
株植物。
原生质体的再生效率在植物转基因技术中至 关重要。
植物原生质体的再生程序
1）将植物嫩叶、幼 芽或愈伤组织切成 碎片，浸入含纤维 素酶的缓冲液中保
温，悬浮物离心去
除细胞碎片。
原因：冠瘿碱的合成大量消耗精氨酸、谷氨酸，
影响植物细胞的生长。
3）除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地
缩短载体长度。
4）安装E.coli复制子，使其能在E.coli中复制，以 利于克隆操作。 5）安装植物细胞筛选标记（如新霉素抗性基因 neor）、植物基因启动子、polyA化信号序列。 6）安装MCS，以利于外源基因的克隆。
将外源基因克隆在
外源基因
植物细胞筛选标记 Kmr
大肠杆菌-农杆菌
穿梭质粒的T-DNA区； LB 转化携带Ti辅助质粒 (只含vir区、不含 T-DNA区)的农杆菌； 重组农杆菌
大肠杆菌ori
农杆菌筛选标记
T-DNA
大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒
RB
农杆菌ori
大肠杆菌筛选标记
感染植物细胞。
重组农杆菌转化植物的方法：
T-DNA T-DNA
素(cytokinin)的酶系； tmt：编 码 合 成 冠 瘿 碱
ori
(opine)的酶系。
植物生长素、细胞分裂素：促使植物创伤组织无 限制生长与分裂，形成冠瘿瘤。
冠瘿碱：代谢物为氨基酸和糖类，是根癌农杆菌
生长必需的物质。
Ti质粒的功能区：
致瘤区 ：合成植物生长素、细胞分裂素；
T-DNA插入植物基因组中，随其复制而复制。
Ti质粒的结构：
160-240 kb T-DNA：12-24 kb tms：编码合成植物生长 素(auxin)的酶系； tmr：编码合成细胞分裂
Ti plasmid
Vir区 opine 代谢区
tms
left border
tmr
tmt
right border
2）植物基因工程中的报告基因：
-葡萄糖苷酸酶基因（gus）
胭脂碱和章鱼碱
氯霉素乙酰转移酶基因（cat ） 荧光素酶基因（luc） 绿色荧光蛋白基因（gfp）
（四）高等植物的基因表达系统
启动子是决定基因表达部位、时间、强度 的主要调控元件。 花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子能在 许多植物物种、几乎所有发育阶段、所有组织
合子经胚再发育为个体
藻类、地衣
苔藓门、蕨类门、裸子门、被子门
2、遗传操作的简易性
多数高等植物有自我授精的遗传特征， 能产生大量的后代；借助于如风、重力、昆 虫传播等自然条件，授精范围广、速度快、 效率高，即便是频率极低的基因突变和重组
事件，其遗传后果也易被观察。
3、整株植物的再生性
愈伤组织：植物损伤后，在伤口长出的软组织。 将一小片鲜嫩的愈伤组织置于含合适营养和 植物生长激素的组织培养基中，细胞会持续生长 并分裂。将这些细胞涂在特定固体培养基上，会 长出新的幼芽，并重新分化成叶、根、茎，最终 成为整株开花植物。
源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转 染植物细胞原生质体，由此再生成整株植物。
花椰菜花叶病毒载体：
1）即使切除基因组中的非必需序列，其承载外 源基因的能力还是有限，只能插入很小的片段。 2）宿主范围非常窄，主要是芸苔属植物，如芜 菁、甘蓝、花椰菜等。
2）转染植物组织
植物双生病毒(Geminiviruses)为单链DNA病毒，
转基因技术虽然只有27年的历史，但所涉及 的作物种类甚多。 包括：水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯
、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜
菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜
、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄
子、梨、苹果、葡萄。
至2009年底，全球已有25个国家批准了24种
转基因作物的商业化种植，种植面积由1996年的
Vir产物 T-DNA单链
产物与单链T-DNA结合成复合
物，后者转化植物根部细胞。
LB
RB
T-DNA
Vir 乙酰丁香酸、 羟基乙酰丁香酸
Ti质粒
Opine
诱导表达
特异性核酸内切酶
T-DNA LB RB 在LB和RB的第3、4个碱基之间切开
单链T-DNA整合于植物基因组上
Ti 质粒的改造
1）除去T-DNA上的生长素和分裂素生物合成 基因(tms和tmr)。 原因：大量的生长素和分裂素会抑制细胞再生 为整株植物。 2）除去T-DNA上的冠瘿碱生物合成基因(tmt)。
成熟病毒呈双颗粒状，每个颗粒中含一条不同的
DNA单链。
A链能单独在植物细胞中复制，含一部分病毒包
衣蛋白基因；B链含另一部分包衣蛋白基因及感染性
基因。A、B两条链必须同处于一个植物细胞中，方