盐析与疏水层析相结合快速分离提纯猪胰激肽释放酶
第八节 疏水层析法
盐析作用增强
洗脱作用增强
排在最左边的离子或盐，盐析作用最强， 洗脱能力最弱；排在最右边的离子或盐， 洗脱能力最强，盐析作用最弱。 选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分 离 后 蛋 白 质 的 活 性 都 很 重 要 。 (NH4)2SO4,NH4Ac,NaCl和磷酸盐是疏水层 析分离常用的几种盐。
例如某些蛋白质在水溶液中溶解度很大，分子 的极性较大；在高盐溶液中疏水性明显增大， 溶解度降低，出现盐析现象；在低盐溶液中疏 水性减小，溶解度增大。 因此疏水层析可以通过改变盐溶液的离子强度、 控制蛋白质分子的极性或非极性，使样品中极 性相近的蛋白质组分形成具有一定差异的疏水 分子，然后利用它们之间的疏水特性进行层析 分离。
在分离过程中，溶液中的疏水分子经过疏水层析
介质时，介质上的疏水配基即与它们发生亲和吸
附作用，疏水分子被吸附在介质的配基上面，这
种吸附力的强弱与疏水分子的疏水性大小相关，
疏水性大（极性小）的组分吸附力强，疏水性小 （极性大）的组分吸附力弱，通过改变洗脱液的 盐-水比例，改变其极性，使吸附在固定相上的 不同极性组分根据其疏水性的差异先后被解吸下
多缓冲离子交换剂可利用普通的凝胶过滤介质偶 联特殊的离子交换基制备，如Amersham Biosciences公司生产的Polybuffer exchanger PBE系列（PBE118和94）即为以Sepharose 6B 为载体的阴离子交换剂，前者与Pharmalyte匹配 使用，后者与Polybuffer 96和Polybuffer 74匹 配使用。Amersham Biosciences生产的另一种 多缓冲离子交换剂为Mono P，其离子交换基为 具有不同pKa值的弱碱性氨基。Mono P可与上述 三种多缓冲剂匹配使用，粒径仅l0um，用作高效 色谱聚焦柱的固定相。
生物分离工程复习题(第1-9填空简答)
《生物分离工程》复习题一（第1~3章）二、填空题1、Cohn方程logS=β-KsI中，Ks越大，β值越小，盐析效果越好。
2、固液分离的主要方法有离心和过滤。
3、对发酵液进行预处理方法主要有加热法、调节PH值、凝聚和絮凝、使用惰性助助滤剂、加入反应剂。
4、根据过滤机理的不同，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤两种类型5、盐析的操作方法有加入固体盐、加入饱和溶液法、透析平衡法。
6、核酸的沉淀方法主要有有机溶剂沉淀法、等电点沉淀发、钙盐沉淀法、溶剂沉淀法。
7、蛋白质胶体溶液的稳定性主要靠蛋白质分子间静电排斥作用、蛋白质周围的水化层等因素稳定。
8、为使过滤进行的顺利通常要加入惰性助滤剂。
9、典型的工业过滤设备有半框压滤机和真空转鼓过滤机。
10、常用的蛋白质沉析方法有盐析、等电点和有机溶剂。
二、填空1、常用离心设备可分为离心沉降和离心过滤两大类；2、在一个转子中，将粒子沉降下来的效率可以用 K系数来描述。
3、超离心法是根据物质的沉降系数、质量和形状不同，应用强大的离心力，将混合物中各组分分离、浓缩、提纯的方法。
4、密度梯度离心中，制备密度梯度的常用方法有手工法、梯度混合仪法、离心形成法。
5、阳离子交换树脂按照活性基团分类，可分为强酸型、弱酸型和中等强度；其典型的活性基团分别有磺酸基团、羧基和磷酸基。
7、蛋白质分离常用的层析方法有凝胶层析、多糖基离子交换、亲和层析和疏水层析。
8、离子交换分离操作中，常用的梯度洗脱方法有 PH梯度和离子强度梯度。
10、多糖基离子交换剂包括葡集团离子交换剂和离子交换纤维素两大类。
11、离子交换树脂由载体、活性基团和可交换离子组成。
12、DEAE Sepharose是阴离子交换树脂，其活性基团是二乙基氨基乙基。
13、CM Sepharose是阳离子交换树脂，其活性基团是羧甲基。
14、离子交换操作一般分为动态和静态两种。
15、利用薄层定量测定时，一般控制待测组分的Rf在 0.2-0.5 之间。
生物大分子分离纯化技术 之疏水作用层析(19页)
生物大分子分离纯化技术
