高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究
第４４卷第ｌ期厦门大学学报（自然科学版）
Ｖ０１．４４Ｎｏ．１
２００５年１月Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
Ｘｉａｍｅｎ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ）Ｊａｎ．２００５
高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究
徐昶１，龙敏南¨，邬小兵１，徐惠娟１，陈重安２，张凤章１，许良树，
（１．厦门大学生命科学学院。微生物与海洋药物研究所．福建厦门３６１００５；
２．厦门市海沧污水处理厂，福建厦门３６１０２６）
摘要：从霉变的玉米芯中筛选到一株高产纤维索酶的菌株，经１８ＳｒＲＮＡ基因序列分析和菌株形态特性分析．确定该菌
株为灰绿曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｇｌａｕｃｕｓ）．利用圆体纤曲培养产生纤维素酶，研究了培养基起始ｐＨ值、培养温度、培养时间、接
种量、氮源、稻草粉与麸皮比例、表面活性剂等对菌株产酶的影响．在最适条件下菌株培养７２ｈ后。羧甲基纤维素酶（ＣＭ．
Ｃａｓｅ）活力高达６８１２Ｕ／ｇ（干曲．下同），滤纸酶活力（ＦＰＡ）达１７２
ｕ／ｇ．利用该菌株对蔗渣进行分解．其糖化率达３６。４％．
关键词：灰绿曲霉；纤维素酶活力ｌ糖化
中图分类号：Ｑ
９３５文献标识码：Ａ文章编号：０４３８—０４７９（２００５）０１—０１０７—０５
纤维素类物质是自然界中最丰富的一种可再生资
源．全球每年光合作用产生的植物生物量高达１．１４×
１０１２ｔ，我国的纤维类资源极为丰富，仅秸秆和皮壳每
年可达７×１０８ｔ．这些原料大部分被烧掉，既破坏了生
态平衡，又污染环境，且能量利用率低（１０％左右）［１］．
如将天然纤维素降解为可利用的糖液，再进一步转化
为酒精、菌体蛋白、气体燃料（如氢气）等物质，对解决
当今世界所面临的粮食短缺、能源危机和环境污染问
题具有深远的意义［２］．纤维素类物质的糖化有酸解法
和酶解法等．酶解法由于能耗低，反应条件温和以及不
使用有毒和腐蚀性的化学物质而倍受青睐［３］．然而至
今未能应用木质纤维素作为工业酶解发酵的原料，纤
维素酶活力不高而导致酶用量过大是限制其应用的主
要因素之一［‘］．因此，筛选酶活高的野生菌株，对纤维
类资源的利用具有重要意义．我们分离到一株具有高
酶活力的灰绿曲霉ＸＣ９，并对其产酶条件和酶解糖化
作用进行了研究．
１材料与方法
１．１培养基
Ｄｕｂｏｓ纤维素培养基，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ培养基‘日，纤维
素一刚果红培养基‘７・８３；种子培养基：ｌｏ％麸皮浸汁；基
础固体产酶培养基：碱处理稻草粉４ｇ，去淀粉麸皮
牧稿日期：２００３－１Ｚ－０４
基金项目：国家８６３计羽项目（２００１，＇诅５１５０４０）．中匈政府闽科技
合作项目（３５０２７．２００３１１０８）及厦门市科技项目
（３５０２２２００４１０７０）
作者简介：徐昶（１９７３一）－男・硕士研究生．
－Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｌｎｇａｕｔｈｏｒ１ｇ，无机盐培养液１５
ｍＬ（ＫＨ２ＰＯ，４ｇ／Ｌ，
（ＮＨ。）２ＳＯ‘１６ｇ／Ｌ，ＭｇＳ０４１
ｇ／Ｌ）．
１．２菌株的分离筛选
在厦门大学校园附近采集腐枝烂叶、霉变物以及
土样．腐枝烂叶和霉变物捣碎后置于生理盐水中振荡；
土样则配成悬液静置，后取上层水样接入Ｄｕｂｏｓ纤维
素培养基和Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ培养基中，连续富集培养３次，
每次培养至三角烧瓶中的滤纸崩溃为止．将富集后的
菌液在纤维素一剐果红培养基上划线培养（３０℃）至菌
落长出，挑有透明圈的菌落进行复筛，重复几次直至得
到纯菌落．
１．３菌株鉴定
形态鉴定【９］：在平板上挑菌体少许，涂于载玻片
上，置于显微镜下观察．
１８ＳｒＲＮＡ基因分析［１０］：取培养１２ｈ的菌丝体
