产纤维素酶低温菌株的分离鉴定

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纤维素分解细菌的分离和鉴定

纤维素分解细菌的分离和鉴定一．实验目的：1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定．2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。

3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进化树．来研究其分类情况。

4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据。

二．实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。

应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。

由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。

将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。

用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。

三、实验仪器：1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层；2、培养基：初筛培养基。

浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。

：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。

无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。

把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌；3、复筛培养基。

浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。

NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。

一株高产低温纤维素酶南极细菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究

５［（Ｆ２０２ｓｕｏｌｒｍｎｓｉｅ８－Ａ５９６）ｅｄａｅｏａｔａ＂Ｐｔｏｃｒ
统发育分析采用Ｍｅａ．ｇ３１软件的邻接法（ｉｈｏ— Ｎｅｇｂｒ
ｊｉｉｇｍｅｈｄ进行。ｏｎｎｔｏ）１５菌株产酶条件的研究．
１４菌株的鉴定．
将南极嗜冷菌Ｎ６Ｊ４的１ＳｒＮＡ的ＰＲ克隆子６ＤＣ进行测序，获得长度为１９ｐ的１ＳｒＮＡ序列，３０ｂ６Ｄ将
ＤＮＡ模板的制备［：５Ｌ菌体培养液加入到３将Ｏ］１０肚０Ｌ预冷的蒸馏水中，冰上放置１ｈ以上或者３在
酶液，别在０ｏ、０ｏ２３分１ＣＣ、０ｏ０℃ 、０℃ 、０ ℃ 及Ｃ、４５
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（Ｂｏ３９翻出ｆＡ００８）删
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图１Ｎ６Ｊ４系统发育树
Ｆｇ１ＰｙｏｅｅｉｒｅｏｔａｎＮ６ｉ．ｈｌｇｎｔｃｔｅｆｓｒｉＪ４
温纤维素酶菌株Ｎ６，过１ＳｒＮＡ序列进行鉴Ｊ４通６Ｄ
定，并对其产酶条件及酶学性质进行初步研究，以期为
南极低温纤维素酶的开发利用奠定基础。
基金项目：家自然科学基金资助项目（０７１７国４８６０）
胨５ｇ酵母粉１ｇ用过滤陈海水定容至１０、；００ｍＬ，Ｈｐ

产纤维素酶细菌的分离和生物学性质研究(实验内容)

产纤维素酶细菌的分离和生物学性质研究XXX1， XXX2， XXX3（XX大学XX学院XX专业：XXX）摘要：从土壤中分离到2株菌株，通过刚果红染色法和羧甲基纤维素酶活力法筛选，得到1株产纤维素酶能力强的菌株，经测定，其最佳酶活力pH为7.关键词：纤维素酶; 细菌;Bacterial Cellulose Enzyme in the Separation and Biological Properties Research(By LIU Junbin, MO Yanhong, PENG Qiuxia)ABSTRACT:From the soil to two strains isolated, separated by Congo red stain and carboxymethyl cellulose enzyme screening method, a strain of cellulase ability by the strains, best enzyme pH of 7.KEYWORDS:Cellulose; Bacteria纤维素是地球上分布最广，含量最丰富的碳源物质，对人类而言，它又是自然界中数量最大的、永不枯竭的可再生资源．纤维素可被纤维素酶降解生成葡萄糖，因此纤维素酶研究开发和应用是植物资源再利用的主要途径．微生物是纤维素酶的主要来源，其中主要有细菌、放线菌和真菌，目前研究的最清楚的是霉菌中的里氏木霉T．reesei．细菌产纤维素酶的产量较少，主要是葡聚糖内切酶，大多数对结晶纤维素无降解活性，且所产生的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度，因此对细菌纤维素酶的研究较少．但由细菌产生的纤维素酶的等电点一般为中性或碱性，近十年来随着中性和碱性纤维素酶在清洗、纺织等方面应用前景广阔，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用性能和巨大的经济价值.1 材料与方法1.1 材料1）土壤来源土样采自XXX大学校生命XXX有腐烂枯树叶堆积的底层。