五、实验方法 1.胶的溶涨 用缓冲液或去离子水将凝胶清洗， 去除其中的有机溶剂。 2.装柱 疏水层析使用短而粗的层析柱，一般高 度为5-15cm，而柱的直径则由样品量决定。 3.平衡 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液冲洗、平 衡柱床。
生物大分子分离纯化技术
二、基本原理 疏水作用(疏水力)是浸在一种极性液体(如
水)中的非极性物质为避开水而被迫相聚的自然 趋势。蛋白质分子中有许多非极性的氨基酸， 如色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。暴 露于球形蛋白质表面的非极性氨基酸侧链可以 密集在一起形成疏水区域。
生物大分子分离纯化技术
疏水作用层析是以介质疏水基团和蛋白质表面 疏水区域的亲和作用为基础，利用在载体的表面偶 联疏水性基团为固定相，根据这些疏水性基团与蛋 白质分子疏水区之间相互作用的差别，对蛋白质类 生物大分子进行分离纯化。
生物大分子分离纯化技术
4.加样 上样总量一般在200-500mg。因疏水作用层
析的操作在高盐条件下进行，因此，在加样前 不需特殊处理，只要加入适当的盐并调整好pH 值。但若样品中有盐酸胍和尿素类物质时则应 去除，以防影响吸附。
生物大分子分离纯化技术
5.洗脱 疏水层析的洗脱过程是一个不断降低盐浓度
生物大分子分离纯化技术
三、介质 在疏水层析中，介质(又称吸附剂)一般由
载体(基质)和配体(疏水性基团)两部分构成。 其中基质有亲水性和非亲水性之分，而配体为 大小不等的疏水侧链(烷基或芳香基)，它们对 疏水性物质有一定的吸附力。
生物大分子分离纯化技术
四、影响疏水性吸附的因素 1.配体的类型
疏水性吸附剂的吸附作用与配体的密度成正比，配体密 度过小则疏水作用不足，但密度过大则洗脱困难。增加碳氢 链长度，其疏水性增强，(例如苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏 水性低)，只有少数疏水性强的蛋白质可被吸附，但由于疏 水作用太强，需用极端方法洗脱，可能导致蛋白质变性。
猪心肌苹果酸脱氢酶的制备及应用
果酸 脱 氢酶相 对分 子质 量 约 为６ Ｏ 含 有 ２个亚基 ， 个 亚基 的相 对 分子 质量 约 为３ Ｏ 。以制 ９Ｏ ｏ， 每 ４ｏ ０ 备 的苹 果 酸脱 氢酶 和谷 草转 氨 酶 配成 双 酶反 应 体 系 ， 葡 萄 酒 中 Ｌ 苹 果 酸 的含 量 进 行 了测 定 ； 对 一 通 过 标 准样 品和 葡 萄酒样 品精 密度 及 回 收率 （ ３ ２ ～１ ４ ） ９ ． Ｏ 实验 。 关 键词 ：苹果 酸脱 氢 酶 ； 层 析 ； 化 ； 苹 果 酸测定 柱 纯 Ｌ
Ｇ（ＮＧ ｎ ， Ｓ ） Ｒｅ ＵＮ ｎ ， Ｙａ Ⅵ ＮＧ ｉ ～， Ｈ ｕＯ Ｈｕ— ｈ ， ＹＡＮＧ ．ｌ ， Ｊｎ ｉ ｉ ｚ Ｈａ＿ ｎ ｉ Ⅵ ＮＧ ｕ ＇ ｗ
（． １ Ｋｅ ａ ｏ ａｏ ｙｏ ｎ ｕ ｔｉｌ ｏ ｅｈ 。。 ｙ ｙＬ ｂ ｒｔ ｒ ｆ ｄ ｓｒａ ｔｃ ｎ ｌｇ ，Ｍ ｉｉｔｙｏ ｄ ｃ ｔ ｎ ｉｎ ｎ ｎ Ｕｎｖ ｒ ｉ Ｗ ｕ ｉ １ １ ２ Ｉ Ｂｉ ｎｓｒ ｆＥ ｕ ａｉ ，Ｊａ ｇ ａ ｉｅ ｓｔ ｏ ｙ， ｘ ４ ２ ，Ｃｈｎ ； ２ ｉａ
ｏ ｉ ｚ ｄ， ｙ ｉｓ ｃ ｕｓ ｎ ａ ｐｔｍｉｅ ｂ ｔｓ ｕｅ ｒ ｈｉ ｇ， ｍｍｏｎ ｕ ｉ ｍ ｓ ｌａ ｅ ｕ ｆ ｔ ｄｕｅ— ｅ ｉ ｉａ ｉ ａ ｐｕ ｉｉａ ｉ ｎ ｈｒ ｇｈ ｌｐｒ ｃ ｐ ｔ ｔｏｎ ｎｄ ｒｆｃ ｔｏ ｔ ｏｕ ＤＥＡＥ ｐｈａ ｏｓ Ｆ，Ｐｈｅ ｙ１Ｓｅ ｈａ ｏ ｅ ６ Ｆ． ｈｙ ｏ ｏｂ ｃ ｃ ｏ ｔ ｇｒ ｐ ｎ ｐ ｄ ｘ Ｇ一 Ｓｅ ｒ ｅＦ． ｎ ｐ ｒ ｓ Ｆ． ｄｒ ｐｈ ｉ ｈｒ ｍａ ｏ ａ ｈｙ ａ ｄ Ｓｅ ｈａ ｅ
生化实验讲义：实验十一亲和层析（最后）
⽣化实验讲义：实验⼗⼀亲和层析（最后）实验⼗⼀亲和层析纯化胰蛋⽩酶⼀、引⾔前⾯我们所学的凝胶过滤法、离⼦交换法以及电泳等⼀系列分离纯化⽣物⼤分⼦的⼿段，⽐起早期采⽤的盐析法，有机溶剂及等电点沉淀法等，分离效果要好得多。
但是，这些⽅法中，或是利⽤⽣物⼤分⼦在⼀定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不同，或是依据其分⼦的⼤⼩和形状的不同。