４ｍＬ，离心去水相，加４００
ｐＬ１％十六烷基三甲基溴
化铵（ＣＴＡＢ），离心后弃上清液，加入细胞裂解液（４
ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍，０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５）４００
ｐＬ，
室温孵育３０ｒａｉｎ，用酚一氯仿（１：１）和氯仿各抽提一
次，离心取上清液，加２倍体积无水乙醇和１／１０体积
醋酸钠（３ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ５．２）沉淀ＤＮＡ，ＴＥ缓冲液溶解
沉淀后，用１８ＳｒＲＮＡ基因扩增通用引物（５’ＡＴＴＧ—
ＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧ３’，５’ＯＣＧＡＴＣ—
ＣＣＴＡＧＴＣＧＧＣＡＴＡＧ３’）进行ＰＣＲ扩增，扩增产物
经纯化后测序（Ｔａｋａｒａ公司）．
１．４粗纤维素酶液的制备
称取湿曲３．６ｇ（相当于１ｇ干曲），加蒸馏水２０
ｍＬ，搅拌均匀，于３０℃恒温水浴ｌｈ，用两层纱布挤
滤，滤液离心（４０００ｒ／ｍｉｎ，１０
ｒａｉｎ，４＂Ｃ），上清液即为
万方数据’１０８’
厦门大学学报（自然科学版）
２００５年
粗酶液．
１．５酶活力测定方法【１１￣１３］
１）棉花酶活力：取０．５ｍＬ稀释的粗酶液加入到
装有５０
ｍｇ脱脂棉、２ｍＬ醋酸缓冲液（ｐＨ４．８）的带
塞试管中，再加甲苯１滴，加塞后于５０℃水浴２４ｈ．以
每２４ｈ产生１．０ｍｇ还原糖定义为１个酶活力单位
（Ｕ）．
２）羧甲基纤维素酶（ＣＭＣａｓｅ）活力：取２ｍＬ羧甲
基纤维素溶液于试管中，加０．５ｍＬ稀释的粗酶液，混
匀后，于５０℃水浴３０ｍｉｎ．以每３０ｍｉｎ产生１．０ｍｇ
还原糖定义为１个酶活力单位（Ｕ）．
３）滤纸酶（ＦＰＡ）活力：取０．５ｍＬ稀释的粗酶液，
加２ｍＬ醋酸缓冲液和１条滤纸（新华１号，１×６ｃｍ）
于带塞试管中，５０℃水浴１ｈ．以每小时产生１．０
ｍｇ
还原糖定义为１个酶活力单位（Ｕ）．
以在１００℃水浴灭活５ｍｉｎ的粗酶液为对比液，
其余步骤相同．酶活力均指扣除对比液中还原糖后计
算得到的结果．
１．６还原糖测定和全纤维含量测定
分别按文献１－１０］和文献［５］进行．
２结果与分析
２．１筛选结果
本实验中共筛选出４１株能够分解纤维素的菌株，
取其中酶活力较高的４株菌株（编号分别为ＸＣ２，
ＸＣ９，ＸＣｌ５，ＸＣ２３）做进一步分析，以购于中科院微生
物菌种保藏中心的菌株木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ．ｓｐ），康氏
木霉（Ｚ
ｋｏｎｉｎｇｉｉ）作对照．将上述菌株分别接种在刚
果红一纤维素平板上，计算透明圈直径与菌落直径比值
（ＨＣ比值），在基础固体产酶培养基上发酵，然后测纤
维素酶活力，重复３次取平均值，结果见表１．
菌株ＸＣ９由霉变玉米棒上分离得到的，由表１可
表ｉ不同菌株酶活力比较
Ｔａｂ．１
ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃｅＵｕｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｖａｒｉｏｕｓｓｔｒａｉｎｓ
注ｔＵ／ｓ中的质量指千曲见，其ＣＭＣ酶活力、棉花酶活力和滤纸酶活力均高于
其它菌株，故ＸＣ９菌株是纤维素酶活力较高的一个菌
株．
２．２鉴定结果
菌落在ＰＤＡ平板上先以白色絮状扩散，后变为
黄绿色，最终呈铜绿色以点状分散．菌丝具隔膜，含红
色颗粒；分生孢子穗绿色，呈辐射状，分生孢子椭圆形，
表面粗糙；子囊壳球形，黄色；子囊孢子双凸透镜形，赤
道有纹线．该形态特征与灰绿曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｇｌａｕ－
ＣＵ￥）相似．
１８ＳｒＲＮＡ基因片断序列分析结果表明：菌株
ＸＣ９的１８ＳｒＲＮＡ基因序列与灰绿曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｇｌａｕｃｕｓ）１８ＳｒＲＮＡ基因序列同源性高达１００％．