产纤维素酶真菌的分离和鉴定

产纤维素酶真菌的分离、筛选与鉴定一、采样地点：深圳大学杜鹃山深圳大学文科楼荔枝园深圳大学文山湖树丛用具：灭菌信封小铁铲小刀分离培养基手套采样的方法：取采样地点的表层土或地面15cm下的土样约10g，装入信封，立刻到实验室分离纯化二、培养基：（1）马丁氏培养基：KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂20.0 g、水1000ml，pH 自然。

（2）PDA培养基：PDA培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20 %土豆浸出液，1 %葡萄糖，2 % Agar。

20 %土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。

（均需要加入抗生素100μg/ml）产酶筛选培养基（CMC培养基）：羧甲基纤维素钠（CMC）20.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母抽提物2.0 g、NaCl 5.0g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂20g、蒸馏水1 000ml。

1%CMCNa底物溶液：1克CMCNa加热溶化于100ml pH值4.8，0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中。

0.lmol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓0.1mol/L柠檬酸: 含柠檬酸·H2O 21.01克/1000毫升。

0.1mol/L的柠檬酸三钠: 含柠檬酸三钠·2H2O 29.4克/1000毫升。

0.1mol/L的柠檬酸40ml与0.1mol/L的柠檬酸三钠60.6ml混合即可。

刚果红染液：2% 刚果红溶液。

NaCl脱色液：2%氯化钠溶液。

三、实验方法3.1 真菌菌株的分离取土样方法如前所述。

取1.0 g所采集的土样加入到装有9 ml无菌水的试管中，充分振荡混匀后，吸取上清液作一系列梯度稀释，10-1，10-2，10-3，将稀释液涂布在分离培养基（可选择查氏、马丁氏或PDA培养基的任两种，倒平板前加入100 μg/ml头孢菌素或链霉素等抗生素），于28℃下培养，待菌落成熟，形成孢子后（约需5-7 d）将单菌落上的少量孢子点种至纤维素酶产生菌筛选培养基（CMC平板）平板上( 用前加入适量抗生素来抑制细菌生长) , 28℃倒置恒温培养。

产纤维素酶菌株的分离、鉴定及其酶学性质研究

围内较稳定，反应的最适温度为４酶０℃ ，Ｏ ℃ 以下酶的热稳定性较好。ＫＣ “ 对Ｃａｅ有激活作用，３、ａＭＣｓ
Ｆｅ “
、
Ｎａ、Ｋ、 “ ｃａ
、
Ｍｇ对滤纸酶活（Ｐｓ）激活作用。 “ Ｆａｅ有
ｇｄｃｌｒｃｎｇｎｉｅｈｄ．Ｔｈｏｇｎａｙｉｔｙｉｌｇｃｌａｄｂｉｃｅｃｌｐｏｒｉｎｏｍｏｏｙｏ６ＳｏＲｅｏｏ — ｈａｉｇｒｎｇｍｔｏｒｕｈａｌｓｓｉｓｐｈｓｏｏｉａｎｏｈｍｉａｒｐｅｔａｄｈｅｓｌｇｆ１
ＩｓＥｎｚｍｏｏｙＰｒｐｒｉｓｔｙｌｇｏｅｔｅ
ＹＮｉ，ＷＥｈｏｊｎ，ＺＵＷｕｊｎ，ＥＭｉｇＡＧＬｕＩａ－Ｈ－ＹｎＺｕｕ
（．ＳｈｆＢｏｅｈ１ｃ．ｏｉｃ．＆Ｆｏｎｉ．，ｅｉＵｉｆｅｈｏ．Ｈｆｉ３０９．ＳｅｏｇＬｄａｚｕｎＳａｄｎ７１０）ｔｏｄＥｇｎＨｆｎｖｅ．ｏＴｃｎ１ｅ００；２ｈｎＬｎｔ．Ｚｏｈａｇ，ｈｎｏｇ２７０ｅ２
Ｋｅｙｗｏｒｃｌａｅ；ｉｏａｉｎ；ｉｎｉｉａｉｎ；１ＤＮＡ；ｅｚｍｏｏｙｃａａｔｒｓｉｓｄｓｅｌｓｕｌｓｌｔｏｄｅｔｆｃｔｏ６Ｓｒｎｙｌｇｈｒｃｅｉｔｃ
纤维素作为一种巨大潜力的可再生资源，依赖于人们对纤维素酶的发现和认识。纤维素酶（ｅｕａｅ是降解纤维素生成还原糖的一组酶的Ｃｌｌｓ）ｌ总称。目前在医药、日用化工、品发酵、水处食废理、中草药提取等领域都有一定程度的应用Ｈ。近年来，生物纤维素酶的研究十分活跃，人们微但

