反相色谱法测定有机化合物(精)
反相色谱 吸附色谱
反相色谱和吸附色谱都是常见的色谱分离技术，用于分离和分析化合物。
它们在分离原理、应用领域和操作方法上有所不同。
1. 反相色谱（Reverse Phase Chromatography）：
-分离原理：反相色谱是一种液相色谱技术，它利用固定相为疏水性的非极性物质（如疏水性的碳链）而流动相为极性溶剂的原理进行分离。
样品中的化合物会根据其亲水性与疏水性在固定相上的不同亲和力而发生分离。
-应用领域：反相色谱广泛应用于生物化学、药物分析、食品检测等领域，特别适用于水溶性化合物的分离和分析。
-操作方法：在反相色谱中，固定相通常是疏水性的硅胶或聚合物，流动相是极性溶剂和非极性溶剂的混合物，通过调整流动相的组成和温度来实现不同化合物的分离。
2. 吸附色谱（Adsorption Chromatography）：
-分离原理：吸附色谱是一种液相或固相色谱技术，它利用固定相表面的吸附作用来分离化合物。
样品中的化合物会根据其与固定相表面的吸附力不同而发生分离。
-应用领域：吸附色谱广泛应用于有机化学、天然产物提取、环境分析等领域，特别适用于多种化合物的分离和富集。
-操作方法：在吸附色谱中，固定相通常是多孔性吸附材料，流动相是溶剂或溶剂混合物，通过调整流动相的组成、温度和流速来实现不同化合物的分离。
总的来说，反相色谱和吸附色谱都是重要的色谱分离技术，它们在不同的应用场景中发挥着重要作用，为化学分析和制备提供了有效的手段。
反相高效液相色谱法快速测定梨中7种有机酸含量
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正相色谱和反相色谱
正相色谱和反相色谱正相色谱（Normal Phase Chromatography）正相色谱是一种将物质分离的方法，是一种基于极性差异的液相色谱法。
所谓正相色谱，是因为在正相色谱柱中，填充物通常是一些极性较高的固体相，例如硅胶（silica gel）和氧化铝（alumina）等。
正相色谱柱可以分离无电荷的极性化合物，例如一些羟基化合物和醇类分子。
在正相色谱中，毒理学家可以分离和鉴定一些有机物。
反相色谱（Reverse Phase Chromatography）反相色谱是一种将物质分离的方法，是一种基于亲疏水性质差异的液相色谱法。
所谓反相色谱，是因为在反相色谱柱中，填充物通常是由一个疏水的固体相组成，例如碳颗粒、聚合物等。
反相色谱柱可以分离各种极性分子，例如对有机药物、蛋白质、核酸等进行分离和纯化。
毒理学家可以使用反相色谱技术进行药物开发和毒性评估。
正相色谱和反相色谱之间的不同在正相色谱中，爱保者可以利用样品和固相之间的极性差异来分离和纯化物质。
正相色谱通常用于分离和纯化极性药物和天然产物，如氨基酸，多肽和糖。
在反相色谱中，爱保者利用样品和固相之间的非极性差异来分离和纯化化合物。
反相色谱通常用于分离和纯化疏水药物和天然产物，如脂肪酸，核酸和激素。
正相色谱和反相色谱在毒理学中的应用正相色谱和反相色谱都广泛应用于毒理学，尤其是药物开发和毒性评估。
毒理学家可以利用这些技术来分离和纯化化合物。
毒理学家应用表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）联用反相色谱分离和纯化天然产物，从而破解其分子结构。
结论正相色谱和反相色谱是两种最常用的色谱技术之一，它们是一种高效的分离和纯化化合物的方法。
在毒理学研究和药物开发中，正相色谱和反相色谱可广泛应用。
我们期待在今后研究中看到更多正相色谱和反相色谱的应用，以便更好地了解各种疾病和药物与人体的相互作用。
反相高效液相色谱法
分类
分配色谱（partition chromatography） 吸附色谱(adsorption …) 离子交换色谱(ion exchange …) 尺寸排阻色谱(size exclusion …)又称凝胶色谱