根据以上观察和鉴定结果，初步确定该菌株为灰
绿曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｇｌａｕｃｕｓ）．
２．３灰绿曲霉ＸＣ９产酶条件
１）培养时间与酶活力的关系
将１ｍＬ菌丝体片断悬浮液接种于固体发酵培养
基，３０℃培养，每隔２４ｈ测ＣＭＣａｓｅ和ＦＰＡ酶活力．
结果（图１）表明，在起初的４８ｈ，酶活力增加幅度较
大；当培养到第７２小时，ＣＭＣａｓｅ和ＦＰＡ活力均达到
最大，ＣＭＣａｓｅ达６６１３．１２Ｕ／ｇ干曲，ＦＰＡ活力达
１７１．１２Ｕ／ｇ干曲，４ｄ后酶活力开始下降，第５天的
ＣＭＣａｓｅ和ＦＰＡ活力只有高峰期的５０％左右．因此，
培养时间以３～４ｄ为宜．
２）接种量对酶产量的影响
接种量对酶活力有很大影响．取培养１５ｈ种子培
养液的菌丝体碎片悬浮液０．１５
ｍＬ、０．３ｍＬ、０．６ｍＬ、
０．７５
ｍＬ、０．９ｍＬ、１．２ｍＬ、１．５ｍＬ于固体发酵培养
基中（其接种量体积分数分别为１％、２％、４％、５％、
６％、８％、１０％），培养８４ｈ后测酶活力，结果见图２．
图２表明，接种量为６％时酶活力最高，培养基能
为菌体提供比较充足的营养．接种量过低，营养过剩，
１７５
１５０
１２５
ｌ∞
７５
５０
２５
ｔ／ｄ
图ｌ培养时同对酶活力的影响
Ｆｉｇ．１Ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｔｉｍｅ
０１１ｃｅｌｌｕｌａａｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ甚，鼍ｇ臣
咖咖撇蝴啪咖｜咖。目７
６
５
４
３
２
ｌ≥葛≯翟譬
万方数据第１期
徐昶等：高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究．１０９．
０１２
３４
５６７８９１０
Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
ｑｕａｎｔｉｔｙ／％
图２接种量对酶产量的影响
Ｆｉｇ．２Ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｃｅｌｌｕｌａｓｃ
ａｃ—
ｔｉｖｉｔｙ
菌丝体徒长，产酶滞后；接种量过大，则菌丝体增长迅
速，后期营养不良，且曲温升高，不利于产酶．因此最适
接种量为６％．
３）不同底料与麸皮比对酶活力的影响
本研究以稻草粉为底料．将稻草粉与麸皮以不同
比例混合，按６０Ａ接种量在固体发酵培养基３０＂Ｃ培养
８４ｈ，结果见图３．
图３表明，当稻草粉／麸皮比为４：６时酶活力最
高，ＣＭＣ酶活力比不加麸皮时提高３．６倍，麸皮的量
对ＦＰＡ酶活力影响则更加显著．可见，麸皮对菌种酶
活力的影响是双方面的：一方面为产酶提供必要的营
养因子；另一方面’，其含量增加又会降低培养基的蓬松
程度，使通气量降低，从而影响酶活力．
４）不同氮源对酶活力的影响
采用尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、硝酸铵、蛋白
胨、酵母粉作为氮源（总氮量为０．４％），研究其对酶活
力的影响．以６％接种量３０℃培养８４ｈ，稻草粉／麸皮
比为１：１，实验结果如图４．可知，氮源对酶活力的影
响因素依次为：有机氮＞硝酸盐＞铵盐，采用蛋白胨作
为氮源时效果最好．
５）培养温度对酶活力的影响
将６％菌丝体碎片悬浮液接入固体发酵培养基，
分别于不同温度下培养，每隔２４ｈ测定ＣＭＣ酶活力，
图４不同氮源对酶活力的影响
Ｆｉｇ．４Ｅｆｆｅｃｔｏｆ
ｎｉｔｒｏｇｅｎ８０Ｕｌ佗ｅＯｎｃｅｌｈｌａ．ｅａｃｔｉｖｉｔｙ暑
｛
譬
爱
ｓｔｒａｗ
ｐｏｗｄｅｒ／ｗｈｅａｔｂｒａｎ（ｗ／ｗ）
图３底料与麸皮的比例对酶活力的影响
Ｆｉｇ．３Ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｓｔｒａｗ
ｐｏｗｄｅｒａｎｄｗｈｅａｔｂｒａｎ
ｏｎ
ｃｅｌｌｕｌａｓｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ
总时间为４ｄ．结果表明：灰绿曲霉ＸＣ９在较低温度
