第九章免疫学方法及其应用(修改)

2、抗体的基本结构
两条重链(H链) 440个氨基酸残基组成，分子量约50～70kD 二硫键(-S· S-) 两条轻链(H链) 220个氨基酸组成，分子量约22.5kD。
根据重链的氨基酸顺序同源程度的差异，可将Ig分为类和亚 类。人的免疫球蛋白共5类：IgG 、IgA 、Ig M、IgD和IgE
2、抗体的基本结构
1、抗体的性质
（3）由不同细胞克隆产生的抗体具有不均一性和结构的 多样性。
例如将血清电泳时，免疫球蛋白主要分布于γ 球蛋白区，因而曾称抗体 为γ 球蛋白，也有少量延伸到β 区和α 2区。
抗体作为一种球蛋白，对异种动物又是很好抗原。因此,抗体 即是抗体，又是抗原。利用此种特性可以制备抗免疫球蛋白 抗体(或称抗抗体)，用于荧光抗体技术中(间接法)。
4、人工制备抗体
（2）单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb) 原理: 淋巴细胞增殖分化的浆细胞 (来自脾脏，有抗原特异性,能产生抗体，但短寿) 骨髓瘤细胞 (无抗原特异性，但长寿，能在体外无限繁殖) 利用原生质体融合技术进行细胞融合， 获得既能在体外培养又能产生单一抗体的杂交瘤细胞。 特点：纯度高、特异性强、效价高、无或少血清交叉反应， 制备成本低等特性。 已广泛用作临床诊断试剂或生化治疗剂。
类型：环状法、絮状法和琼脂扩散法（单向和双向）。
三、主要抗原抗体反应
图7-5 琼脂双向扩散的几种不同方式结果示意图
3、免疫电泳 将琼脂扩散和电泳技术相结合的血清学检验方法。 特点：特异性强、很高的灵敏性和分辨力。 用途：分析抗原或抗体纯度。 类型：对流免疫电泳、火箭电泳、双向免疫电泳、琼脂免疫 电泳。 （1）对流免疫电泳 这是一种将双向扩散与电泳技术结合而成的方法。 原理：抗原与抗体分别置于凝胶板电场负、正极附近的小孔 中，通电后，抗原向正极移动，而抗体则向负极移动 ，结果在两孔间合适的抗原、抗体浓度处会形成一条 沉淀线。 乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和甲种胎儿蛋白(AFP)等的检测。
（2）细菌抗原
2、抗原的种类
（2）细菌抗原
①菌体抗原 （O抗原） 在细胞壁上，主要抗原。主要成分为脂多糖。根据O抗原的 组成不同进行分群。 O抗原耐热，121℃，2h不被破坏。 如沙门氏菌属的O抗原不同分成67个血清群。 ②鞭毛抗原（H抗原） 在鞭毛中，由蛋白质组成，具有不同的种和型特异性，可作 菌型鉴别。 H抗原不耐热，56～80℃，30～40min即被破坏。 在制备O抗原时常用煮沸法消除H抗原。
(二)、抗 体
1、抗体的性质 （1）免疫球蛋白是一种糖蛋白，具有蛋白质的通性。 凡能破坏球蛋白的各种理化因素均能使之灭活；能被多 种蛋白水解酶裂解；可以在乙醇、三氯醋酸或中性盐类 中沉淀，生产上常用50%饱和硫酸铵或硫酸钠从免疫血 清中提取抗体球蛋白。
（2）在体外 (试管内)，抗体可与相应的抗原发生特异性结 合并出现可见反应； 在体内，与其他防御机能协同作用下杀灭病原菌，起 到抗感染作用。 但某些抗体在机体内与相应的抗原相遇时，能引起变态反应。 如青霉素过敏等。
包括两个基本内容： （1）免疫原性：抗原刺激有机体产生特异性免疫反 应的能力； （2）反应原性：抗原与相应抗体在体内或体外发生 特异性结合反应的能力； 抗原性：免疫原性和反应原性的统称。
(一)、抗 原
1、抗原的基本性质 （1）异物性 （2）大分子量 （3）特异性 抗原刺激机体后只能产生相应的抗体并能与之结合。 特异性是由抗原表面的抗原决定基(簇) 决定的。 抗原决定基（表位）：抗原分子中决定抗原特异性的基 本结构或具有化学活性的基团。 抗原决定基是与抗体特异性结合的基本单位。 （4）化学结构复杂 免疫原性的形成还要求蛋白质分子的化学结构复杂。极性基 团愈多或含支链氨基酸愈多，以及带芳香族氨基酸多的蛋白 质抗原性愈强。
CDR区 识别抗原 N端 重链 可变区
轻链 构架区 恒定区
键间二硫键
C端
2、抗体的基本结构
3、抗体的种类
（1）根据抗体获得方式分类 ①免疫抗体 动物患传染病后或经人工注射疫苗后产生 ②天然抗体 动物先天就有的抗体，可以遗传给后代 机体对自身组织成分产生的抗体 ③自身抗体 （2）根据抗体作用对象分类 ①抗菌性抗体 细菌或内毒素刺激机体所产生的抗体
2、抗原的种类
按抗原性的完整与否及其在机体内刺激抗体产生的特点， 可分为完全抗原和不完全抗原。 （1）完全抗原与不完全抗原 ①完全抗原 既有免疫原性又有反应原性。即能刺激机体产生抗体，并 与产生的抗体在体内或体外(试管内)发生反应的抗原。 如细菌、病毒、外毒素、血清白蛋白、花粉蛋白、 ②不完全抗原（半抗原） 只有反应原性而没有免疫原性。即不能单独刺激机体产生 抗体，若与蛋白质或胶体颗粒结合，形成大分子复合物成 为完全抗原，则可刺激机体产生抗体。 如各种低分子量的药物、脂类和多糖等都属于不完全抗原。
三、主要抗原抗体反应
(二)、沉淀反应 定义：可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在条 件下，形成肉眼可见的沉淀物。（沉淀原，沉淀素）
凝集反应与沉淀反应的区别： 凝集反应的抗原是颗粒性抗原，总表面积小，做抗体稀释。 沉淀反应的抗原是可溶性的胶体溶液，单位面积抗原多，需 抗体量多，抗原稀释。 以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。