实验目的
1. 学习高效液相色谱仪的操作
2. 了解反相液相色谱法分离非极性化合物的基本原理 3. 掌握用反相液相色谱法分离芳香烃类化合物
2、按下述色谱条件设定色谱仪： 柱温：室温； 流动相流速：A泵：甲醇，0.9 mL/min B泵：蒸馏水，0.1 mL/min 泵最大压力：15 MPa 检测波长：254 nm 时间：6 min
3、根据仪器操作条件，待基线稳定后，分别进标准样品和 未知样品各10uL，获得标准样品和未知样品的谱图。
4、以标准样品谱图为基准，作单点标准曲线，然后求出未 知溶液中苯和萘的浓度。
2.高压定量进样阀（常用）
泵
泵
柱
柱
排放 进样
排放 进样
图 六通进样阀
色谱柱
标准柱型： 4.6mm或 3.9mm L: 15-30cm 填料粒度：5-10m
发展趋势： 填料粒度小 柱径小
装柱技术：干法：填料粒度大于20m时可用。
湿法（匀浆法）：配成悬浮液。高压泵压入 色谱柱，洗净备用
检测系统
K
组分在固定相中物质的浓度 组分在流动相中物质的浓度
Cs Cm
流动相为非极性而固定相为极性物质的色谱称正相液相 色谱法，以流动相为极性而固定相为非极性的色谱称反相液 相色谱法。将固定液键合到硅胶表面上，即所谓的键合固定 相。若将正构烷烃等非极性物质（如n-C18烷）键合到硅胶基 质上，以极性溶剂（如甲醇和水）为流动相，则可分离非极 性或弱极性的化合物。据此，采用反相液相色谱法可分离烷 基苯类化合物。
中国药典 反相色谱
中国药典反相色谱
《中国药典》是中华人民共和国国家药品标准，用于规范药品的生产、检验和质量控制。
在药典中，反相色谱（Reverse Phase Chromatography，RPC）是一种常用的分离
和分析技术。
反相色谱法是一种基于样品在固定相和流动相之间分配系数的差异来实现分离的方法。
在药典中，反相色谱法主要用于药物及其相关化合物的含量测定、杂质鉴定和纯度分析等。
反相色谱的主要特点如下：
1. 固定相：反相色谱中使用的固定相为非极性或弱极性材料，如化学键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶等。
这些固定相有利于非极性或弱极性化合物的分离。
2. 流动相：与固定相相比，流动相通常为极性或弱极性溶剂，如水、甲醇等。
流动相的选择会影响色谱柱的分离效果和分析时间。
3. 色谱条件：反相色谱法中的色谱条件包括色谱柱、流动相组成、流速、检测器等。
这些条件需要根据待分析样品的性质进行优化，以实现良好的分离效果。
4. 应用：反相色谱法在药典中的应用主要包括药物含量测定、杂质鉴定、纯度分析等。
对于不同类型的化合物，需要选择合适的固定相、流动相和色谱条件，以实现有效的分离和分析。
总之，《中国药典》中的反相色谱法是一种重要的分离和分析技术，用于药物及其相关化合物的检验和质量控制。
在实际应用中，需要根据样品的性质和检测要求，选择合适的固定相、流动相和色谱条件，以实现有效的分离和分析。
液相色谱简介（反相）
高效液相色谱法（反相液相色谱）一、液相色谱法方法的分类和选择1、方法的分类：根据流动相和固定相极性的相对强弱，液相色谱法分为正相色谱法和反相色谱法。
两类色谱使用流动相极性顺序与物质的极性流出顺序恰好相反。
正相色谱法中通常固定相的极性较大，，如硅胶、氧化铝等，流动相极性小于固定相的极性。
实验时，流动相的选择从极性小到极性大递增，样品中极性弱的组分最先流出，随后是极性逐步增大的组分流出。
反相色谱中使用的固定相极性小，如C18键合的硅胶固定相，流动相的极性大于固定相的极性。
通常用水-甲醇作流动相时，样品中极性强的组分先流出，随后是极性较小的组分。
流动相的极性变化从最大的水开始，逐步增加甲醇的比例，流动相的极性逐步减弱。
