AKTA 层析分离技术PROTEINPPT课件
合集下载
蛋白质分离技术全ppt课件
第十节
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
层析分离纯化技术76页PPT
1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
层析分离纯化技术4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回里有你。
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所ห้องสมุดไป่ตู้的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
层析分离纯化技术4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回里有你。
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所ห้องสมุดไป่ตู้的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
层析分离技术图文
水处理中的有机物去除
利用层析分离技术，如活性炭吸附、 聚合物吸附等，可去除水中的有机污 染物，提高水质，保障饮用水安全。
05
层析分离技术的未来发展与挑战
新材料与新技术的研究与应用
新型吸附剂
研究具有高选择性、高吸附容量的新型吸附剂，以提高层析分离 的选择性和效率。
新型固定相
探索具有优异性能的新型固定相，以适应不同分离需求和条件。
层析分离技术图文
• 层析分离技术概述 • 层析分离技术的分类 • 层析分离技术的操作流程 • 层析分离技术的应用实例 • 层析分离技术的未来发展与挑战
01
层析分离技术概述
定义与原理
定义
层析分离技术是一种基于不同物质在 两相中的分配系数不同而实现分离的 物理分离方法。
原理
利用流动相和固定相的相互作用，使 混合物中的各组分在固定相和流动相 之间进行吸附、脱附、溶解、挥发等 过程，从而实现各组分的分离。
上样量控制
控制上样量，确保样品在柱子上得 到有效分离。
洗脱
洗脱液选择
根据分离需求选择合适的洗脱液，如有机溶剂、缓冲液等。
洗脱方式
采用适当的洗脱方式，如分段洗脱、梯度洗脱等。
洗脱速度控制
调节洗脱速度，确保样品得到充分分离。
检测与收集
检测方式
01
根据待分离组分的性质选择合适的检测方式，如紫外可见光谱、
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术，开发具有高分离性能的纳米尺度层析分 离材料。
提高分离效率与分辨率
优化分离条件
深入研究层析分离的原理和动力 学过程，优化分离条件，提高分 离效率和分辨率。
联用技术
将层析分离与其他分离技术联用， 实现多维分离，进一步提高分离 效果。
利用层析分离技术，如活性炭吸附、 聚合物吸附等，可去除水中的有机污 染物，提高水质，保障饮用水安全。
05
层析分离技术的未来发展与挑战
新材料与新技术的研究与应用
新型吸附剂
研究具有高选择性、高吸附容量的新型吸附剂，以提高层析分离 的选择性和效率。
新型固定相
探索具有优异性能的新型固定相，以适应不同分离需求和条件。
层析分离技术图文
• 层析分离技术概述 • 层析分离技术的分类 • 层析分离技术的操作流程 • 层析分离技术的应用实例 • 层析分离技术的未来发展与挑战
01
层析分离技术概述
定义与原理
定义
层析分离技术是一种基于不同物质在 两相中的分配系数不同而实现分离的 物理分离方法。
原理
利用流动相和固定相的相互作用，使 混合物中的各组分在固定相和流动相 之间进行吸附、脱附、溶解、挥发等 过程，从而实现各组分的分离。
上样量控制
控制上样量，确保样品在柱子上得 到有效分离。
洗脱
洗脱液选择
根据分离需求选择合适的洗脱液，如有机溶剂、缓冲液等。
洗脱方式
采用适当的洗脱方式，如分段洗脱、梯度洗脱等。
洗脱速度控制
调节洗脱速度，确保样品得到充分分离。
检测与收集
检测方式
01
根据待分离组分的性质选择合适的检测方式，如紫外可见光谱、
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术，开发具有高分离性能的纳米尺度层析分 离材料。
提高分离效率与分辨率
优化分离条件
深入研究层析分离的原理和动力 学过程，优化分离条件，提高分 离效率和分辨率。
联用技术
将层析分离与其他分离技术联用， 实现多维分离，进一步提高分离 效果。
《层析分离技术》课件
总结与展望
1 优势和局限性
层析分离技术具有高效、可靠、灵活等优势，但也存在一些局限性。
2 发展趋势
层析分离技术在分离纯化效果、自动化程度和快速分析方面的发展具有很大潜力。
层析分离技术的应用
1
蛋白质纯化技术
层析分离技术在蛋白质纯化过程中起到关键作用，实现高效的纯化和分离。
2
生物大分子制备
层析分离技术被广泛应用于生物大分子的制备过程，如核酸提取和多肽纯化。
3
制药过程中的应用
总站式层析技术在制药过程中用于分离和纯化药物及其他有关的化合物。
4
其他应用领域
层析分离技术还在食品工业、环境监测等领域得到广泛应用。
应用
层析分离技术广泛应用于蛋白质纯化、生物大分子制备等领域。
层析分离技术的基本原理
1 分子相互作用
层析分离技术基于分子之 间的相互作用，如电荷、 亲疏水性等。
