第十章层析分离技术
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层析分离技术
25
层析分离的基本概念
洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱 体积
Ve Vm K dV s
不同的பைடு நூலகம்质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积 也有所差异
26
层析分离的基本概念
Rs = 0.6
分辨率（Resolution, Rs） Peak separation Peak width at ½ height
柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理
17
4、层析装臵的仪器化
HPLC
与微机、质谱等连用
18
四、层析前蛋白质处理
主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶 剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的 杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理 量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质， 但分辨率低。
19
1、盐析法 盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自 由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性 基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的 水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结 合，形成沉淀。
3
层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年 俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他 将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各 种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被 分开，由此得名为“色谱法”。 1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出 了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠 定了基础。
20
2、等电点沉淀
在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶 解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离 子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。
层析分离的基本概念
洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱 体积
Ve Vm K dV s
不同的பைடு நூலகம்质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积 也有所差异
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层析分离的基本概念
Rs = 0.6
分辨率（Resolution, Rs） Peak separation Peak width at ½ height
柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理
17
4、层析装臵的仪器化
HPLC
与微机、质谱等连用
18
四、层析前蛋白质处理
主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶 剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的 杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理 量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质， 但分辨率低。
19
1、盐析法 盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自 由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性 基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的 水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结 合，形成沉淀。
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层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年 俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他 将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各 种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被 分开，由此得名为“色谱法”。 1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出 了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠 定了基础。
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2、等电点沉淀
在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶 解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离 子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。
层析分离技术
根据分离的原理不同分类 分为吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作 用层析、反相层析、亲和层析等。
4.2 吸附层析
吸附层析（Adsorption Chromatography ）是以吸附剂 为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而 达到分离目的的一种层析技术。
按吸附剂和吸附物之间的作用力不同，吸附可分为三 种类型： 物理吸附：范德华力，吸附解吸速度快，选择性较差 化学吸附：生成化学键，达到平衡慢，选择性较好 交换吸附：极性分子或离子之间发生交换吸附…….
的活性物质提取分离，如维生素B12、四环素、土霉 素等，还可用于污水处理、糖浆脱色等。
大孔吸附树脂的选择和使用
选择依据： 吸附剂及吸附物的极性
一般来说，非极性吸附剂易从极性溶剂中吸附非极性 物质；极性吸附剂易从非极性溶剂中吸附极性物质； 中等极性的吸附剂对上述两种情况都具有吸附能力。 吸附物质的大小 吸附物分子较大的，应选择大孔树脂中孔径大的。
常用吸附剂按其化学结构可分两类
有机吸附剂，如：活性炭、纤维素、大孔吸附 树脂、聚酰胺等
无机吸附剂，如：硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅 藻土、羟基磷灰石等
常用吸附剂简介
硅胶 是一种极性吸附剂，又是一种弱酸性阳离子交换
剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子， 遇较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附 碱性化合物； 应用于萜类、固醇、生物碱、酸性化合物、磷脂、 脂肪、氨基酸等的吸附分离。
HA的吸附机理
HA机理的主要观点是：HA的Ca2+和生物分子表 面的负电荷基团的结合，对生物分子的分离起重 要作用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的正 电荷基团的结合，则起次要作用。
大孔吸附树脂
特点 大孔型颗粒，其孔隙、骨架结构和极性可按需要选
4.2 吸附层析
吸附层析（Adsorption Chromatography ）是以吸附剂 为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而 达到分离目的的一种层析技术。
按吸附剂和吸附物之间的作用力不同，吸附可分为三 种类型： 物理吸附：范德华力，吸附解吸速度快，选择性较差 化学吸附：生成化学键，达到平衡慢，选择性较好 交换吸附：极性分子或离子之间发生交换吸附…….
