酶的提取
酶的分离提纯实验原理
酶的分离提纯实验原理酶的分离提纯是指从复杂的混合物中获得纯净的酶样品的过程。
此过程旨在去除其他杂质，并提高酶的比活性和纯度。
酶的分离提纯实验原理可以分为以下几个方面：1. 根据酶的生理特性进行分离：酶的分离可依据酶对pH值、温度、离子浓度、底物特异性等因素的敏感性进行。
常用分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、电泳等。
2. 分离的物理性质利用：酶可根据其分子大小、电荷、溶解度等物理性质进行分离。
例如，凝胶过滤层析通过选用合适的孔径筛选凝胶，使大分子酶无法进入凝胶孔隙，进而实现分离。
3. 分离的化学性质利用：酶可通过与其他物质的特异性相互作用来实现分离。
亲和层析是一种常用的方法，利用酶与某些配体（如某种金属离子、亲合剂等）的特异性结合来分离酶。
在实验中，通常采用以下步骤进行酶的分离提纯：1. 细胞破碎：从生物体中获得酶源，如细胞、组织、分泌物等。
通常使用超声波破碎、搅拌破碎、离心等方法破碎细胞，并保持样品低温以防止酶的失活。
2. 酶提取：将破碎的细胞溶液用适当的缓冲液进行提取，并添加必要的辅助物质（如阻聚剂、金属离子等）以保持酶的稳定和活性。
3. 初步分离：通常先进行粗提，包括沉淀、超滤、离心、酒精沉淀等方法，目的是将酶与其他细胞组分分离开来。
4. 层析：根据酶的物理性质或化学性质选择适当的层析方法。
离子交换层析是常用的方法之一，根据酶与离子交换基质之间的相互作用进行分离。
5. 亲和层析：利用酶与特定配体之间的结合进行分离。
例如，选择性地将酶与亲和基质（如亲和剂或金属离子）结合，然后利用特定条件（如改变pH值或添加竞争性配体）来解离酶。
6. 离心和浓缩：通过离心和浓缩等操作，将目标酶进一步分离和提纯。
7. 再结晶：通过结晶或沉淀等方法进行酶的最终纯化。
8. 活性测定和纯度检验：测定酶的比活性，评估酶的纯度和活性。
总之，酶的分离提纯实验原理基于酶对物理、化学条件的敏感性，通过适当的分离方法和步骤，去除杂质，提高酶的纯度和比活性。
酶提取实验报告
一、实验目的1. 了解酶提取的基本原理和方法。
2. 掌握酶提取过程中的操作技巧。
3. 学习酶活性检测的方法。
二、实验原理酶是一种生物催化剂，具有高度的专一性和活性。
酶提取实验的目的是从生物材料中提取酶，并对其进行纯化和活性检测。
酶提取的基本原理是利用生物材料中的酶具有特异性的结合位点，通过合适的溶剂、温度、pH等条件，使酶从生物材料中释放出来。
三、实验材料1. 生物材料：新鲜菠菜、酵母粉、淀粉酶等。
2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、SDS、DTT、EDTA、蛋白酶抑制剂等。
3. 仪器：高速冷冻离心机、低温冰箱、水浴锅、电子天平等。
四、实验步骤1. 酶提取（1）取适量新鲜菠菜，用剪刀剪碎，加入适量Tris-HCl缓冲液（pH 7.0），搅拌均匀。
（2）将混合物放入高速冷冻离心机，以4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液。
（3）加入适量SDS、DTT、EDTA和蛋白酶抑制剂，混匀。
（4）将混合物置于低温冰箱中保存。
2. 酶活性检测（1）取适量酶提取液，加入适量底物，混匀。
（2）将混合物置于水浴锅中，在特定温度下反应一定时间。
（3）终止反应，加入适量显色剂，混匀。
（4）在特定波长下测定吸光度值，计算酶活性。
五、实验结果与分析1. 酶提取结果通过离心分离，成功提取了菠菜中的酶。
酶提取液在低温冰箱中保存，待后续实验使用。
2. 酶活性检测结果通过酶活性检测，得到了酶提取液的活性值。
根据实验数据，计算出酶的活性单位。
六、实验讨论1. 酶提取过程中，选择合适的溶剂、温度、pH等条件对酶的提取效果至关重要。
在本实验中，我们选择了Tris-HCl缓冲液作为溶剂，pH 7.0为酶提取的最佳pH 值。
2. 酶提取过程中，添加SDS、DTT、EDTA和蛋白酶抑制剂等试剂，可以保护酶的活性，防止酶在提取过程中被破坏。
3. 酶活性检测是评价酶提取效果的重要指标。
在本实验中，我们通过测定酶活性单位，对酶提取效果进行了评价。
酶的提取及纯化
1，盐析
■ 盐对蛋白质溶解度的影响：
● 盐溶 Salting-in:
加盐使蛋白质溶入水溶液中
● 盐析 Salting-out:
加盐使蛋白质由水溶液中沉淀出來
■ 提高盐浓度会增加蛋白质的溶解度：
溶
pI [NaCl]
解
0.005M
度
0.02M
pH > 5.2
2
0.01M
1
0.001M
pH = 5.2
3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的(NH4)2SO4保存可 达数年之久。
4) 价格便宜。
盐析剂用量的确定
盐浓度的表示法
盐析法中的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱 和的溶液成为100%饱和度。
影响盐析的因素
蛋白质浓度 离子强度和类型 pH 温度
1、动植物酶、微生物胞内酶的酶液制备流程
收集细胞 细胞破碎 固液分离 酶液浓缩
酶液
一、酶液的制备
2、微生物胞外酶的酶液制备流程
发酵液预处理 固液分离 酶液浓缩 酶液
3、细胞破壁的方法：
● 干式： 液态氮研磨, 磨粉机, 球磨机 (ball mill)
● 湿式： 均质机, 果汁机 (Waring blender), Polytron, 研砵,
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
(NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4
0℃ 70.6 4.9 1.6
20℃ 75.4 18.9 7.8
80℃ 95.3 43.3 93.8
100 ℃ 103 42.2 101
2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一 步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
酶的提取方法
酶的提取方法
酶的提取方法有多种，以下是一些常用的方法：