在HPLC中应用最广泛的是反相分配色谱法（常称为反相色谱法）。
它是利用样品组分在流动相和固定相之间的溶解度之差进行分离。
在反相色谱柱中改变流动相组成、进行梯度淋洗和恢复柱子分配平衡容易实现，因此同一柱子可以长时间使用，柱效长久，重复性较好。
在反相色谱法中，极性大的组分先出峰，保留体积小，峰形扩散小，分离效率高，流动相价格便宜，毒性较小，容易得到。
正相色谱法大多利用吸附的原理进行分离，正相色谱法的柱子如使用强极性的流动相（如水、醇等溶剂）会使柱中吸附剂活性失去后很难恢复，特别是分离极性强的组分时，常常因为固定相的吸附作用使保留体积增大，引起峰的扩散和拖尾。
2、方法的选择：HPLC方法的选择主要取决于样品的组成、结构的类型、溶剂性能、相对分子质量范围等。
一般来讲相对分子质量大于2000的高分子化合物，主要采用凝胶色谱法进行分离。
相对分子质量小于2000的化合物可以利用它在水中和有机溶剂中的溶解度及溶解性质进行分离。
如极性大的水溶性化合物和在水中可解离的离子化合物，可用不同类型的色谱柱以离子色谱法进行分离；在水中溶解但不解离的化合物（如糖类）可用反相色谱法进行分离，以甲醇或乙睛-水作为流动相。
反相色谱法ReversedphaseHPLC
二、如何平衡色谱柱？
新色谱柱，应首先用0.2ml/min的流速将色谱 柱平衡过夜，然后将流速升高到1.0ml/min冲洗 30分钟，以便将色谱柱的填料充分平衡至最佳 状态。这样可以保证色谱柱的使用寿命，并且 保证在以后的使用中，获得分析结果的重现性。 平衡过程中，将流速缓慢地提高 用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓 冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的 时间来平衡)
再生方法： 1.极性固定相的再生： 正庚烷 氯仿 乙酸乙酯
丙酮
乙醇
水
2.非极性固定相的再生： 水 乙腈 氯仿(或异丙醇) 乙腈 水
3. 0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱
四、注意： 1.在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于 NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该 在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲 洗至碱溶液完全流出。 2.如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完 全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M的硫 酸冲洗非常有效。
正相色谱法的流动相极性小于固定相。样品 中极性小的组分先流出，极性大的后流出。正 相色谱法适于分析极性化合物。 氰基键合相以氰乙基取代了硅胶的羟基，极 性比硅胶小，选择性与硅胶相似，它主要用于 可诱导极化的化合物和极性化合物的分析。 氨基键合相以氨基取代了硅胶中的羟基，其 选择性与硅胶有很大的不同，主要用于分析糖 类物质。
in a mixture P'AB = φAP'A + φ BP'B
fraction in mixture
In HPLC, capacity factor k' can be manipulated by changing solvent composition best resolution/time when k' = 2-5
反相离子对色谱法
反相离子对色谱法
反相离子对色谱法（Reversed-Phase Ion Pair Chromatography, RP-IPC）是一种液相色谱法，常用于对带正电或负电的离子类化合物进行分离和定量分析。