的活性物质提取分离，如维生素B12、四环素、土霉 素等，还可用于污水处理、糖浆脱色等。
大孔吸附树脂的选择和使用
选择依据： 吸附剂及吸附物的极性
一般来说，非极性吸附剂易从极性溶剂中吸附非极性 物质；极性吸附剂易从非极性溶剂中吸附极性物质； 中等极性的吸附剂对上述两种情况都具有吸附能力。 吸附物质的大小 吸附物分子较大的，应选择大孔树脂中孔径大的。
常用吸附剂按其化学结构可分两类
有机吸附剂，如：活性炭、纤维素、大孔吸附 树脂、聚酰胺等
无机吸附剂，如：硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅 藻土、羟基磷灰石等
常用吸附剂简介
硅胶 是一种极性吸附剂，又是一种弱酸性阳离子交换
剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子， 遇较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附 碱性化合物； 应用于萜类、固醇、生物碱、酸性化合物、磷脂、 脂肪、氨基酸等的吸附分离。
HA的吸附机理
HA机理的主要观点是：HA的Ca2+和生物分子表 面的负电荷基团的结合，对生物分子的分离起重 要作用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的正 电荷基团的结合，则起次要作用。
大孔吸附树脂
特点 大孔型颗粒，其孔隙、骨架结构和极性可按需要选
层析分离技术
色层分离技术层析是根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行分离的方法又称色谱法，层离法，层析法;可用于生产规模，也可作为分析检测，控制产品的质量。
1903年，俄国植物学家Tswett提出色层分离法的概念1931年，Kuhn和Lederr在氧化铝和碳酸钙柱体上，以制备规模分离胡罗卜素和叶黄素。
1938年，适用范围扩展到无色物质。
1940～1943年间，Tswett提出了前流分析和置换分析法。
50年代，气相色谱Martin和Synge，60年代，液相色谱DNA重组技术的发展，制备色谱研究成为热点英国生物学家Martin和Synge(1952诺贝尔化学奖他们首先提出了色谱塔板理论。
以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。
其次，他们根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱。
特别是他们提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。
㈢ 层析的特点分离效率高：每米柱可达几千至几十万的塔板数，适于极复杂混合物的分离。
●应用范围广●选择性强：通过操作方法，洗脱方式和操作条件来实现。
●高灵敏度的在线检测：紫外、荧光、折光等●快速分离：高效层析剂和高压液相色谱●过程的自动化操作●色谱分离的规模：生物工业中的色谱分离色谱分析：<10mg 半制备：10～50mg 制备：0.1～10g 工业生产：>20g/d 分析色谱与制备及工业色谱的比较：⏹应用色谱技术范围不同：分析（柱，纸和薄板）；制备（柱）⏹操作上不同：分析（进样量越小越好，检测灵敏度越高越佳；制备（进样量越大越好，色谱柱适当大）⏹色谱分离理论不同：理论塔板数的不同；分配系数不同；样品保留值与峰高的不同互不混溶的两相分别称为固定相和流动相；料液中的溶质在固定相和流动相之间发生扩散传质，产生分配平衡，分配系数大的溶质随流动相移动的速度小。
层析分离技术图文
水处理中的有机物去除
利用层析分离技术，如活性炭吸附、 聚合物吸附等，可去除水中的有机污 染物，提高水质，保障饮用水安全。
05
层析分离技术的未来发展与挑战
新材料与新技术的研究与应用
新型吸附剂
研究具有高选择性、高吸附容量的新型吸附剂，以提高层析分离 的选择性和效率。
新型固定相
探索具有优异性能的新型固定相，以适应不同分离需求和条件。
层析分离技术图文
• 层析分离技术概述 • 层析分离技术的分类 • 层析分离技术的操作流程 • 层析分离技术的应用实例 • 层析分离技术的未来发展与挑战
01
层析分离技术概述
定义与原理
定义
层析分离技术是一种基于不同物质在 两相中的分配系数不同而实现分离的 物理分离方法。
原理
利用流动相和固定相的相互作用，使 混合物中的各组分在固定相和流动相 之间进行吸附、脱附、溶解、挥发等 过程，从而实现各组分的分离。
上样量控制
控制上样量，确保样品在柱子上得 到有效分离。
洗脱
洗脱液选择
根据分离需求选择合适的洗脱液，如有机溶剂、缓冲液等。
洗脱方式
采用适当的洗脱方式，如分段洗脱、梯度洗脱等。
洗脱速度控制
调节洗脱速度，确保样品得到充分分离。
检测与收集
检测方式
01
根据待分离组分的性质选择合适的检测方式，如紫外可见光谱、
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术，开发具有高分离性能的纳米尺度层析分 离材料。
提高分离效率与分辨率
优化分离条件
深入研究层析分离的原理和动力 学过程，优化分离条件，提高分 离效率和分辨率。
联用技术
将层析分离与其他分离技术联用， 实现多维分离，进一步提高分离 效果。
利用层析分离技术，如活性炭吸附、 聚合物吸附等，可去除水中的有机污 染物，提高水质，保障饮用水安全。
05
层析分离技术的未来发展与挑战
新材料与新技术的研究与应用
新型吸附剂
研究具有高选择性、高吸附容量的新型吸附剂，以提高层析分离 的选择性和效率。
新型固定相
探索具有优异性能的新型固定相，以适应不同分离需求和条件。