1. 机械法：如绞碎、刨碎、匀浆、研磨、挤压或超声波等。
研磨时还可加入细砂、石英粉、氧化铝等以利细胞破碎。
2. 化学法：用盐、碱、表面活性剂、EDTA、丙酮和正丁醇等可使细胞破碎、颗粒体结构解体，从而把酶释放出来。
例如常将胰脏用数倍量丙酮处理2～
3次，制成丙酮粉供多种酶的提取用；用胆酸盐处理膜结构上的脂蛋白和“结酶”，使两者形成复合物，并带上静电荷，由于电荷之间的排斥作用，使膜破裂，达到溶解。
3. 酶解法：用组织自溶或用溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、磷脂酶等降解细胞膜结构，然后再进行提取。
但应知道组织自溶法对某些酶的提取是不利的，如胰蛋白是以酶原形式纯化后再激活成胰蛋白酶的，若用自溶法提取，酶原已转成酶，纯化就很困难。
4. 冻融法：采用反复冷冻与融化时由于细胞中形成了冰晶及剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂。
5. 过滤：可加硅藻土、纸浆等为助滤剂。
6. 搅拌：加速提取，但转速不宜太快，否则会产生泡沫而难以过滤或使酶变性。
7. 提取溶剂：可以用水、一定浓度的乙醇、乙二醇、丁醇和稀盐溶液、缓冲溶液等；也可以用稀碱或稀酸溶液，如用稀硫酸提取胰蛋白酶，用稀盐酸提取胃蛋白酶。
请注意，这些方法可能对不同的酶类效果不同，因此在实际操作中应根据实际情况选择合适的方法。
酶的主要提取方法及其优缺点
酶的主要提取方法及其优缺点生物工程09-1班杨桠楠0901*******1、有机溶剂沉淀是利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的。
优点：1）分辨率比盐析法高2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
2）对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。
沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。
2、等电点沉淀是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的优点：1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化缺点：1）酸化时，容易引起蛋白质失活3、有机聚合物沉淀法(复合沉淀法)是在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的。
优点：1）操作条件温和，不易引起生物大分子变性。
2）沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。
3）沉淀后有机聚合物容易去除。
4、盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离常用的盐析剂: 硫酸铵优点：1）盐析能力强。
2）在水中溶解度最大（25℃时为4.1mol/L）。
而温度系数最小（对温度不敏感）。
3）价格便宜。
浓度高时也不会引起蛋白质和酶生物活性的丧失，抽提效果好。
缺点：1）缓冲能力差2）NH4＋的存在干扰蛋白质的测定3）得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。
5、双水相萃取技术是用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。
由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。
酶的提取与分离纯化课件
18
提取目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。
注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（0~10℃）操作。
19
提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
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提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
酶的提取与分离纯化
知识回顾
酶蛋白制备
构分
发
分
建离
酵
离
表选
生
纯
达育
产
化
产酶菌株
发酵液
酶制品
2
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞 破碎（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation） （提取）：除 去与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation） （精制）：除去 与产物性质相似的杂质。
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
9
细菌细胞壁的结构
10
酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
6
(二）发酵液的固液分离
1 . 影响发酵液过滤的因素 1）菌种 2）培养基组成 2. 提高过滤性能的方法
1）絮凝和凝聚 2）稀释、加热 3）加助滤剂，常用硅藻土等。
7
二、细胞破碎（胞内酶）
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
酶工程 第四章酶的分离纯化 第二节酶的提取
第二节 酶的提取
3.提取液的体积 提取液的用量增加，可提高提取率。但是过量的提取 液，使酶浓度降低，对进一步的分离纯化不利。故提取液 的用量一般为含酶原料体积的3～5倍。可一次提取，也可 分几次提取，若辅以缓侵搅拌，则可提高提取率。 4.添加保护剂 在酶提取过程中，为了提高酶的稳定性，防止酶变性 失活，可以加入适量的酶作用底物，或其辅酶，或加入某 些抗氧化剂等保护剂。
第二节 酶的提取