（２５℃）下培养，菌体生长缓慢，孢子数量少，呈浅绿色，
酶活力高峰期出现晚．在温度较高（３５℃）时培养，菌体
生长旺盛，孢子多，呈绿色，酶活高峰期出现早，但酶量
偏低．该菌株产酶比较适宜的温度为３０℃．
６）培养基起始ｐＨ值对酶活力的影响
将６％接种量接人起始ｐＨ值不同的固体发酵培
养基，３０℃培养３ｄ，分别测其酶活力．结果表明，灰绿
曲霉ＸＣ９产ＣＭＣａｓｅ最适起始ｐＨ值为５．５，ＦＰＡ最
适起始ｐＨ值为６．０．
７）表面活性荆对酶活力的影响
在固体发酵培养基中加入０．１％～０．８％吐温８０
（ＴＷ－８０）和立白洗衣粉（广东立白集团有限公司产
品），以不加的为对照，培养３ｄ（接种量６％，３０℃），研
究两种表面活性剂对灰绿曲霉ＸＣ９产纤维素酶的影
响．结果表明：加入０．２％～Ｏ．４％的ＴＷ一８０和０．１％
～ｏ．２％的洗衣粉能较大地促进菌体产酶，说明一定浓
度的表面活性剂能提高细胞质膜的通透性。有利于胞
内酶的不断排出．但浓度过高则菌体酶活力降低，可能
菌体受到伤害，使产酶下降，这与文献Ｅ１４３报道的不
一株高产低温纤维素酶南极细菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究
亿亏与生物互程２０１２，ＶｏＩ．２９ Ｎ。．２ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—５４２５．２０１２．０２．００９
一株高产低温纤维素酶南极细菌的筛选、鉴定
及酶学性质初步研究
高 丛 。缪锦来 ，郑洲 。金青
（１．青岛科技大学化工学院，山东青岛２６６０４２；２．国家海洋局第一海洋研究所，山东青岛２６６０６１）
摘 要：从８２株南极细菌中筛选出１株高产低温纤维素酶菌株ＮＪ６４，通过１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析对其进行鉴定，并对 其产酶条件及酶学性质进行了初步研究。结果表明，ＮＪ６４菌株为假交替单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）；最适产酶条 件为：培养时间７２ ｈ、初始ｐＨ值７．５、培养温度１Ｏ℃；所产纤维素酶在ｐＨ值９．０左右、４Ｏ℃条件下的酶活性最高，属于 低温酶。 关键词：南极；细菌；低温纤维素酶 中图分类号：ＴＱ ９２０ Ｑ ９３６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２—５４２５（２０１２）０２—００３７—０３
纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，是一种
能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系，通常将其 分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及 葡萄糖苷酶，可 广泛用于中药成分提取、食品、纺织、饲料、酿酒、石油
勘探等诸多领域，尤其在生物能源工业中具有重要地 位。利用纤维素酶将废弃纤维类物质糖化，用于制备
生物乙醇，缓解能源紧张，是解决未来资源问题的一条 重要途径。 目前，人们对常温和高温纤维素酶的研究较多，关 于低温纤维素酶的研究相对较少。低温酶既可以实现 在低温条件下进行高效酶解反应，同时也可以通过较
低温度的热处理使酶失活，从而节约能量，降低生产成
本。因此，对低温纤维素酶产生菌的筛选及酶学性质 研究已成为热点。
我国关于南极低温纤维素酶的研究才刚刚开始。 在南极地区，科研人员已在冰雪、土壤及岩石样品中发 现了数量众多的微生物，并证明微生物在南极自然环 境下可以产生大量活性物质（如低温酶、抗生素、多糖
组成型纤维素酶高产菌的筛选及产酶条件优化
第２７卷第４期 ２００８年７月 食品与生物技术学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉ０ｔｅｃｈｎ０ｌ０ｇｙ Ｖｏ１．２７ Ｎｏ．４ Ｊｕ１． ２００８
文章编号：１６７３—１６８９（２００８）０４—００８５—０６
组成型纤维素酶高产菌的筛选及产酶条件优化
许婧， 欧阳嘉， 何冰芳
（南京工业大学制药与生命科学学院，江苏南京２１０００９）