⼀句话，多是利⽤⽣物分⼦间物理和化学性质的差异来进⾏分离纯化的。
由于这些⽅法的特异性⽐较低，加之待分离物质之间的物化性质差异较⼩，常常要综合不同的分离⽅法。
经过许多步骤才能使⽣物分⼦达到⼀定的纯度。
这样既费时间，⼜费试剂，有时最后产品还不能令⼈满意。
另外，有些⽣物⼤分⼦，往往在⽣物组织或发酵液中的含量很低，相对地说杂质很多，特别是⼀些具有⽣物活性的分⼦，往往由于分离纯化的步骤很多，时间过长，造成破坏以致失活，产率很低。
这就促使⼈们去寻求新的⽅法来解决存在的问题。
亲和层析法是近⼗多年来迅速地发展并⼴泛被采⽤来分离纯化⽣物⼤分⼦的⼀种⼗分有效的⽅法。
它具有分离快速，纯化效率⾼。
特别是对于那些含量少，杂质多，采⽤常规⽅法难于分离的⽣物活性分⼦，显⽰了独特的优越性。
有时⼀次被分离物质的纯度可提⾼⼏倍，⼗⼏倍甚⾄⼏百倍。
因此，亲和层析技术已成为纯化⽣物分⼦，特别是纯化⽣物活性物质最重要的⽅法之⼀。
⼆、实验⽬的与要求1. 理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备⼀种亲和吸附剂的操作⽅法；2. 理解和掌握亲和层析实验操作技术；3. 学会⼀种测定蛋⽩⽔解酶活⼒及⽐活的⽅法。
三、基本原理简⾔之，亲的层析主要是根据⽣物分⼦与其特定的固相化的配基或配体之间具有⼀定的亲和⼒⽽使⽣物分⼦得以分离。
这是由⼀种典型的吸附层析发展⽽来的分离纯化⽅法。
许多⽣物分⼦都有⼀种独特的⽣物学功能。
即它们都具有能和某些相对应的专⼀分⼦可逆地结合的特性（分⼦间通过某些次级键结合，如范德华⼒，疏⽔⼒，氢键等，在⼀定条件下⼜可解离）。
猪胰脏中胰脂肪酶的提取及其稳定性研究
食品研究与开发F ood Research And DevelopmentDOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2020.17.021猪胰脏中胰脂肪酶的提取及其稳定性研究龙娇妍，王娟，岳晓禹*（河南牧业经济学院食品与生物工程学院，河南郑州450046）摘要：该文以冷冻猪胰脏为原材料探究胰脂肪酶提取的较优条件。
通过单因素试验与正交试验得出胰脂肪酶提取的最佳提取条件，使用透析袋将胰脂肪酶进行浓缩，最后从复合稳定剂与保存温度两方面探究胰脂肪酶液的保存稳定性。
结果表明：用0.15mol/L的氯化钠溶液进行提取，温度为25℃，pH7.5；液体酶稳定性较差，通过探究复合稳定剂对胰脂肪酶稳定性的影响，得出较优的复合稳定剂配方为1.0%丙三醇、1.0%吐温80、1.2%氯化钠、2.2%葡萄糖酸钙、1.2%麦芽糖、1.2%可溶性淀粉，较优保存温度为25℃。
液体酶在4℃条件下经过24h的反渗透透析，其酶活力可达到（194715.67±3774.03）U/g。
关键词：胰脂肪酶；酶活力；提取剂；透析；稳定性Study on the Extraction and Storage Stability of Pancreatic Lipase in Pig PancreasLONG Jiao-yan，WANG Juan，YUE Xiao-yu*（College of Food and Bioengineering，Henan Institute of Animal Husbandry Economics，Zhengzhou450046，Henan，China）Abstract：To explore the optimum conditions for extracting pancreatic lipase from frozen pig pancreas.The en-zyme activity was used as the evaluation index.The optimum extraction conditions of pancreatic lipase were ob-tained by single factor test and orthogonal experiment，and the pancreatic lipase was concentrated with dialysate bag.Finally，the stability of pancreatic lipase solution was studied from two