层析分离技术图文
• 层析分离技术概述 • 层析分离技术的分类 • 层析分离技术的操作流程 • 层析分离技术的应用实例 • 层析分离技术的未来发展与挑战
01
层析分离技术概述
定义与原理
定义
层析分离技术是一种基于不同物质在 两相中的分配系数不同而实现分离的 物理分离方法。
原理
利用流动相和固定相的相互作用，使 混合物中的各组分在固定相和流动相 之间进行吸附、脱附、溶解、挥发等 过程，从而实现各组分的分离。
上样量控制
控制上样量，确保样品在柱子上得 到有效分离。
洗脱
洗脱液选择
根据分离需求选择合适的洗脱液，如有机溶剂、缓冲液等。
洗脱方式
采用适当的洗脱方式，如分段洗脱、梯度洗脱等。
洗脱速度控制
调节洗脱速度，确保样品得到充分分离。
检测与收集
检测方式
01
根据待分离组分的性质选择合适的检测方式，如紫外可见光谱、
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术，开发具有高分离性能的纳米尺度层析分 离材料。
提高分离效率与分辨率
优化分离条件
深入研究层析分离的原理和动力 学过程，优化分离条件，提高分 离效率和分辨率。
联用技术
将层析分离与其他分离技术联用， 实现多维分离，进一步提高分离 效果。
《层析分离技术》课件
总结与展望
1 优势和局限性
层析分离技术具有高效、可靠、灵活等优势，但也存在一些局限性。
2 发展趋势
层析分离技术在分离纯化效果、自动化程度和快速分析方面的发展具有很大潜力。
层析分离技术的应用
1
蛋白质纯化技术
层析分离技术在蛋白质纯化过程中起到关键作用，实现高效的纯化和分离。
2
生物大分子制备
层析分离技术被广泛应用于生物大分子的制备过程，如核酸提取和多肽纯化。
3
制药过程中的应用
总站式层析技术在制药过程中用于分离和纯化药物及其他有关的化合物。
4
其他应用领域
层析分离技术还在食品工业、环境监测等领域得到广泛应用。
应用
层析分离技术广泛应用于蛋白质纯化、生物大分子制备等领域。
层析分离技术的基本原理
1 分子相互作用
层析分离技术基于分子之 间的相互作用，如电荷、 亲疏水性等。
2 物质分子分配系数
物质分子在不同相之间的 分配系数决定了其分离程 度。
3ห้องสมุดไป่ตู้层析柱构成要素
层析柱由填料、梯度溶剂 和流动相等要素构成，起 到分离和纯化作用。
层析分离技术的分类
分离机理
按照分离机理，层析 分离技术可分为吸附 层析、分配层析和离 子交换层析。
层状介质特性
根据层状介质的特性， 可将层析分离技术分 为薄层层析、柱层析 和高效液相层析。
介质形态
介质形态包括液态层 析、凝胶层析和纤维 素层析等。
操作方式
操作方式包括亲和层 析、吸附剂层析和凝 胶过滤层析等。
《层析分离技术》PPT课 件
层析分离技术是一种基于分子之间相互作用的分离技术，通过物质分子在不 同相之间的分配系数实现分离和纯化的方法。
层析分离技术
层析分离技术层析分离技术是一种重要的分离方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
它基于物质在不同相之间的分配差异，通过多次分配和分离步骤，将混合物中的组分分离开来。
本文将从层析分离技术的原理、类型和应用方面进行介绍。
一、层析分离技术的原理层析分离技术基于物质在不同相中的分配差异，利用不同相中物质的亲疏水性、极性、分子尺寸等特性进行分离。
其原理可以概括为：当混合物通过固定相（静相）时，不同组分会因其与固定相的相互作用力不同而以不同速度通过固定相，从而实现分离。
1. 柱层析：柱层析是最常见的层析分离技术，其主要包括液相层析和气相层析两种形式。
液相层析是在液相中进行分离，常见的有凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等；气相层析则是在气相中进行分离，常见的有气相色谱层析、气体吸附层析等。
2. 纸层析：纸层析是一种简单易行的层析分离方法，主要用于分离和鉴定有机化合物。
通过将样品溶液滴到纸上，然后在纸的一端浸入溶剂中，溶剂在纸上上升时，样品中的组分会因其与纸或溶剂的相互作用力不同而以不同速度迁移，从而实现分离。
3. 薄层层析：薄层层析是将样品溶液均匀涂布在薄层层析板上，然后将其浸入溶剂中进行分离。
薄层层析具有操作简便、分离效果好的特点，广泛应用于药物分析、天然产物分离等领域。
三、层析分离技术的应用1. 生物化学：层析分离技术在生物化学研究中得到广泛应用，如蛋白质纯化、核酸提取、酶活性分析等。
2. 药物分析：层析分离技术是药物分析中常用的方法之一，可以用于药物的纯化和分离、药物代谢产物的分析等。
3. 环境监测：层析分离技术可以用于环境中有机物、无机物和杂质的分离和测定，如水质检测、土壤污染分析等。
4. 食品安全：层析分离技术在食品安全领域也有广泛应用，可以用于食品中有害物质的检测和分离，如农药残留、重金属含量等。
层析分离技术作为一种重要的分离方法，具有原理简单、分离效果好、应用广泛的特点。
通过不同类型的层析分离技术，可以实现对混合物中不同组分的高效分离和纯化。
层析技术
3 5 5 5
4905(50) 3434(35) 1472(15) 981(10)
凝胶层析的基本操作
1．层析柱的选择 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来 进行选择。 一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层 析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起 柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。 层析柱的直径和长度比一般在1：25～1：100之间。 用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所 以一般比较短。