摘 要：从富含植物纤维素的土样中筛选得到一株组成型纤维素酶产生茵ＬＣ－９，结合Ｂｉｏｌｏｇ微生
物自动鉴定仪和１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析，该菌株鉴定为Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ。通过发酵与产酶条件优
化，确定了菌株最佳培养条件。在优化条件下发酵３５ ｈ后，内切纤维素酶活力可达１ ３０１．４
Ｕ／ｍＬ，木聚糖酶活力可达２８９．２ Ｕ／ｍＬ。该菌株产酶发酵周期短，无需纤维素类物质的诱导，推
测为一株新型组成型多功能纤维素酶高产菌株。
关键词：内切纤维素酶；木聚糖酶；组成型高产菌；筛选；发酵条件优化
中图分类号：Ｑ ９２０．１ 文献标识码：Ａ
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ－Ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ
Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＸＵ Ｊｉｎｇ， ＯＵＹＡＮＧ Ｊｉａ，ＨＥ Ｂｉｎｇ—ｆａｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ ＬＣ－９ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｗａｓ ｎｅｗｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｏｉｌ．Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ
产纤维素酶霉菌的筛选.doc5
产纤维素酶霉菌的分离和筛选
班级:09生物技术
指导老师：黄志华
组别: 第五小组
组员：吴志娟、戴剑鹤、柯佳宝、潘凯仑、王志辉
（24-29号）
组长：吴志娟
一．实验目的
1.进一步复习生物化学、微生物学等相关专业知识。
2.掌握产纤维素酶细菌的筛选、纯化和保藏的方法。
3.学会设计实验计划。
4．综合培养动手操作能力及创新精神。
二. 实验原理
纤维素（cellulose）作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源, 探索纤维素资源的有效利用方法具有重要的意义。纤维素酶的来源很广泛，自然界中能产生纤维素酶的物种非常多。在过去的半个世纪内，人们在各种原生动物、圆虫类、软体动物、甲壳类、昆虫、藻类、真菌类、细菌及放线菌中都发现了纤维素酶，近年来陆续在古菌中也发现很多纤维素酶的存在，但微生物是纤维素酶的主要来源，其中主要有真菌（霉菌）、细菌和放线菌。
菌种采集:产纤维素酶霉菌的采集选择在纤维素含量较高的地方，如花园表层土壤、腐烂的木头、造纸厂废水及反刍动物的瘤胃及其排泄物等。本次实验拟从森林土中获得产酶菌株。采样的土层太深则厌氧菌占优，而浅层土受紫外线照射，细菌难以存活。故实验选取距表层土壤8cm处的土壤进行筛选。
纤维素刚果红培养基筛选菌种的原理：通过刚果红鉴定板来鉴定产纤维素酶霉菌是一种快速简便的筛选方法,透明圈直径和鉴定板孔径大小的比值能够直接反映该霉菌产纤维素酶的能力,其原理是刚果红是一种能够和大分子多糖相结合的染色剂,染色之后能和纤维素结合形成红色,产纤维素酶霉菌在培养基平板上培养后产的生纤维素酶将纤维素水解成葡萄糖和纤维二糖等小分子糖,在用刚果红染色之后没有被水解的纤维素能够和刚果红结合显红色,而水解的部位则不能和刚果红结合而出现透明圈。
三．实验器材与试剂
1.样品：后山植物林地土壤，于地下8cm左右。
一株木霉菌(Trichoderma sp.)TY2纤维素酶最佳产酶条件及部分酶学特性研究
新疆农业科学２０１０，４７（７）：１３２４—１３３１ Ｘｉ￣ｉａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
一株木霉菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）ＴＹ２纤维素酶
最佳产酶条件及部分酶学特性研究