产纤维素酶真菌的分离、筛选及酶活测定

产纤维素酶真菌的分离、筛选及酶活测定摘要产酶纤维素微生物在纤维素资源的再生转化，提高牲畜饲料利用率，堆肥的使用以及环境污染等方面具有很高的应用价值。

而分离高效纤维素降解菌是这一内容的前提与基础。

本研究利用选择培养基CMC培养基，从学校周围的土壤中分离得到6株降解纤维素的真菌。

它们都具有较强的纤维素降解能力，尤其以编号为纸绿和江白活性最高。

随后对这6种菌株进行酶活测定，从中得到一株高酶活的菌株,其在CMC培养条件下酶活达到40 U。

关键词：纤维素降解菌；筛选；纤维素酶活；鉴定Separation, screening and enzymatic activity of cellulase producedby fungiAbstractMicrobial fermentation of cellulose micro-organisms, especially fungi in the conversion of cellulose into renewable resources and improve utilization of livestock feed, compost use and environmental pollution has a high application value. And efficient cellulose degradation bacteria can provide useful help in this regard. In this study, selective medium CMC medium, Shaoyang University straw isolated six soil fungi degrade cellulose. They have a strong ability of cellulose degradation, particularly in the number of paper green and White River the highest activity. And the 6 strains with a high activity were morphological, physiological and biochemical identification. Key Words: Cellulose degrading bacteria; Filter; Cellulase activity; Identification.目录摘要 (I)ABSTRACT (II)1前言 (1)1.1纤维素概述 (2)1.2纤维素酶 (2)1.3 纤维素分解菌类 (4)1.4本文研究的目的与意义 (6)2 实验部分 (7)2.1材料 (7)2.2主要试剂与仪器 (7)2.3培养基 (8)2.4菌种的分离与筛选 (9)2.5纤维素酶活性测定 (10)2.6形态特征观察 (12)2.7生理生化特性鉴定 (13)2.8菌种保藏 (14)3 结果与讨论 (14)3.1初筛选得到的各菌株的菌落形态特征描述 (14)3.2复筛获得的菌株图片 (14)3.3葡萄糖标准曲线的绘制 (16)3.4各菌的酶活力测定结果 (17)4 结论 (18)参考文献 (19)致谢 (20)1前言纤维素是自然界中存量最大的一类可再生资源。