2 物质分子分配系数
物质分子在不同相之间的 分配系数决定了其分离程 度。
3ห้องสมุดไป่ตู้层析柱构成要素
层析柱由填料、梯度溶剂 和流动相等要素构成，起 到分离和纯化作用。
层析分离技术的分类
分离机理
按照分离机理，层析 分离技术可分为吸附 层析、分配层析和离 子交换层析。
层状介质特性
根据层状介质的特性， 可将层析分离技术分 为薄层层析、柱层析 和高效液相层析。
介质形态
介质形态包括液态层 析、凝胶层析和纤维 素层析等。
操作方式
操作方式包括亲和层 析、吸附剂层析和凝 胶过滤层析等。
《层析分离技术》PPT课 件
层析分离技术是一种基于分子之间相互作用的分离技术，通过物质分子在不 同相之间的分配系数实现分离和纯化的方法。
蛋白质分离纯化技术PPT课件
第11页/共15页
根据蛋白质带电状态分离
离子交换层析IEC是根据蛋白质的两性解离性质、在溶液中所带 电荷不同进行分离的。
离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电 荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。当蛋白质处于不同的 pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋 白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的 蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交 换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中 的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
第5页/从细胞破碎一步开始蛋白质就脱离 了天然的环境，受到各种不同试剂的干扰，其结构和功能会受 到不同程度的可逆或不可逆的损害。因此，在蛋白质纯化的各 步骤都要小心地控制所采用的提纯条件，以避免蛋白质变性。
在提纯蛋白质过程中需要在每一步检测蛋白质（酶）的存 在及提纯的情况，即建立蛋白质定量检测方法。
第3页/共15页
蛋白质的抽提
一般的蛋白质通常选择适当的缓冲溶液把蛋白质提取出来，再 用离心法除去不溶物得到含有目的物的粗抽提液。抽提所用缓冲溶 液的PH值、离子强度、组成成分等应根据目的蛋白质的性质而定。
第4页/共15页
蛋白质粗分级
采用分级盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方 法将目标蛋白质与其他蛋白质分离开来。
蛋白质分离与纯化技术
蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生 命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的 物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物当中分离纯化 出所需要的目的蛋白质的方法。由于深入研究蛋白质的结构与功能 需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业 中的核心技术。
根据蛋白质带电状态分离
离子交换层析IEC是根据蛋白质的两性解离性质、在溶液中所带 电荷不同进行分离的。
离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电 荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。当蛋白质处于不同的 pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋 白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的 蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交 换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中 的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
第5页/从细胞破碎一步开始蛋白质就脱离 了天然的环境，受到各种不同试剂的干扰，其结构和功能会受 到不同程度的可逆或不可逆的损害。因此，在蛋白质纯化的各 步骤都要小心地控制所采用的提纯条件，以避免蛋白质变性。
在提纯蛋白质过程中需要在每一步检测蛋白质（酶）的存 在及提纯的情况，即建立蛋白质定量检测方法。
第3页/共15页
蛋白质的抽提
一般的蛋白质通常选择适当的缓冲溶液把蛋白质提取出来，再 用离心法除去不溶物得到含有目的物的粗抽提液。抽提所用缓冲溶 液的PH值、离子强度、组成成分等应根据目的蛋白质的性质而定。
第4页/共15页
蛋白质粗分级
采用分级盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方 法将目标蛋白质与其他蛋白质分离开来。
蛋白质分离与纯化技术
蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生 命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的 物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物当中分离纯化 出所需要的目的蛋白质的方法。由于深入研究蛋白质的结构与功能 需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业 中的核心技术。
层析分离纯化技术策略共58页PPT资料
8
pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变
滴定曲线
3
+
pH
10
稳定性范围
不同 pH 下的分离情况
1
蛋白质净电荷
用阳离子交换
用阴离子交换
2
-
1
2
9
pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变
流动相的 pH 选择性
Abs
Abs
Abs
Abs
V
V
V
V
+ 阳离子
表面净电荷
0
pH
阴离子
-
Abs
Abs
Abs
3
沉淀蛋白质的方法
(1) 盐析法 (2) 有机溶剂沉淀法 (3) 重金属盐沉淀法 (4) 加热变性沉淀法
4
蛋白质纯化策略
融合蛋白质
简单纯化
一步 亲和层析 90 - 97 % 纯度
更高纯度
多步纯化
表达
非融合蛋白质
5
粗提 中度纯化 精细纯化
三步纯化策略
高效纯化策略
分辩率 精细纯化
纯化
分解目标分子
17
预防措施
膜过滤、离心、匀 浆
离心、如可跟目标 分子兼容，可用有
机溶剂
添加硫酸链霉素、 硫酸精蛋白或锰盐 沉淀核酸、添加核
酸酶
添加蛋白酶抑制剂 、用亲和层析去除 蛋白酶、缩短粗分 时间、低温操作
粗提
目的
纯化粗样 快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白
酶) 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析
Step
12
三步纯化策略
层析填料的 颗粒大小
精细纯化 中度纯化
AKTA操作流程 PPT
出口阀
收集器
可以根据时间、体积或自动峰识别进行组分收集 峰识别可以最大限度减少交叉污染，把不需要的组分直接排为废液
组分收集器 F9-C 含有一个收集盘 架，可以容纳从 3 到 50 ml 的各 种试管以及 24、48 和 96 孔深孔 板
软件介绍
Unicorn6 4个窗口
Administration
电导检测器，pH计
电导检测器用于监测缓冲液和样品的电导率，在线检测真 实的梯度 电导检测器整合温度传感器，可以校正由温度 引起的电导率的变化
在安装有pH电极的阀上直接注射校正液，可以轻松地进行 pH 计校正 限流器连接在 pH 阀上，在管路中产生反压，防止在紫外流 动池中形成气泡
单出口控制阀 V9-Os 可以连接收集器并具有一个额外出口， 可用于流穿组分的收集 多出口收集阀V9-O 能够连接多个收集器，而且有 10 个出 口可以进行大体积组分的收集
New 创建新用户
给定权限
数据注销及激活
手动备份 系统备份
备份还原
System control
Run Data 模块
Chromatogram 模块
Flow scheme 模块
Run Log 模块
Method editor
Evaluation
积分区域 限定峰参数
在某种高浓度的盐的存在下，它们可能由于增强的疏水相互作用而 沉淀下来
离子强度的改变，有机溶剂的存在，பைடு நூலகம்度和pH（尤其在等电点， 没有表面净电荷时）都能影响蛋白质结构和溶解度
盐浓度逐步的降低，样品组分根据疏水性的依次洗脱
层析柱料平衡及上样
分步洗脱及清洗
反相层析
反相色谱(reverse phase chromatography ，RPC)
收集器
可以根据时间、体积或自动峰识别进行组分收集 峰识别可以最大限度减少交叉污染，把不需要的组分直接排为废液
组分收集器 F9-C 含有一个收集盘 架，可以容纳从 3 到 50 ml 的各 种试管以及 24、48 和 96 孔深孔 板
软件介绍
Unicorn6 4个窗口
Administration
电导检测器，pH计
电导检测器用于监测缓冲液和样品的电导率，在线检测真 实的梯度 电导检测器整合温度传感器，可以校正由温度 引起的电导率的变化
在安装有pH电极的阀上直接注射校正液，可以轻松地进行 pH 计校正 限流器连接在 pH 阀上，在管路中产生反压，防止在紫外流 动池中形成气泡
单出口控制阀 V9-Os 可以连接收集器并具有一个额外出口， 可用于流穿组分的收集 多出口收集阀V9-O 能够连接多个收集器，而且有 10 个出 口可以进行大体积组分的收集
New 创建新用户
给定权限
数据注销及激活
手动备份 系统备份
备份还原
System control
Run Data 模块
Chromatogram 模块
Flow scheme 模块
Run Log 模块
Method editor
Evaluation
积分区域 限定峰参数
在某种高浓度的盐的存在下，它们可能由于增强的疏水相互作用而 沉淀下来
离子强度的改变，有机溶剂的存在，பைடு நூலகம்度和pH（尤其在等电点， 没有表面净电荷时）都能影响蛋白质结构和溶解度
盐浓度逐步的降低，样品组分根据疏水性的依次洗脱
层析柱料平衡及上样
分步洗脱及清洗
反相层析
反相色谱(reverse phase chromatography ，RPC)
AKTA-Primer-层析系统在天然产物分离中-实验PPT课件
17
.