冯蕾 ，２一，严琴 ，一，徐晓立 ，一，罗思施 ，杨新平 ，
秦新政 ，陈竞 ，唐娴。，谢君
（１．华南农业大学应用生物化学研究所，广州 ５１０６４２；２．广东省高校生物质能源重点实验室，广州 ５１０６４２ ３．新疆农业科学院微生物所．乌鲁木齐８３ｏｏ０ｏ）
摘 要：【目的】筛选高活力纤维素酶产生菌，高效利用纤维素资源。【方法】从朽木和和纸浆样品中分离筛选 出一株产纤维素酶活较高的菌株ＴＹ２。对其形态和１８Ｓ ｒＤＮＡ特征序列分析鉴定为木霉菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）。 对菌株发酵条件及酶学特性进行研究。【结果】ＴＹ２菌株的最佳产酶条件为：１％滤纸＋２％麸皮＋０．５％葡萄 糖为碳源，０．５％蛋白胨为氮源，起始ｐＨ ５．０，温度２８℃，２００ ｒ／ｒａｉｎ，５ ｄ，其ＣＭＣａｓｅ和ＦＰａｓｅ活力分别达４１２．５ 和１００．３ Ｕ／ｍＬ。经分离纯化出ＴＹ２菌株内切ｐ一葡聚糖苷酶。内切８一葡聚糖苷酶最适反应温度为６Ｏ℃，最 适反应ＤＨ为４．６，在５０℃以下，ｐＨ ３．０ ５．０，酶活性稳定，且在８Ｏ℃仍具有降解ＣＭＣ—Ｎａ的效果。同时研究 发现铜离子、锌离子、钾离子和钠离子对内切８一葡聚糖苷酶的酶活有促进作用，而汞离子有明显的抑制作 用。【结论】所筛选的ＴＹ２菌株具有潜在的工业应用价值。 关键词：纤维素酶；木霉；发酵条件；内切Ｇ一葡聚糖苷酶；酶学特性 中图分类号：Ｓ１８８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１—１０４３３０（２０１０）０７—１３２４—０８
Ｏｐｔｉｍａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｎｅ
Ｓｔｒａｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ Ｓｐ．Ｔｙ２
纤维素酶产生菌的鉴定及其混合发酵条件优化
纤维素酶产生菌的鉴定及其混合发酵条件优化
摘要:分离筛选到的4株纤维素酶活较高的菌株D6､D7､B7和D1,根据形态特征初步判断为3株细菌､1株放线菌,其16S rDNA序列同源性分析结果发现D6､D7､B7与Bacillus sp.的同源性为99%,系统发育树分析与Bacillus sp.遗传关系最近,D1与Streptomyces zaomyceticus的同源性为99%,系统发育树分析与Streptomyces
zaomyceticus遗传关系最近;对4株菌株进行单独与混合发酵培养,结果表明菌株组合D6/D7混合培养后的酶活显著高于其单菌培养,其在培养温度37℃､培养基初始pH值为8.0､接种量为2%(V/V)､D6/D7接种比例为2∶1(V∶V)下的酶活最高,可达到79.42 U/mL｡
关键词:纤维素;筛选;混合培养;发酵条件
Study on Identification of Cellulose-Decomposing Microorganisms and Optimum
Conditions for Their Mixed Cultivation
Abstract: Four strains of microbes with relatively high cellulase activity named as
D6, D7, B7 and D1 were selected; and primarily identified as 3 bacteria and one
actinomyces. Based on the results of 16S rDNA sequencing, the homology among
strains D6, D7, B7 and Bacillus sp. were 99%; and between D1 and Streptomyces
从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤
从土壤中分离产几丁质酶的真菌
作者： 王春 学号:11101680
摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株.