掉，以免污染凝胶柱。样品的黏度不能过大，否则会影响
分离效果。
5.洗脱速度
洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速 度要恒定而且合适。 保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流 泵，另一种是恒压重力洗脱。 洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗 粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基 质充分平衡，分离效果好。 但洗脱速度过慢会造成样品扩散。 一般凝胶的流速是2～10 ml／h，市售的凝胶一般会提 供一个建议流速，可供参考。
2.装柱
1）除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致， 装柱过程中温度也要恒定。 2）应调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有 利于装柱过程中气泡的排除。 3）将柱子固定在稳定的支架上，并保证其垂直。 4）先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出 液口，排出里面的气泡，特别是要捧除床底支持物 上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占 总柱体积的15％（保持柱内湿润）。
4.加样量
加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加 样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果； 加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验 效率低。 加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝 胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组 分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大。 注意：要尽量快速、均匀。
层析分离技术导论
柱层析分离技术
目录
? 柱层析分离的基本概念及其特点 ? 柱层析分离的分类和基本原理 ? 硅胶柱层析的应用
1. 柱层析分离的基本概念 :
? 柱层析分离是一种物理的分离过程，利用多组分 混合物中各组分的 物理化学性质的差异 ，使各组
分以不同程度分布在两个相 （固定相和流动相）
中。
? 当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物 理化学性质的差异，在固定相和流动相之间经过 多次分配 （吸附 -解吸-再吸附 -再解吸 …… ）以 不同的速率移动 ，从而达到分离的目的。
? V0——凝胶颗粒之间空隙的总体积 （即外水体积） ； ? Vi——凝胶颗粒内部空隙的总体积 （即内水体积） ； ? Vm——凝胶颗粒基质本身所占体积。
? 某溶质分子充满层析柱的体积（即洗脱容积Ve）为：
Ve=V0+ Kd Vi → Kd=(Ve-V0)/Vi
? Ve——被测分子的保留体积（见层析曲线） ? V0——可采用一个分子量远超过凝胶排阻极限的有色分子来测定，此时
柱层析的基本原理
利用待分离物质中各组分与固定相和流动 相的相互作用不同，通过多次相互作用将 不同组分逐渐分离。
柱层析的基本原理
1.吸附层析
? 原理：混合物随流动相通过固定相（吸附剂） 时，由于固定相对不同物质的 吸附力不同 而使 混合物得到分离。
? 传统吸附剂： 氧化铝、硅胶、活性炭、磷酸钙 等。
? 在凝胶层析中衍生出 分配常数Kd
1．分配系数
分配系数 K
? 在分配层析中 ，分配系数：类似于溶剂萃
取中的分配系数 K=cs/cm
? cs、cm分别为溶质在固定相和流动相中的浓度， ? K为分配系数。
? 在一定温度下，当溶质的浓度较低时， K为常数——线性 色谱；
目录
? 柱层析分离的基本概念及其特点 ? 柱层析分离的分类和基本原理 ? 硅胶柱层析的应用
1. 柱层析分离的基本概念 :
? 柱层析分离是一种物理的分离过程，利用多组分 混合物中各组分的 物理化学性质的差异 ，使各组
分以不同程度分布在两个相 （固定相和流动相）
中。
? 当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物 理化学性质的差异，在固定相和流动相之间经过 多次分配 （吸附 -解吸-再吸附 -再解吸 …… ）以 不同的速率移动 ，从而达到分离的目的。
? V0——凝胶颗粒之间空隙的总体积 （即外水体积） ； ? Vi——凝胶颗粒内部空隙的总体积 （即内水体积） ； ? Vm——凝胶颗粒基质本身所占体积。
? 某溶质分子充满层析柱的体积（即洗脱容积Ve）为：
Ve=V0+ Kd Vi → Kd=(Ve-V0)/Vi
? Ve——被测分子的保留体积（见层析曲线） ? V0——可采用一个分子量远超过凝胶排阻极限的有色分子来测定，此时
柱层析的基本原理