4.有机溶剂提取 有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多 的酶，不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液中，需用 有机溶剂提取。常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、 丙酮、丁醇等。其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强，提取 效果较好，已成功地用于琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、 胆碱酯酶等的提取。
第二节 酶的提取
一、酶提取的主要方法
根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不 同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸 溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。
第二节 酶的提取
1.盐溶液提取
大多数酶溶于水，而且在一定浓度的盐存在条件下， 酶的溶解度增加，这称之为盐溶现象，然而盐浓度不能太 高，否则溶解度反而降低，出现盐析现象。所以一般采用 稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.02～ 0.5mol/L的范围内。例如，用固体发酵生产的麸曲中的 α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mo1/L的氯 化钠溶液或0.02～0.05mol/L的磷酸缓冲液提取；酵母醇 脱氢酶用0.5～0.6mol／L的磷酸氢二钠溶液提取；6-磷酸 葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L的碳酸钠提取；枯草杆菌碱性磷 酸酶用0.1mol/L的氯化镁提取等。有少数酶，如霉菌产生 的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。
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碱溶液提取
在碱性条件下溶解度较大且稳定性较好的酶，应采用碱溶液提取。操作时pH不能过高，以免影响 酶的活性。同时加碱液的过程要一边搅拌一边缓慢加进，以免出现局部过碱，引起酶的变性失活。
有机溶液提取
与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶，可以采用能与水混溶的乙醇、丙酮、丁醇等有机溶 剂提取。例如，琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶等采用丁醇提取，都取得良好效果。
谢谢大家
2016年12月11日
提前目标
提取原则
提取方法
影响因素
提取方法
盐溶液提取 酸溶液提取 碱溶液提取 有机溶剂提取
使用的溶剂或溶液
0.02～0.5mol/L的盐溶液 PH2～6的水溶液 PH8～12的水溶液 可与水混溶的有机溶剂
提取对象
用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶 用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶 用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶
提取原则
提取方法
影响因素
b、保持生物活性
a、目的酶最大限度地 溶解出来
注意：温度升高，溶解度增加，但为防止酶 失活，一般采用低温下（0~10℃）操作。
PART.02
提取原则
提前目标
提取原则
提取方法
影响因素
相似相溶
远离等电点的pH值， 溶解度增加
PART.03
提取方法
提前目标
提取原则
提取方法
影响因素
提取液的体积对酶的提取影响
增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对
进一步的分离纯化不利。所以提取液的总量一般为原料体积的3～5倍，最好分几次提取。
内部沸腾法
内部沸腾是一种真正的内部沸腾，它 通过外部大量的热溶剂加热先渗透到物 料内部的少量解吸溶剂，并使之沸腾汽 化，产生内部对流，强化有效成分的扩 散，提取效率明显提高。
盐溶液提取
大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加， 这称为盐溶现象。当盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。 所以一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐的浓度一般控制在0.02~0.5mol/L。
酸溶液提取
有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取。提取时要注意溶液的pH不能 太低，以免使酶变性失活。例如，胰蛋白酶可用0.12mol/L的硫酸溶液提取等
酶的提取与分离纯化
环境与生物工程学院
专业：生物工程
弘德博问、和谐创新
教案：周聃一
讲解：锁进猛
教案：杨睿祎
引入课题
提取：把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将
尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。
目录页
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提取目标
提取原则
提取方法
影响因素
PART.01
提取目标
提前目标
PART.04
影响因素
提前目标
提取原则
提取方法
影响因素
温度对酶的提取影响
提取时的温度对酶的提取效果有明显影响。一般说来，适当提高温度，可以提高酶的溶 解度，也可以增大酶分子的扩散速度。
pH对酶的提取影响
溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著影响。为了提高酶的溶解度，提取时 pH值应 该避开酶的等电点。