aspects：compound stabilizer and preservation temperature.The optimum extraction conditions were as follows：extraction with sodium chloride solution of0.15mol/L，temperature25℃，pH7.5；The stability of the liquid enzyme was poor.By exploring the influence of the compound stabilizer on the stability of pancreatic lipase，the optimum formula of the compound stabilizer was1.0%glycerol，1.0%Tween80，1.2%sodium chloride and2.2%calcium gluconate.With 1.2%maltose and1.2%soluble starch，the optimum storage temperature was25℃.The enzyme activity reached（194715.67±3774.03）U/g after24h reverse osmosis at4℃.Key words：pancreatic lipase；enzyme activity；extractant；dialysis；stability作者简介：龙娇妍（1986—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。
酶的主要提取方法及其优缺点
酶的主要提取方法及其优缺点生物工程09-1班杨桠楠0901*******1、有机溶剂沉淀是利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的。
优点：1）分辨率比盐析法高2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
2）对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。
沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。
2、等电点沉淀是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的优点：1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化缺点：1）酸化时，容易引起蛋白质失活3、有机聚合物沉淀法(复合沉淀法)是在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的。
优点：1）操作条件温和，不易引起生物大分子变性。
2）沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。
3）沉淀后有机聚合物容易去除。
4、盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离常用的盐析剂: 硫酸铵优点：1）盐析能力强。
2）在水中溶解度最大（25℃时为4.1mol/L）。
而温度系数最小（对温度不敏感）。
3）价格便宜。
浓度高时也不会引起蛋白质和酶生物活性的丧失，抽提效果好。
缺点：1）缓冲能力差2）NH4＋的存在干扰蛋白质的测定3）得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。
5、双水相萃取技术是用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。
由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。
蛋白酶的分离纯化方法小结
酶的分离纯化方法小结摘要：随着酶工程研究的进一步深化，酶的分离和纯化技术也有了日新月异的进步。
本文简单介绍了酶分离纯化过程中的常用的一些方法，以纤维素酶为例，从最古老的沉淀法，离心法到色谱技术等都做了简略介绍。