1 材料与方法
1.1 培养基
1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.(2)纯几丁质培养基:胶体
几丁质5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂
1.2 菌株的分离
1.2.1 菌株初步分离 从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h.
高产纤维素酶菌株的诱变选育和筛选
第２５卷第６期 ２００６年１１月 食品与生物技术学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＶｏＬ ２５ Ｎｏ．６ ＮＯＶ． ２００６
文章编号：１６７３—１６８９（２００６）０６—０１０７—０４
高产纤维素酶菌株的诱变选育和筛选
李西波 ， 刘胜
（１．江苏大学生命科学研究院，江苏镇江 仰韶生化工程有限公司，河南渑池４７２４０ 利。， 王耀民 ’ 王文兵¨
２１２０１３；２．河南科技大学，河南洛阳４７１００３；３．河南
０）
摘要：用青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）ＨＫ一００３为原始茵，经亚硝基胍（ＮＴＧ）、羟胺复合谤变，根据变 异茵株茵落形态变化与产酶高低的关系。结合酶活力检测理化指标，筛选出一株高产稳定的纤维
素酶茵株ＬＸ－４３５，其产酶能力由２００ Ｕ／ｍＬ提高到４１５ Ｕ／ｍＬ，较出发茵株提高２．Ｏ８倍。对该茵
种进行了连续８次继代培养，结果表明其遗传性状稳定。
关键词：青霉；亚硝基胍；羟胺；复合诱变 中图分类号：ＴＱ ９２０ 文献标识码１ Ａ
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｍｕｔａｎｔ Ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ
ＬＩ ｘｉ—ｂｏ ，ＬＩＵ Ｓｈｅｎｇ－ｌｉ。， ＷＡＮＧ Ｙａｏ－ｍｉｎ ， ＷＡＮＧ Ｗｅｎ－ｂｉｎｇ¨
（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊｉａｎｇｓｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ ２１２０１３ ＣｈｉｎａＩ ２．Ｈｅｎａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ・Ｌｕｏｙａｎｇ ４７１００３ Ｃｈｉｎａｉ ３．Ｈｅｎａｎ ＹａｎｇＳｈａｏ Ｂｉｏ－ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＣＯ．，Ｌｔｄ・Ｍｉａｎｃｈｉ ４７２．４００ Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｈｉｇｈｅｒ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ＳＰ ＬＸ４３５ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ
产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定
产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定
吴自祥;张天亮;杨润霞;贾晓蕊;万学瑞;马亚茹;王艳;吴润;王川;魏姣;刘磊;张小丽
【摘 要】通过筛选获得高产纤维素酶细菌菌株,为纤维素酶制剂研制及纤维素酶工程菌构建提供试验材料.采用刚果红平板从牛羊粪便及腐败的玉米秸秆和木屑中分离产纤维素酶菌株,以DNS法测定酶活,根据酶活复筛产纤维素酶分离菌株;观察分离菌株的形态、染色与培养特性;应用16S rDNA通用引物扩增菌株基因组DNA,测序结果提交GenBank数据库进行Blast比对分析和相似性搜索,作出复筛菌株种的鉴定.结果表明:分离获得16株纤维素酶产量较高的细菌菌株,均为革兰氏阳性菌,菌体呈短杆状、具中央芽孢,经16S rDNA序列比对分析和相似性搜索,鉴定为10株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、6株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus
amyloliquefaciens).%In order to provide bacteria for development of
cellulase preparations and cellulase engineering,the high-yield cellulase
bacteria strains were screened.Separate cellulase producing strains isolated