利用待分离物质中各组分与固定相和流动 相的相互作用不同，通过多次相互作用将 不同组分逐渐分离。
柱层析的基本原理
1.吸附层析
? 原理：混合物随流动相通过固定相（吸附剂） 时，由于固定相对不同物质的 吸附力不同 而使 混合物得到分离。
? 传统吸附剂： 氧化铝、硅胶、活性炭、磷酸钙 等。
? 在凝胶层析中衍生出 分配常数Kd
1．分配系数
分配系数 K
? 在分配层析中 ，分配系数：类似于溶剂萃
取中的分配系数 K=cs/cm
? cs、cm分别为溶质在固定相和流动相中的浓度， ? K为分配系数。
? 在一定温度下，当溶质的浓度较低时， K为常数——线性 色谱；
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A 准备材料
柱子 层析材料
B 装柱
先关闭柱出口，用溶剂灌注至1/3体积，并使 支持板下的“死体积”不存在气泡，再慢慢地
向溶剂中加层析材料，注意不要使气泡留在
柱内。为避免分层，最好一次装完到需要的 高度。最后加一张圆形滤纸或尼龙布，以免 加样时扰乱床表面。
C 上样
上样前，加溶剂使样品溶解或对样品液过滤，然后 将样品小心加到层析床的表面，打开旋塞使液面与
操作步骤:
1 层析柱的选择
◆层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要 求来进行选择。 ◆ 长度不超过100 cm，为得到高 分辨率，可串联使用。层析柱的 直径和长度比一般在1:25～1:100 之间。
2 凝胶前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡
24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物
为了精确的衡量混合物中各成分在柱内的洗
脱行为，采用分配系数Kd度量。
Kd = (Ve-Vo) / Vi Ve＝某一成分从层析柱内完全被洗脱出来时 洗脱液的体积 Vo＝层析柱内凝胶颗粒之间空隙的总容积
Vi＝层析柱内凝胶颗粒内部的总容积
1 外水体积V0:
凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体
积，即凝胶颗粒间液体流动相的体积。
缺点
配基与基质的共价结合需要烦琐的操 作步骤
（4）应用 分离和纯化； 纯化人工合成的多肽和蛋白质；
解释酶作用机制；
强酸性阳离子交换树脂
阳离子交换树脂 中酸性阳离子交换树脂 弱酸性阳离子交换树脂
分 类
强碱性阴离子交换树脂 阴离子交换树脂 中碱性阴离子交换树脂 弱碱性阴离子交换树脂
阳离子交换剂
阳离子交换剂中的可解离基团是磺酸（-SO3H）
、磷酸（-PO3H2）、羧酸（COOH）和酚羟基
（-OH）等酸性基团。
交换剂在交换时反应如下：
6 凝胶的保存
A 湿法保存 防腐剂硫柳汞,0.005%,使用时水洗除去; 加入氯仿, 使用时60度水浴除去;
60~70%乙醇溶液。
B 干法保存
凝胶
抽去过量水
加入乙醇（0~95%）
抽干
60~80℃烘干
凝胶层析分离血红蛋白和鱼精蛋白（示教）
• Sephadex G-50凝胶柱及样品准备 • 上样 洗脱 • 观察红色的色带(分子量大的血红蛋白)先 洗脱下来,黄色的色带(分子量小的DNP-鱼 精蛋白)后洗脱下来 • 注意勿搅动床面,避免干柱
操作形式
薄层层析
纸层析
薄膜层析
四、常见的层析技术
1 柱层析
(1) 原理 利用混合物中各组分在层析介质中的吸附或溶解性
能的不同或亲和作用性能的差异,使混合物的溶液流
经该介质时，待测组分与层析介质进行反复的吸附
或分配,从而将各组分分开。
(2) 分类 吸附柱色谱（常用）
分配柱色谱
(3) 组成
(4)操作步骤
R-COOH＋Na+
R-COONa＋H+
阴离子交换剂 阴离子交换剂中的可解离基因是伯胺(-NH2)、仲 胺(-NHCH3)、叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N(CH3)2] 等碱性基团。
（3）交换原理
(4)操作步骤
A 树脂的前处理
树脂干粉 加水浸泡2h 减压抽气泡 加2N HCl搅拌4h 水洗至中性
◆流动相：
在层析过程中，推动固定相上待分离的物 质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为 流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析 时称为展开剂。
三、层析法的分类
气相(气-液;气-固)层析 两相所处状态
液相(液-液;液-固)层析
分离机制
薄层吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析
柱层析
取用上述方法制好的薄层板
用毛细管吸少许样品液
距离薄层板一端约1cm处点样
将点好的样晾干或吹干
放入展开槽中展开
取出色层板
实例
叶绿素的柱色谱分离
原理：
绿色植物的叶和茎中含有胡萝卜素(C40H56)、叶黄素
(C40H56O2)、叶绿素a(C55H72MgN4O5)和叶绿素b
(C55H70MgN4O6)。这些色素易被80%丙酮或石油醚－乙醇混 合液萃取，从植物茎、叶中浸提出来。对于浸提出来的 色素混合物，然后采用氧化铝柱色谱(LCC)进行分离。
操作流程
用20mL95% 乙醇浸泡8h 提取液置于 分液漏斗 过滤
取青菜叶
加10mL石油醚
加50mLH2O
加无水硫 酸钠干燥 湿法 装柱 加样品
水洗醚层
静置分层 放出水层
加石油醚-丙酮溶液洗脱
收集洗脱液
硅胶柱操作:(示教)
薄层层析:（示教）
提问:
1 如何装硅胶柱?