1.沉淀法目前，常用的酶大多数是蛋白质，因而其分离方法一般采用蛋白质的分离方法。
下文中的蛋白类催化酶均以酶简称。
酶在溶液中的稳定性与分子大小、带电荷量和水化作用有一定的相关性，改变这些因素会对酶的稳定性有所影响。
当酶的稳定性遭到破坏时就会沉淀析出。
常见的沉淀法有盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属沉淀法及加热变性沉淀法，其中盐析法多用于酶的分离纯化。
1.1盐析沉淀盐析沉淀法是根据不同酶在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。
酶易溶于水，因为其分子的-COOH、-NH2和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于酶分子周围形成1~100nm大小的亲水胶体，从而削弱了酶分子之间的作用力。
酶分子表面亲水基团越多，水化层越厚，酶分子与溶剂分子之间的亲和力就越大，因而溶解度也越大。
亲水胶体在水中的稳定因素有两个，即电荷和水膜。
因为中性盐的亲水性大于酶分子的亲水性，当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对酶分子的极性基团的影响，使酶在水中溶解度增大。
但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，酶表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是酶相互聚集而沉淀析出。
1.2等电点沉淀利用酶在等电点时溶解度最低，而各种酶又具有不同的等电点来分离酶的方法，称为等电点沉淀法。
酶的等电点(pI)即酶的净电荷为零时的pH值，由于等电点时的酶净电荷为零，因而失去了水化膜和分子间的相斥作用，疏水性氨基酸残基暴露，酶分子相互靠拢、聚集，最后形成沉淀析出。
1.3有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀法是指有机溶剂能使酶分子间极性基团的静电引力增加，与水作用能破坏酶的水化膜，而水化作用降低，促使酶聚集沉淀。
常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。
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552
过程工程学报
第5卷
UV (mAU) 280
Cond (ms/cm)
3500 3000 2500 2000 1500 1000
(a) Octyl Sepharose FF
120
100
80
60
40
3500 3000 2500 2000 1500 1000
(b) Phenyl Sepharose FF 120 100 80 60 40
疏水层析由于采用水盐系统，避免了使用有机溶 剂，更有利于维持蛋白质的活性[9]. 由于疏水层析需要 在较高盐浓度条件下进行操作，而本实验中经过盐析处
理后的上清液中盐浓度较高，可以直接作为疏水层析进 料，不需要额外的处理步骤. 本研究将盐析技术与疏水 相互作用层析技术(Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)相结合进行胰 K 的分离提纯.
传统工艺常采用多步盐析与离子交换层析相结合 的纯化方法，过程繁琐且收率和纯度都不理想. 本实验 结果表明，应用盐析与疏水层析法相结合大规模分离提 纯猪胰 K，时间短、效率高、成本低、工艺稳定且可在 室温下操作，易于实现工业化. 本实验结果与传统工艺 结果的比较见表 2.
2 材料和方法
2.1 实验材料 2.1.1 试剂
激肽释放酶标准品，国家药品检验鉴定中心；胰 K 粗品，苏州天绿制药有限公司提供；层析介质 Butyl Sepharose FF 为 Amersham 公司产品.
硫酸铵、乙醇、NaOH 均为分析纯，北京化学试剂 公司；牛血清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂，上海丽珠 东风生物技术有限公司；苯甲酰−L−精氨酸乙酯盐酸盐 (BAEE)，上海伯奥生物科技公司.
medium). 2.2.4 胰 K 纯度及收率计算
采用胰 K 比活及体积计算法.