from cow or sheep dung and putrid maize straws or wood chips with
Congo red plate to screen cellulase producing strains through the
determination of enzyme activity with DNS assay,and observe its
shape,dyeing and cultural characteristics.16S rDNA universal primers were
高效产纤维素酶菌株ZJW-6发酵条件优化
高效产纤维素酶菌株ZJW-6发酵条件优化
摘要:在筛选出纤维素酶高产菌株的基础上,对纤维素酶高产菌株ZJW-6采用单因素试验进行不同条件下的液体发酵培养,使用DNS法对发酵后的菌悬液进行酶活力测定从而获得其最优发酵条件｡结果表明,菌株ZJW-6产纤维素酶的最优发酵条件是以蛋白胨+(NH4)2SO4为氮源培养基,在30 ℃､pH 6下振荡培养48 h｡
关键词:纤维素分解菌;发酵条件;纤维素酶;酶活力
Research on the Optimum Fermentation Conditions of High-Yield Cellulolytic
Enzymes Strain ZJW-6
Abstract: The optimum fermentation conditions of high-yield cellulolytic
enzymes strain ZJW-6 were studied in this paper. The strain was cultured under
different liquid fermentation conditions and enzymes activity of bacteria suspension
was determined using DNS method. The results showed that the optimum
fermentation conditions of ZJW-6 was as follows: peptone and (NH4)2SO4 as
nitrogen source, shaking for 48h at 30℃ and pH 6.
Key words: cellulose-decomposing microorganisms; fermentation conditions;
cellulose; enzyme activity
产纤维素酶芽孢杆菌筛选及发酵条件的初步研究
动物科学 现代农业科技￣２００６年１１月
产纤维素酶芽孢杆菌筛选及发酵条件的初步研究
祝小王振华潘康成吴敏峰
（Ｌ￣ＪＩＩ农业大学动科院，动物疫病与人类健康Ｎ］ＩＩ省重点实验室，四川雅安６２５０１４）
摘要通过刚果红染色法和ＤＮＳ分光光度法对１０种芽孢杆菌分泌胞外纤维素酶进行筛选，得到１株芽孢杆菌（菌株编号为Ｐａｂ０２） 酶活这１７０．９４８ｕ／ｍＬ。并进一步对其发酵培养基的初始ｐＨ值、发酵温度及时间进行优化，结果显示该菌株在ｐＨ值为８．０、温度３７￣（２、时间 ４８ｈ条件下酶活达到３５８．７５１Ｕ／ｍＬ酶液，比优化前提高了２，１倍。 关键词 纤维素酶；芽孢杆菌；发酵
近年来，在纤维素酶菌株的选育上取得了很大的进步，
由过去以霉菌为生产菌转到以细菌为生产主体．芽孢杆菌
倍受欢迎，这不仅由于芽孢杆菌的适应性强，生长ｐＨ值、温
度范围广，能分解多种底物，产酶活性高等；而且从饲料添
加剂角度考虑，有些芽孢杆菌本身可作为益生菌．其通过调
节肠道正常菌群平衡、产生营养物质、调节机体免疫功能、
产生多种酶系等促进动物生长，提高生产性能。本试验主要
对目前饲料领域应用的部分芽孢杆菌进行产酶筛选，并对
其发酵条件进行初步优化，为进一步证明芽孢杆菌对动物
的作用机理及菌种选择提供依据。
１材料和方法
１．１选育菌种
枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）６株：菌种编号分别为：
ＰＫＣ０１、ＰＪＫ０１、Ｐａｂ０１、Ｐａｂ０２、Ｐａｂ０３、Ｐａｂ０４。 地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）１株：菌种编号为
ＰＳＡ０６。 蜡样芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃｅｒｅｕｓ）２株：菌种编号分别为：
ＰＳＡ３８、ＰＤＭ４２３。 凝结芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃｏａｇｕｌａｎｓ）１株：菌种编号为：
ＰＳＡＦ１。 所有菌种均由四川农业大学生物医学工程实验室保
存。
１．２培养基
ＣＭＣ—Ｎａ培养基（％）：ＣＭＣ—Ｎａ １、蛋白胨０．５、酵母膏