2 薄层板如何制作?
2 凝胶柱层析
5 亲合层析
概述 基本原理 操作步骤 应用
（1）概念 利用生物分子之间专一的亲和力而进行分 离的层析技术。
对蛋白质、酶等生物大分子特别有效。
（2）基本原理——生物专一吸附
要成功地利用亲合层析技术分离纯化物质需要具备：
良好的固相载体
三 要 素
配基：强的亲和力，如抗原-抗体、 激素-受体、DNA-互补的DNA或RNA、 凝集素-糖蛋白。 耦合反应：
床面齐，然后连接溶剂池，保持一定高度的液面。
D 洗脱
用适当的洗脱液把各组分依次从柱子上洗脱下
来。一般情况下，使用梯度洗脱法，即先用一种
洗脱液将一个组分洗脱下来，然后更换新洗脱液
洗脱另一个组分。也可以逐渐改变溶剂的性质，
使洗脱液形成一个离子强度、pH或极性递增梯度
从而使各组分依次被洗脱下来。
E 收集及分析
可以用人工的方法将流出液收集到一系列的试管
中或使用自动部分收集器收集流出液。收集完毕
后可以通过合适的方法馏分进行检测。
梯 度 制 造 器
(1) (3)
(2)泵
adaptor
记录器
(4)
缓 冲 液
A
管 柱
胶 体
监 视 器
(5)
自 动 收 集 器
薄层层析（Thin layer chromatography) a 原理 利用吸附剂对样品中各成分吸附能力的不
第十章
层析分离技术
一、概述
1903-1906年，俄国植物学家Michael Tswett利用碳 酸钙分离色素的时候发现了层析现象。
◆后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 ◆1944年出现纸层析。
◆层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液
相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。
层析技术，又称色谱技术，是一种物理分离方 法，利用混合物中各组分的理化性质差异，使各 组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为 固定相，另一个相则流过此固定相并使各组分以 不同速度移动，从而达到分离的目的。
凝胶层析又称凝胶过滤、分子筛层析、排阻层
析、凝胶渗透层析，等等。以多孔性凝胶填料为
固定相，按分子大小顺序分离样品中各组分的液
相色谱方法。
基本原理
凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的
混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下 移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能 不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过 的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
2 内水体积： 凝胶颗粒中孔穴的体积，即是凝 胶层析中固定相体积。 3 基质体积：凝胶颗粒实际骨架体积。 4 柱床体积：凝胶柱所能容纳的总体积。
Vt＝Vo＋Vi＋Vg
Vt＝Vo＋Vi
Kd 全排阻于凝胶 颗粒之外，分布于流动 相之中。
Kd = 1，Ve = V0+Vi 分子均匀分布在流动 相和固定相中
同和展开剂对吸附成分解吸能力的不同，
使各成分达到分离。
b 操作
准备薄层板 点样 展开 检识
取7.5×2.5cm左右的载玻片2片，洗净晾干。
称一定量的硅胶 加入0.5%羧甲基纤维素钠水溶液 涂于洁净的载玻片上， 制成厚薄均匀的薄层板 放入烘箱（110℃）恒温0.5h
调成均匀的糊状 室温放置0.5h 取出，冷却后备用
特异性洗脱
凝集素为配体分离糖蛋白 单糖洗脱 与待分离物质亲和力强的物质作
洗脱方式
为洗脱剂：如染料作为配基分离 脱氢酶
DNA+
非特异性洗脱：改变洗脱缓冲液的pH、温度、 离子强度来洗脱。
再生方法：
用大量洗脱剂连续洗涤柱子一断时间，然 后再用平衡缓冲液平衡，再生成功。
纯化过程简单、迅速
优点
分离效率高 分离条件温和 针对某一分离对象需要专一的吸附剂和 相应的实验条件
4 上样
A 装好层析装置后，打开下端出口，使溶液流出至 刚好达到凝胶胶面； B 沿柱壁缓慢加入样品，打开下端出口，使样品 溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓 冲液洗涤柱壁； C 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱；
D 用自动部分收集器自动或手动收集，合并同 一高峰各管。
5 凝胶的再生 用过的凝胶经0.5N的NaOH和HCl溶液分别处理后 可以恢复其性能。
及蒸馏水。 碱洗：用0.5 N NaOH 溶液浸泡半个小时，然后用 蒸馏水洗至中性。 酸洗：用0.5 N HCl 溶液浸泡半个小时，然后用 蒸馏水洗至中性。 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与 起始缓冲液相同。