该方法的原理是在一定的流动相条件下，使用一种含正离子对剂的有机溶剂作为移动相，使得样品中的离子类化合物与正离子对剂形成离子对的结合，在反相色谱柱上进行分离。
正离子对剂通常是醇胺类、季铵盐类或草酸钠等。
其中带正电的离子类化合物与正离子对剂形成胶束结构，经过反相液相色谱柱后分离，负电的离子类化合物与正离子对剂发生离子对结合，再经柱分离。
与传统的反相色谱相比，反相离子对色谱法的优势在于可以分离和定量测定带电离子类化合物，如药物类、生物活性物质、蛋白质和核酸等。
同时，由于离子对剂的存在，可以提高某些带电离子类化合物的保留率和分离度，增强色谱法的选择性和灵敏度。
反相离子对色谱法在药物分析、环境分析、食品安全等领域有广泛的应用。
它可以用于测定药物中杂质的含量、药物代谢产物的分离和定量、食品中添加剂的检测等。
同时，该方法还可以与其他色谱技术（如气相色谱、离子色谱等）或质谱联用，进一步提高分析的选择性和灵敏度。
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3. 灵敏度高、易于实现操作自动化。
实验预习
了解高效液相色谱仪的基本结构及操作步骤。
掌握利用内标法分析混合物中甲苯含量的方法。
仪器与试剂
1. 色谱仪: Agilent 1100
2. 色谱柱：C18柱， 250 mm×4.6 mm 3. 流动相: 甲醇:水(70:30)，流速: 1.0 mL/min 4. 检测器: 紫外检测器 254 nm
实验步骤
1. 确定实验条件（流动相、流速、检测波长等） 2. 溶液的配制： （1）内标物溶液的配制：准确称取一定量苯酚纯品，加甲醇溶解后 制成0.400 mg/mL的标准溶液
（2）甲苯标准溶液的制备：准确量取一定量甲苯的标准品，加甲醇
溶解后制成0.500 mg/mL的标准溶液 （3）样品溶液的制备：准确称取适量样品，加甲醇超声溶解，定容 于100 mL容量瓶中，过滤备用。
基本操作
1. 打开电脑主机，再打开高效液相色谱的模块，启动工作站并初始化仪 器。 2. 仪器初始化完毕后，在工作界面动相组成=甲醇:水(70:30) ，流速=1.0 mL/min ，柱压=200 kPa。
3. 运行程序，清洗色谱柱，直至基线平稳，然后进样，进行测定。 4. 测定结束后，依次用纯水、100%甲醇洗涤20分钟，退出主程序，关闭 计算机。
3.相对校正因子的测定： 取1.00 mL甲苯标准溶液和1.00 mL苯酚标准溶液混合，待仪器稳
定后，注入10цL混合溶液，记录色谱图，平行测定三次。
4. 样品分析： 取1.00 mL内标标准溶液和1.00 mL样品溶液混合，待仪器稳定后， 注入10цL混合溶液，记录色谱图，平行测定三次。
数据处理
相对校正因子
未知液中甲苯的含量
注意事项和问题
1. 检查流动相是否充足。
2. 待仪器稳定后，再进样。 3. 进样器要充分洗涤。
反相色谱法测定有机化合物 中甲苯的含量
实验目的
了解高效液相色谱仪的基本结构及基本操作。 了解反相色谱法的基本原理。 掌握利用内标法进行色谱定量分析的实验方法。
实验原理
流动相的极性大于固定相的化学键合相色谱称为反相色谱。由于
各种物质的极性不同，因而在反相色谱体系中的分配能力不同，因此
保留时间不同，在色谱图上呈现不同位置的色谱峰。反相色谱大部分 以C18或C8为色谱柱，以甲醇或乙氰的水溶液为流动相。
采用内标法定量时，首先将一定量的待测物标准品溶液与内标物
标准品溶液混合，进行色谱分离，测得峰面积分别为Ai和As，求出相 对校正因子f΄。
样品分析时，将一定量的内标物加入待测样品中，进行色谱分析，
测得峰面积，计算样品中待测物的量。
高效液相色谱仪流程示意图
高效液相色谱法的特点
1. 分析速度快。 2. 分离效率高。