AKTA Primer
PrimeView——软件系统-数据采集
18
.
运行曲线图谱（Curve）：
记录系统采集到的全部数据， 系统开始运行后，自动开始记 录，结束后，自动保存。
运行日志（Logbook）：
记录系统收到的所有指令
19
.
AKTA Primer
20
.
AKTA Primer
PrimeView——数据采集
9
.
面板操作按钮及简要操作命令
10
.
面板操作按钮
11
.
面板操作按钮
按OK进入子菜单； 按ESC退到上级菜单； 按上下箭头，可选择菜单命令、调整参数等。
12
.
面板操作按钮
分布收集器前进一管
停止程序或方法运行
梯度运行过程中，按此键，系统将保 持当前浓度运行，而流速和分步收集 继续，再按一下，继续梯度运行
25
.
4
.
AKTA Primer
AKTA Primer 系统组成
AKTA Prime + PrimeView
5
.
AKTA Primer
AKTA Prime 主机
组分收集器
控制面板
系统泵
6
.
AKTA Primer
AKTA Prime 主机
7
.
AKTA Primer
AKTA Prime 流程图
8
.
AKTA Prime 流程图
选择浏览曲线及 设定曲线颜色
设定X，Y轴的 坐标范围
21
.
实验的基本内容
实验题目——蛋白质脱盐
实验目的 1.了解层系技术的理念，基本操作和应用 2.掌握分子筛层析的原理，了解其用途； 3.熟悉AKTA Prime 的操作。 实验原理
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Ni2+
15
任何规模纯化都比较简单
预装柱/填料
His MicroSpin™ Purification Module
一次可纯化 融合蛋白的量
〈 100 µg
HiTrap™ Chelating 1 ml HisTrap™ Kit
〈 12 mg 〈 12 mg/柱
3:
洗脱GST 融合蛋白
kD
94 67 43 30 20.1 14.4
12 3
Glutathione Sepharose™ Fast Flow
适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用， 并用作放大
• 每毫升填料可以纯化 12 mg 融合蛋白 • 装在 XK 空柱中和 ÄKTA™ 平台纯化
系统连接使用 • 高流速 • 兼容尿素，盐酸胍等
立即可用, 预装柱, 缓冲液和试剂 和 MicroPlex™ 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量 (一次处理〈 48 样品) 立即可用, 预装柱 立即可用, 预装柱 可自行装柱 可自行装柱，使用层析系统快速纯化， 适合放大
6
GST MicroSpin™ Purification Module
一次可纯化 GST 融合蛋白的量
〈 400 µg
GSTrap™ 1 ml
10 - 12 mg
GSTrap 5 ml
50 - 60 mg
Glutathione Sepharose™ 4B 8 mg / ml
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow
10 -12 mg / ml
注意
提供分子量大小和 % 纯度讯息. 可检测融合蛋白和污染物.