3 装柱 将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。 将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至 1/4~1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵 入凝胶至沉降到所需高度。 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平 衡，柱床稳定。
去离子水洗至澄清 水洗至中性
加2N NaOH搅拌4h
加酸或碱转型(备用)
B 装柱
柱子 层析材料
B 装柱
先关闭柱出口，用溶剂灌注至1/3体积，并使 支持板下的“死体积”不存在气泡，再慢慢地
向溶剂中加层析材料，注意不要使气泡留在
柱内。为避免分层，最好一次装完到需要的 高度。最后加一张圆形滤纸或尼龙布，以免 加样时扰乱床表面。
C 上样
上样前，加溶剂使样品溶解或对样品液过滤，然后 将样品小心加到层析床的表面，打开旋塞使液面与
操作步骤:
1 层析柱的选择
◆层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要 求来进行选择。 ◆ 长度不超过100 cm，为得到高 分辨率，可串联使用。层析柱的 直径和长度比一般在1:25～1:100 之间。
2 凝胶前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡
24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物
为了精确的衡量混合物中各成分在柱内的洗
脱行为，采用分配系数Kd度量。
Kd = (Ve-Vo) / Vi Ve＝某一成分从层析柱内完全被洗脱出来时 洗脱液的体积 Vo＝层析柱内凝胶颗粒之间空隙的总容积
Vi＝层析柱内凝胶颗粒内部的总容积
1 外水体积V0:
凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体
积，即凝胶颗粒间液体流动相的体积。
缺点
配基与基质的共价结合需要烦琐的操 作步骤
（4）应用 分离和纯化； 纯化人工合成的多肽和蛋白质；
解释酶作用机制；
强酸性阳离子交换树脂
阳离子交换树脂 中酸性阳离子交换树脂 弱酸性阳离子交换树脂
分 类
强碱性阴离子交换树脂 阴离子交换树脂 中碱性阴离子交换树脂 弱碱性阴离子交换树脂
阳离子交换剂
阳离子交换剂中的可解离基团是磺酸（-SO3H）
、磷酸（-PO3H2）、羧酸（COOH）和酚羟基
（-OH）等酸性基团。
交换剂在交换时反应如下：
6 凝胶的保存
A 湿法保存 防腐剂硫柳汞,0.005%,使用时水洗除去; 加入氯仿, 使用时60度水浴除去;
60~70%乙醇溶液。
B 干法保存
凝胶
抽去过量水
加入乙醇（0~95%）
抽干
60~80℃烘干
凝胶层析分离血红蛋白和鱼精蛋白（示教）
• Sephadex G-50凝胶柱及样品准备 • 上样 洗脱 • 观察红色的色带(分子量大的血红蛋白)先 洗脱下来,黄色的色带(分子量小的DNP-鱼 精蛋白)后洗脱下来 • 注意勿搅动床面,避免干柱
操作形式
薄层层析
纸层析
薄膜层析
四、常见的层析技术
1 柱层析
(1) 原理 利用混合物中各组分在层析介质中的吸附或溶解性
能的不同或亲和作用性能的差异,使混合物的溶液流
经该介质时，待测组分与层析介质进行反复的吸附
或分配,从而将各组分分开。
(2) 分类 吸附柱色谱（常用）
分配柱色谱
(3) 组成
(4)操作步骤
R-COOH＋Na+
R-COONa＋H+
阴离子交换剂 阴离子交换剂中的可解离基因是伯胺(-NH2)、仲 胺(-NHCH3)、叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N(CH3)2] 等碱性基团。
（3）交换原理
(4)操作步骤
A 树脂的前处理
树脂干粉 加水浸泡2h 减压抽气泡 加2N HCl搅拌4h 水洗至中性
◆流动相：
在层析过程中，推动固定相上待分离的物 质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为 流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析 时称为展开剂。
三、层析法的分类
气相(气-液;气-固)层析 两相所处状态
液相(液-液;液-固)层析
分离机制
薄层吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析
柱层析
取用上述方法制好的薄层板
用毛细管吸少许样品液
距离薄层板一端约1cm处点样
将点好的样晾干或吹干
放入展开槽中展开
取出色层板
实例
叶绿素的柱色谱分离
原理：
绿色植物的叶和茎中含有胡萝卜素(C40H56)、叶黄素
(C40H56O2)、叶绿素a(C55H72MgN4O5)和叶绿素b
(C55H70MgN4O6)。这些色素易被80%丙酮或石油醚－乙醇混 合液萃取，从植物茎、叶中浸提出来。对于浸提出来的 色素混合物，然后采用氧化铝柱色谱(LCC)进行分离。
操作流程
用20mL95% 乙醇浸泡8h 提取液置于 分液漏斗 过滤
取青菜叶
加10mL石油醚
加50mLH2O
加无水硫 酸钠干燥 湿法 装柱 加样品
水洗醚层
静置分层 放出水层
加石油醚-丙酮溶液洗脱
收集洗脱液
硅胶柱操作:(示教)
薄层层析:（示教）
提问:
1 如何装硅胶柱?