一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及其酶学特性研究

第５１卷第５期２１０２年９月
中山大学学报（自然科学版）
ＡＣＴＡＳＥＮＴＩＣＩＡＲＵＭＮＡＴＵＲＡＬＩＵＭＵＮＩＶＥＲＳＴＡＴＩＩＳＳＵＮＹＡＴＳＥＮＩ
Ｖｏ．Ｎｏ５１５１．
Ｓｐ．２０１ｅ２
一
株产纤维素酶细菌的分离鉴定及其酶学特性研究
ｔ０ｏ，ｗｈｌｈｒｗｔｏ５ＣｉｅｔｅｇｏｈｐＨａｇｓｆｏ５．ｏ１．ｒｎｅｍ０ｔ１０．ＴｈｕｔｒｏｉｏｓａＨ．ｒｅｃｌｕｅｃｎｄｔｎｔｐ６０～９．ｉ０，３～４４Ｃｎ．０ｏａｄ１５％～３．％Ｎａｒｈｓｕｔｂｅｆｒｅｚｍｅｐｏｕｔｎ．Ｔｅｏｔｍａｅ５Ｃ１ａｅｔｅｍｏｔｓｉａｌｏｎｙｒｄｃｉｏｈｐｉｌｔｍｐｅａｕｅｆｒｒｔｒｏ
行了产纤维素酶研究，认为Ｂｕｉｓ．ｐｍｌ是一种抗分ｕ
ＰＲ引物由上海生工合成。Ｔａｇｎ细菌基『组总Ｃｉｅｎ大］
ＤＡ提取试剂盒购白天根生化科技（京）有限Ｎ北
公司。１２方法．
１２１样品预处理取采集到的土壤样品５ｇ于．．
纤维素是地球上光合作用产量最高的多糖，它是由葡萄糖以Ｂ一１４糖苷键连接而成的线状大分，子物质。据报道，纤维素全球年产量为１５× 卜．１万ｔ０。高效纤维素酶的研究开发是可再生性资

产纤维素酶菌种的分离筛选和酶学性质的研究

ｓｒｉｈｗｅｔａｔｅｏｔｌｇｏｔｍｅｉｍｆｒＢａＣｈｒｔｎｓｏｄｈｔｐｉｒｗｈａｈｍａｄｕｏ５ｗｓａｌｓｍｅｉｍ，ｔｅｏｔｌｇｏｈｔｍｐｒｔｒｄｕｈｐｉｒｗｔｅｅａｕｅｗｅｅ３ｍａｒ５℃ ，ｔｅｏｔｍｌＨａｕｈｐｉｖｌｅｗｅｅ７．ｒｐｒ５，ｃｌｅ一１ｌｓ— ｒｄｃｎｉｒ２ｈ．Ｅｎｙｔｈｒｃｅｓｉｓｏ５ｓｏｄａｈｐｉｌｔｍｐｒｔｅｗ０℃ ，ｔｅｏｔｌＨａｕａ７．ｕｏｅｐｏｕｉｇｔｍｅｗｅｅ７ｚｍａｉｃａａｔｒｔｆＢｈｗｅｔｔｔｅｏｔｍａｅｅｕｒａ５ｃｉｃｈａｓｈｐｉｍａｐｖｌｅｗｓ５．１ｅ．ｈｅｅ１
１ａｅｏ３ｈｗｄａｈｇｔｉｔａｐｏ７０—８０１ｏｃｓｏＴｅｇｏｔｄｅｚｍｔｈｒｔｉｔｓｆｌｅｒｌｉａｉｏｆｍｄｗｉｌｕｆ１ｓｏｅｉｓｂｌｙｔＨｆ．ｓ５ｈａｉ．．ＣｎｌｉＪｈｒｗｈａｎｙａｉｅａａｅｓｃｔｗｒｐｅｉｎｒｙｅｎｒｅ，ｈｃｕｎｎｃｅｒｉｏ５ｅｍｌｉｈ
摘要［目的］寻找产纤维素酶的高产菌。［方法］通过固体培养初筛和摇瓶发酵复筛获得产纤维素酶的菌株，过考察培养基、通生长温度、Ｈ值、ｐ产酶时间等主要的影响因子及酶学特性对产纤维素酶酶活较高的菌株进行了初步的研究。［果］结筛选得到了产纤维素酶活较高、稳定性较好的茵株Ｂ。通过对Ｂ茵的研究，５５发现其最适生长培养基为查氏培养基，最适生长温度为３ ℃ ，５最适生长ｐＨ值为７５．，产酶的最佳时间为７；２通过对其酶学特性的研究，ｈ发现该酶反应的最适温度为５０℃，酶反应的最适ｐ值为７５酶在ｐＨ．，Ｈ值为７０８０．～．范围内稳定性较高。［结论］初步确定了Ｂ菌的生长特性和酶学特性，下一步的研究提供了科学的依据。５为关键词纤维素酶；筛选；酶学性质中图分类号Ｓ８文献标识码Ａ１２文章编号ｏ１ — ６１２０）３０８ — ２５６１（０９１ — ５４０７６