3 结果
3.1 粗品溶解 采用 2.2.3 所述方法溶解，2 次溶解后，合并滤液，
经取样分析，经过 2 次溶解后，胰 K 全部在上清液中.
3.2 硫酸铵沉淀 通过 35%饱和度的硫酸铵溶液沉淀，可以除去粗品
中的部分杂蛋白；再通过 70%饱和度的硫酸铵溶液沉淀 后，不但可以将胰 K 蛋白全部沉淀，同时可起到浓缩样 品的作用，沉淀经过溶解后可作为疏水层析的样品.
Volume (mL)
Volume (mL)
Volume (mL)
图 2 三种疏水介质上的层析结果 Fig.2 Chromatographic patterns on three hydrophobic media
将收集目标峰进行 SDS−PAGE 分析，如图 3 所示. 可以看到，盐析后经过一步疏水层析提纯，得到比活大 于 500 U/mg 的胰 K 蛋白，电泳银染显示分子量在 28000 左右，符合文献[2]报道. 通过对收集样品的分析，得到 工艺纯化结果，如表 1 所示. 3.4 疏00 1000
(c) Butyl Sepharose FF 120 100 80 60 40
500
20
0
0
0 20 40 60 80 100 120 140
500
0 0
20
0 50 100 150 200
500
0 0
20
2
0 20 40 60 80 100 120 140
介质分离纯化胰 K 的效果. 本实验工艺与传统工艺相比，具有操作简单、快速、回收率和纯化倍数高等优点，有望成
为一种从动物组织中快速分离纯化药用蛋白质的有效技术平台.
关键词：疏水层析；纯化；猪胰激肽释放酶
中图分类号：Q81; TQ02
文献标识码：A
文章编号：1009−606X(2005)05−0550−04
疏水层析放大处理：层析柱尺寸φ7.6 cm×10 cm， 平衡缓冲液为 10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4+1.0 mol/L (NH4)2SO4 (pH 6.5)，洗脱缓冲液为 10 mmol/L Na2HPO4/ NaH2PO4 (pH 6.5)，选用 Butyl Sepharose FF 作为疏水层 析 介 质 ， 进 行 梯 度 洗 脱 ， 流 速 为 0.2 mL/(min⋅mL
第 5 卷第 5 期 2005 年 10 月
过程工程学报 The Chinese Journal of Process Engineering
Vol.5 No.5 Oct. 2005
盐析与疏水层析相结合快速分离提纯猪胰激肽释放酶
李冲峰 1，2，王仁伟 1，刘淑珍 1，谭天伟 2，苏志国 1
(1. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100080；2. 北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029)
来自胰腺的 K 酶称为胰 K. 胰 K 的提取纯化方法很 多，常见的有硫酸铵沉淀法[3]﹑离子交换层析法[4]﹑有 机溶剂分级[5]、亲和层析法[6]等. 目前，国际上基于胰 K 的纯化研究大多采用阴离子交换(通常为 DEAE 配基)结 合阳离子交换(通常为 CM 配基)，最后加一步凝胶过滤 层析，并且离子交换过程中胰 K 洗脱都采用改变 pH 的 方式. 由于缓冲液的缓冲作用，使柱内 pH 改变缓慢， 周期延长，耗费大量缓冲液，如法国 Bailey 等[7]的纯化 过程，虽然经过三步纯化后胰 K 比活高达 1 254 U/mg， 但收率只有 28.4%；其次离子交换层析与疏水层析结合 或者离子交换层析与亲和层析相结合的纯化方法，步骤 多、纯化周期长且成本也较高，如英国 EI-Thaher 等[8] 的纯化过程，虽然收率达到 87%，但胰 K 比活只有 156.3 U/mg.