13
GST 96-孔板 ELISA 检测试剂盒
• 快速酶测定 • 每块板可检测 50 样品 • 适合筛选表达系统和层析组
份
14
(His)6 融合蛋白的纯化和检测
Ni2+ Ni2+
重组蛋白 His His His His His His
Ni2+
80
fusion
protein
60
40
20
0
0
5.0
10.0
15.0
20.0
ml
5.0
10.0
15.0
20.0
min
10
SDS PAGE analysis
1:
低分子量标记 (LMW) Calibration kit,
还原, Amersham Pharmacia Biotech
2:
胞浆萃取液, 1 g /10 ml
检测方法
使用抗-GST 抗体和 ECL™ 检测系统的 免疫印迹法
注意
高度特异, 只检测 GST 融合蛋白 使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以 使背景大大减低，甚至去掉 ECL 检测系统提高免疫印迹的检测能力 ECL 提供大部分重组表达应用所需的灵敏 度 需要更高灵敏度时使用 ECL Plus.
SDS-PAGE ＋Coomassie™ 考马氏染色或银染
层析分离纯化技术
2001.11.28 Shanghai Pudong
1
整体概述
概况一
点击此处输入相关文本内容 点击此处输入相关文本内容
概况二
点击此处输入相关文本内容 点击此处输入相关文本内容
概况三
点击此处输入相关文本内容 点击此处输入相关文本内容
蛋白质纯化策略
融合蛋白质
简单纯化
一步 亲和层析 90 - 97 % 纯度
4 CV结合缓冲液, 8 ml 样品, 10 CV结合缓冲液, 5 CV洗脱缓冲液, 5 CV结合缓冲液(CV = 柱体积)
ÄKTA™explorer 10
Elution buffer
% Elution buffer
3.0 2.5
Wash
2.0 1.5 1.0 0.5
100
2.7 mg
pure GST
更高纯度
多步纯化
表达
非融合蛋白质
3
粗提 中度纯化 精细纯化
三步纯化策略
简易纯化选择
载体和标记
pGEX 谷胱甘肽 S-转移酶
PQE 6 x 组氨酸
pET 6 x组氨酸
pEZZ 18 (非诱导性表达) 蛋白 A 的 IgG 结合区
pRIT2T (利用温度改变诱导) 蛋白 A 的 IgG 结合区
纯化
GST MicroSpin™ Purification Module, GSTrap™, Glutathione Sepharose™ Fast Flow
His MicroSpin Purification Module HisTrap™, HiTrap™ Chelating, Chelating Sepharose Fast Flow
IgG Sepharose 6 Fast Flow
IgG Sepharose 6 Fast Flow
4
GST 融合蛋白的纯化
11
GST 融合蛋白的检测
检测方法
GST 96 孔板 ELISA 检测试剂盒
GST 酶测定检测模组 功能测定
注意
适合筛选表达系统和层析组份 当表达蛋白的含量不明或需要高灵敏度 时特别用
快速测定；适合筛选用途 可以有效评估纯化出来的 GST 融合蛋白 的活性，但可能需要自行设计和优化
12
GST融合蛋白的检测
8
GSTrap™
结合缓冲液平衡 加样后用结合缓冲液冲洗 用洗脱缓冲液洗脱
3 min 废液
5-15 min 收集
9
2 min 收集组份
GSTrap™
柱: 样品: 结合缓冲液: 洗脱缓冲液 流速: 层析 步骤:
系统:
A 280
3.5
GSTrap 1 ml 8 ml 大肠杆菌表达含 GST 融合蛋白胞浆萃取液 PBS, pH 7.3 50 mM Tris™-HCl, pH 8.0 ＋ 10 mM 还原谷胱甘肽 1 ml/min
Glutathione Sepharose™
Mr 26 000
GST
重组蛋白
10C
酶切位点
Factor Xa:
Mr 17-20 000 / 28-30 000
Thrombin:
Mr 37 000
PreScission™ Protease:
Mr 46 000
5
任何规模纯化都比较简单
预装柱/填料
GST MicroSpin™ Purification Module
适合蛋白质扩增系统筛选和优化，小规模纯化
• 立即可用, 50 预装柱含缓冲 液和所需试剂
• 可纯化每柱 400 µg, 体积达 400 µl 样品
7
GSTrap™ 柱
适合快速和重复性高的要求
• 20 分钟内 • 每 1 ml 柱 12 mg 或 每 5 ml 柱 60 mg • 使用针筒，蠕动泵，或者 ÄKTA™ 系统 • 添加剂兼容