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ｓｅｉｅｒｓｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｓｔｓａｎｄ１６ＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｃｏｎｄｕｃｔｅｄ．ＴｈｅＬ —ｌ３
ＳｔｒａｉｎＰｒｏｄｕｃｉｎｇＣｅｌｌｕｌａｓｅ
ＬｉｕＸｉａｏｈｕｉ，ＧａｏＸｉａｏｍｅｉ，ＨｕａｎＭｉｎｇｈｕｉ，ＤｅｎｇＣｈｕｎｈａｉ，ＬｉＹａｎｇ，ＡｏＪｉｎｇ，ＧｕｏＬｉｎｇｌｉｎｇ
（辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳１２２０００）
摘
要：为促进秸秆还田，加快秸秆在北方设施土壤中的降解速度，以腐烂秸秆为待筛菌株原料，以玉米
秸秆粉为培养ห้องสมุดไป่ตู้ ，在１５ ℃低温条件下，采用刚果红平板法进行初筛，得到１６株菌株，对１６株菌株进行酶活测
ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ１６７９．６１Ｕ／ｍ１．ＴｈｅｍｙｃｅｌｉａｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｃｏｌｏｎｙｃｈａｒａｃｔｅｉｓｒｔｉｃｓｏｆＬ一１３ｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄ，ａｎｄａ
定复筛，其中Ｌ一１３酶活最高，达１６７９．６１Ｕ／ｍｌ。对Ｌ一１３菌株的菌体形态、菌落特征进行观察，并进行了一
系列生理生化试验和１６ＳｒＤＮＡ序列分析，初步鉴定Ｌ一１３为枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）。此菌可以在１５％下快速生长繁殖并高产纤维素酶，低温条件下能快速降解秸秆。关键词：玉米秸秆；低温；纤维素酶
我国的玉米秸秆资源分布较广，是一种易得
（ＬｉａｏｎｉｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｏｙａｎｇ１２２０００，Ｃｈｉｎａ）
ＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｍｏｔｅｓｔｒａｗｒｅｔｕｒｎｉｎｇａｎｄｓｐｅｅｄｕｐｉｔｓｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＮｏｒｔｈｒｅｇｅｎｈｏｕｓｅｓｏｉｌ，ｕｓｉｎｇｒｏｔｔｅｎｓｔｒａｗａｓｒａｗｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｃｏｒｎｓｔｒａｗｐｏｗｄｅｒａｓｍｅｄｉｕｍ，１６ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｗｉｔｈＣｏｎｇｏＲｅｄｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄａｔｌ５℃ ．Ｔｈｅｎｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆ１６ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｌ一１３ｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｅｎｚｙｍｅ
中图分类号：Ｑ９３— ３３１文献标识号：Ａ文章编号：１００１ — ４９４２（２０１４）０３－００５４— ０４
ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｉｃｆａｔｉｏｎｏｆＬｏｗ — ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｓｔｒａｉｎｗａｓｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｏｗｉｎｇｔｏｇｒｏｗｉｎｇｆａｓｔｌｙａｎｄｈｉｇｈｙｉｅｌｄｉｎｇｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅａｔ１５￣Ｃ，ｉｔｃｏｕｌｄｄｅｒａｇｄｅｔｈｅｓｔｒａｗｕｎｄｅｒｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒａｐｉｄｌｙ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＣｏｒｎｓｔｒａｗ；Ｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ
山东农业科学２０１４，４６（３）：５４—５７
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ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
产纤维素酶低温菌株的分离鉴定
刘晓辉，高晓梅，桓明辉，邓春海，李杨，熬静，郭玲玲