考马氏亮蓝 G250，北京欣经科生物技术公司. 2.1.2 仪器
AKTA Purifier 层析系统，Amersham 公司；垂直电 泳仪，Bio-Rad 公司；AllegraTM 21R 高速冷冻离心机， Beckman 公司；紫外可见分光光度计 Ultrospec 2000， 层析柱，Pharmacia Biotech.；普通振荡摇床，中国科学 院武汉科学仪器厂. 2.2 实验方法 2.2.1 蛋白质浓度测定
由图 1 可以看出，不同硫酸铵饱和度的胰 K 蛋白纯 度差异明显. 胰 K 蛋白在饱和度为 10%∼35%的硫酸铵 溶液内没有明显沉淀效果，胰 K 蛋白比活略有升高. 在 硫酸铵溶液饱和度达到 35%时对溶液中的蛋白产生盐 析作用，胰 K 蛋白的析出在 35%饱和度发生. 随着硫酸 铵溶液饱和度的增加，胰 K 蛋白的析出明显增加，至 70%饱和度时，上清液中几乎不含胰 K 蛋白，表明 70% 硫酸铵饱和度即可达到有效沉淀目标蛋白的目的.
第5期
李冲峰等：用盐析与疏水层析相结合快速分离提纯猪胰激肽释放酶
551
略经修改，具体方法如下：取 2.0 mL 三乙醇胺缓冲液， 向其中加入 2 mg/mL 大豆胰蛋白酶抑制剂 200 μL, 3.0×10−3 mol/L 的 BAEE 500 μL，在 25 ℃恒温，获得活 性测定液.
以 253 nm 为紫外吸收测定的波长，将测定液倒入 石英比色皿，作为参比. 取 100 μL 活性为 2 U/mL 的激 肽释放酶标准品加入到测定液中，同时开始计时. 30 s 后开始读数，记录 253 nm 吸光度值. 每 30 s 取 1 次值， 直至延续 16 min 止. 根据吸光度值随时间的变化，做标 准品的酶活动力学曲线.
按 Bradford 蛋白质浓度测定法，用牛血清白蛋白作 标准曲线. 2.2.2 胰 K 活性测定
胰 K 活性测定是在文献[2]的基础上结合文献[10]
收稿日期：2004−10−18，修回日期：2004−12−21 基金项目：国家自然科学重点基金资助项目(编号：20136020) 作者简介：李冲峰(1975−)，男，宁夏隆德县人，硕士研究生，生物化工专业；苏志国，通讯联系人，Tel: 010-62561817, E-mail: zgsu@.
样品的活性测定：将样品稀释至适当浓度，按上述 方法测定其动力学曲线，取曲线斜率，按公式 U=U0K/K0 计算样品的活性，其中 U 和 U0 分别指样品和标准品的 活性(U/mL), K 和 K0 分别指样品和标准品酶活动力学曲 线的斜率. 2.2.3 硫酸铵沉淀
称量胰 K 粗品 30.0 g，溶于 60.0 mL 10%饱和度的 硫酸铵溶液中，搅拌溶解 4 h 后，离心取上清液，离心 力 12000 g；向上清液中缓缓加入硫酸铵粉末并不断搅 动，使溶液达到 35%的饱和度，常温下静置 2 h 后离心 20 min，离心力 12000 g；弃去沉淀，保留上清液；上 清液中继续缓缓加入硫酸铵粉末并不断搅动，使溶液达 到 70%的饱和度，静置 2 h 后离心 20 min，离心力 12 000 g；去除上清液，将沉淀溶解后进行疏水层析.
1 前言
激肽释放酶(Kallikrein，以下简称 K 酶)属丝氨酸蛋 白酶，广泛存在于血浆、胰、肾、颌下腺及尿中. 药用 K 酶又称血管舒缓素，主要来自颌下腺或胰腺[1].
K 酶能使毛细管和动脉血管舒张及通透性增加，使 冠状血管动脉、脑、视网膜处的血流供应量增加，适用 于高血压冠状血管及动脉血管硬化等症，对心绞痛、血 管痉挛、肢端感觉异常、闭塞性血栓性脉管炎、冻疮及 创伤等症也有作用[2]. 与同类化学合成药相比，它具有 易为人体吸收、代谢副作用小、长期使用安全的特点.