2 薄层板如何制作?
2 凝胶柱层析
5 亲合层析
概述 基本原理 操作步骤 应用
（1）概念 利用生物分子之间专一的亲和力而进行分 离的层析技术。
对蛋白质、酶等生物大分子特别有效。
（2）基本原理——生物专一吸附
要成功地利用亲合层析技术分离纯化物质需要具备：
良好的固相载体
三 要 素
配基：强的亲和力，如抗原-抗体、 激素-受体、DNA-互补的DNA或RNA、 凝集素-糖蛋白。 耦合反应：
床面齐，然后连接溶剂池，保持一定高度的液面。
D 洗脱
用适当的洗脱液把各组分依次从柱子上洗脱下
来。一般情况下，使用梯度洗脱法，即先用一种
洗脱液将一个组分洗脱下来，然后更换新洗脱液
洗脱另一个组分。也可以逐渐改变溶剂的性质，
使洗脱液形成一个离子强度、pH或极性递增梯度
从而使各组分依次被洗脱下来。
E 收集及分析
可以用人工的方法将流出液收集到一系列的试管
中或使用自动部分收集器收集流出液。收集完毕
后可以通过合适的方法馏分进行检测。
梯 度 制 造 器
(1) (3)
(2)泵
adaptor
记录器
(4)
缓 冲 液
A
管 柱
胶 体
监 视 器
(5)
自 动 收 集 器
薄层层析（Thin layer chromatography) a 原理 利用吸附剂对样品中各成分吸附能力的不
第十章
层析分离技术
一、概述
1903-1906年，俄国植物学家Michael Tswett利用碳 酸钙分离色素的时候发现了层析现象。
◆后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 ◆1944年出现纸层析。
◆层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液
相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。
层析技术，又称色谱技术，是一种物理分离方 法，利用混合物中各组分的理化性质差异，使各 组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为 固定相，另一个相则流过此固定相并使各组分以 不同速度移动，从而达到分离的目的。
凝胶层析又称凝胶过滤、分子筛层析、排阻层
析、凝胶渗透层析，等等。以多孔性凝胶填料为
固定相，按分子大小顺序分离样品中各组分的液
相色谱方法。
基本原理
凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的
混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下 移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能 不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过 的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
2 内水体积： 凝胶颗粒中孔穴的体积，即是凝 胶层析中固定相体积。 3 基质体积：凝胶颗粒实际骨架体积。 4 柱床体积：凝胶柱所能容纳的总体积。
Vt＝Vo＋Vi＋Vg
Vt＝Vo＋Vi
Kd 全排阻于凝胶 颗粒之外，分布于流动 相之中。
Kd = 1，Ve = V0+Vi 分子均匀分布在流动 相和固定相中
同和展开剂对吸附成分解吸能力的不同，
使各成分达到分离。
b 操作
准备薄层板 点样 展开 检识
取7.5×2.5cm左右的载玻片2片，洗净晾干。
称一定量的硅胶 加入0.5%羧甲基纤维素钠水溶液 涂于洁净的载玻片上， 制成厚薄均匀的薄层板 放入烘箱（110℃）恒温0.5h
调成均匀的糊状 室温放置0.5h 取出，冷却后备用
特异性洗脱
凝集素为配体分离糖蛋白 单糖洗脱 与待分离物质亲和力强的物质作
洗脱方式
为洗脱剂：如染料作为配基分离 脱氢酶
DNA+
非特异性洗脱：改变洗脱缓冲液的pH、温度、 离子强度来洗脱。
再生方法：
用大量洗脱剂连续洗涤柱子一断时间，然 后再用平衡缓冲液平衡，再生成功。
纯化过程简单、迅速
优点
分离效率高 分离条件温和 针对某一分离对象需要专一的吸附剂和 相应的实验条件
4 上样
A 装好层析装置后，打开下端出口，使溶液流出至 刚好达到凝胶胶面； B 沿柱壁缓慢加入样品，打开下端出口，使样品 溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓 冲液洗涤柱壁； C 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱；
D 用自动部分收集器自动或手动收集，合并同 一高峰各管。
5 凝胶的再生 用过的凝胶经0.5N的NaOH和HCl溶液分别处理后 可以恢复其性能。
及蒸馏水。 碱洗：用0.5 N NaOH 溶液浸泡半个小时，然后用 蒸馏水洗至中性。 酸洗：用0.5 N HCl 溶液浸泡半个小时，然后用 蒸馏水洗至中性。 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与 起始缓冲液相同。
3 装柱 将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。 将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至 1/4~1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵 入凝胶至沉降到所需高度。 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平 衡，柱床稳定。
去离子水洗至澄清 水洗至中性
加2N NaOH搅拌4h
加酸或碱转型(备用)
B 装柱