抗原抗体反应的一般特点
1.特异性与交叉性 特异性：一种抗原只能与它相应的抗体结合。 交叉性：两种不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、 抗体间构型部分相同，就可出现交叉反应。 2.可逆性 抗体与抗原的结合是分子表面的一种物理结合即非共价键的结 合，在一定条件下可以发生解离。分开后，二者的性质不变。 3.定比性 抗原物质是多价的；抗体是双价的。 抗原抗体的结合是抗原—抗体—抗原—抗体这样顺次结合，只有 当两者比例合适时，聚集成较大的复合物才能出现可见反应。
(二)、抗 体(antibody,Ab)
定义：抗原刺激有机体(人或动物)所产生的具有特异性的免疫 球蛋白。 抗体是由B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类糖 蛋白，能与相应抗原表位结合，是介导体液免疫的重要免疫分 子。
在血清和组织液中，占全部机体血清的 分泌型(secreted Ig,sIg)： 20%～25%。具有抗体的各种免疫功能 膜型(membrane Ig,mlg)：是B细胞表面的抗原受体。 含有免疫球蛋白的血清，称为免疫血清或抗血清。
4、人工制备抗体
（3）基因工程抗体（重组抗体） 在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成的 新型抗体分子。。
特点：保留天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少 了无关结构，并可赋予抗体分子以新的生物学活性。 迄今已成功构建多种基因工程抗体，如人-鼠嵌合抗体、人源化 抗体、单链抗体(ScFv)、双特异性抗体(BsAb)及噬菌体抗体等。
抗原抗体反应的一般特点
3.定比性
每一个Y字形的Ig单 体分子能结合2个抗 原表位，称之为两 价； 分泌型IgA为4 价；五聚体IgM理论 上为10价，但由于 立体构型 的空间阻 位，一般只能结合5 个抗原表位。
图7-4 沉淀反应的曲线
抗原抗体反应的一般特点
4.阶段性 第一阶段：发生特异性反应，特点是反应快，不被肉眼所见。 第二阶段：可见阶段，是非特异性的。反应较慢，受到电解 质、pH值和温度的影响。 5.敏感性 高度的敏感性，用于定性，还可用于定量和定位。
免疫学几个基本概念
1.免疫和免疫学
病原微生物感染
机体对抗 免疫
传统的免疫概念：机体抵抗病原微生物的能力，即抗传染免疫 免疫(immunity)：是人和动物机体的一种保护性反应， 其作用是“识别”和排除抗原性“异物”，以维持机 体生理的平衡和稳定。 免疫学：研究机体自我识别和对抗原性异物排斥反应 的一门科学。
第四节 免疫学方法及其应用
一. 抗原与抗体反应的一般规律
抗原抗体反应：抗原与相应抗体之间在体内或体外所发生的 特异性结合反应。
体内反应：介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用； 体外反应：根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的 介质不同，可出现凝集反应、沉淀反应、补体结 合反应及中和反应等各种不同的反应类型。 因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多用血清作 试验，故体外抗原抗体反应亦称为血清学反应。
影响抗原抗体反应的因素
1.电解质 2.温度 3.pH值 0.85％的NaCl生理盐水 37℃水浴 多数血清学反应的适宜pH值为6～8
4.杂质异物
二、抗原、抗体间的主要反应
1、凝集反应 2、沉淀反应 3、免疫电泳 4、补体结合实验
三、主要抗原抗体反应
(一)、凝集反应 定义：颗粒性抗原与相应的抗体在有电解质合适条件下反应 并出现肉眼可见的凝集团现象。（凝集原，凝集素） 一般稀释抗体(抗血清)，使其与抗原有一合适比例。 1 直接凝集反应 ①玻片法 定性试验。用已知抗体检测未知抗原。 用途：鉴定菌种，菌种分型，测定ABO血型等。 ②试管法 定量试验。用已知抗原测定血清中抗体有无及相对含量 发生明显凝集现象的最高血清稀释度（抗体效价，滴度 )，以表示血清中抗体的相对含量。 用途：测定患传染病的人或家畜血清中的抗体，诊断
4、人工制备抗体
单克隆抗体制备示意图
4、人工制备抗体
（2）单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb) 应用：已广泛用作临床诊断试剂或生化治疗剂。 ①对微生物病原体的鉴定。 ②特异性抗原或肿瘤相关蛋白质的检测和鉴定。 ③疾病的被动免疫治疗和生物导向药物的制备。 ④检测血液中的药物含量。 ⑤分离某些昂贵的生物活性物质。
②抗毒性抗体 细菌外毒素刺激机体产生的抗体 ③抗病毒性抗体 病毒刺激机体而产生的抗体，阻止病毒侵害
④过敏性抗体 异种动物血清进入机体后所产生的使动物发生过敏
反应的抗体
4、人工制备抗体
（1）多克隆抗体(polyclonal antibody，PoAb) 定义： 将抗原免疫动物，刺激动物体内多个B细胞克隆产生 的抗体，是针对多种抗原决定基的混合抗体。 特点： 来源广泛、制备容易，但不易大量制备； 特异性不高，常出现交叉反应； 评价：应用受到限制。