《课程讲解》-09酶法提取和仿生提取技术00
生物酶解技术
生物酶解技术文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-天然植物有效成分的提取新技术——生物酶解技术酶是生物体活细胞产生的，以蛋白质形式存在的一类特殊的生物催化剂。
某些酶可以在常温、常压和温和的酸碱条件下，将植物细胞壁分解，较大幅度提高天然植物中有效成分的提取率，改善生产过程中的滤过速度和纯化效果，提高产品纯度和制剂的质量。
生物酶解技术包括酶法提取(又称酶反应提取)和酶法分离精制两方面。
该技术是在传统的天然植物成分提取基础上进行的，应用常规提取设备即可完成，操作简便，成本低廉。
1原理酶法提取是根据植物细胞壁的构成，利用酶反应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)水解或降解，破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取目的，且有利于提高成分的提取率。
许多天然植物中含有蛋白质，采用煎煮法时蛋白质遇热凝同，影响提取成分的煎出，如加入蛋白酶，就可以将天然植物中的蛋白质分解析出，如此可提高成分的提取率。
天然植物水提液除了含有提取成分外，还含有淀粉、蛋白质、果胶、树胶、树脂、黏液质等，这些成分的存在往往使提取液呈混悬状态，并影响提取液的滤过速度，为此要实施除杂，常用的方法有离心法、澄清剂法、醇沉法、大孔树脂吸附法、离子交换法、微孑L滤膜滤过法及超滤法。
而酶法除杂是分离精制的新方法，此方法是根据天然物提取液中杂质的种类、性质，有针对性地采用相应的酶，将这些杂质分解或除去，以改善液体产品的澄清度，提高产品的稳定性。
由于酶反应具有高度的专一性，决定了酶解方法除杂的高效性。
2酶的种类2．1 用于天然植物细胞破壁的酶2．1．1 纤维素酶纤维素是由链状结构的β-D-葡萄糖以β- l，4-葡萄糖苷键结合而成的聚合物，纤维素分子束聚集成为较大的单位——微纤丝，构成了植物细胞壁的框架，在微纤丝之间的空隙中尚有其他物质(角质、木质素、二氧化硅)，形成植物细胞壁的基本结构。
生物酶提取技术
生物酶提取技术
嘿，朋友们！今天咱来聊聊生物酶提取技术，这可真是个神奇又有趣的玩意儿啊！
你想想看，生物酶就像是大自然给我们的小魔法，藏在各种生物体内。
而我们呢，要像聪明的探险家一样，把这些小魔法给找出来，为我们所用。
那怎么提取这些生物酶呢？这可不是一件容易的事儿啊！就好像你要从一堆沙子里找出金子一样，得有耐心，还得有方法。
首先，你得选对材料。
就好比你要做一道美味的菜，得先挑好食材不是？不同的生物体内含有的酶可不一样哦，所以得精挑细选。
然后呢，就是一系列的操作啦。
这过程就像是一场精心编排的舞蹈，每个步骤都得恰到好处。
温度啦、酸碱度啦，这些都得把握得死死的，稍有偏差，可能就前功尽弃咯。
提取出来后，还得好好保存。
这就像你有了一件宝贝，得找个安全的地方放好，不然不小心弄坏了可咋办呀！
你说这生物酶提取技术难不难？那肯定难啊！但咱中国人怕啥难呀，对吧？这就好比爬山，虽然过程辛苦，但等你爬到山顶，看到那美丽的风景，一切都值了呀！
你再想想，要是没有生物酶提取技术，我们好多事情都没法干呢！比如在食品工业里，没有那些特定的酶，怎么做出美味又健康的食品呢？在医药领域，没有酶的帮忙，好多药都没法生产出来呢，那得有多少人遭罪呀！
所以说呀，生物酶提取技术可太重要啦！我们可得好好研究，把这个技术玩得团团转。
让它为我们的生活带来更多的便利和好处。
总之，生物酶提取技术就是一个充满挑战和机遇的领域，我们要勇敢地去探索，去发现其中的奥秘。
就像那句话说的：世上无难事，只怕有心人！咱中国人，一定能在这个领域闯出一片天来！加油吧！。
酶的提取与分离纯化幻灯片
密度的沉降样品
最大的沉降样品
在最前的沉降物质达 使各组分沉降到其平衡
到管底前停止，短时 的密度区，长时间，高
间，低速度
速度
密度相近，但沉降系 沉降系数相近，但密度
数不同
不同
总结：
•等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的 静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使 之包括待分离物的密度范围。 •差速离心是一种动力学方法，关键在于选择 适合于各分离物的离心力。 •密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关 键在于制备优质的密度梯度溶液。
1）超声波破碎法。 2）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等） 平衡后迅速转入低渗溶液或水中。 3）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用 丙酮、丁醇、氯仿等。 2）表面活性剂处理：常用非离子型表面 活性剂，如Triton X-100，Tween等。
注意事项
低速离心机 6000
常温，注意样品热变性和 离心管平衡
高速离心机 6000〜 25000 冷冻（防止温度升高）， 离心管的精确平衡
超速离心机 >25000
冷冻＋真空系统（减少空 气阻力和摩擦），
离心管的精确平衡
实验室离心机
温度类型：常温及 冷冻
超速离心机均为冷 冻型。
使用冷冻离心机时 提前降温，预冷离 心头。
β分级盐析法 ：在一定离子强度下，通过改变
溶液的pH及温度的沉淀方法。
酶的提取与分离纯化幻灯 片
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第一节 酶的分离
酶的工业提取PPT课件
（1）无机离子的去除
钙离子——草酸 镁离子——三聚磷酸钠 铁离子——黄血盐
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（2）杂蛋白的去除
• 1）沉淀法——pH、盐析 • 2）变性法——加热、极端pH、有机溶剂 • 3）凝聚和絮凝——电解质、有机絮凝剂 • 4）吸附法——吸附剂
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（3）色素及其他物质的去除
• 活性炭 • 离子交换树脂、离子交换纤维 • 大孔吸附树脂 • 专用脱色树脂
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亲和层析 亲和层析是利用生物分子与配基之间 所具有的专一而又可逆的亲和力，而 使生物分子分离纯化的技术。 酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅 助因子,抗原与抗体，RNA与互补的 RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子 或片段等之间，都是具有专一而又可 逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层 析在酶的分离纯化中有重要应用.
染和蛋白酶水解。 • 2.选择有效的纯化方式 （1）在不破坏待纯化酶的限度内，使用各种“激烈” 手段
。 （2）使用亲和剂进行纯化。 • 3.酶活性测定贯穿纯化过程始终。
7
5.1.2酶的组合分离纯化策略
设计分离纯化工艺的基本要求
Resolution（分辨率）
Speed（速度）
Capacity（容量）
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
高 压 细 胞 破 碎 机
细 胞 破 碎 珠
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细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
捣碎法 研磨法 匀浆法
物理破碎 化学破碎 酶促破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等
酶的提取与分离纯化幻灯片PPT
硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇
羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素
聚乙二醇（PEG） 磷酸钾、硫酸铵
硫酸钠、硫酸镁
②萃取原理： 利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。
③应用 胞内酶的提取和精制: 除去细胞碎片，并使酶得到纯化。
几种典型的双水相萃取酶蛋白实例
酶
菌种
相系统
延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 盐
天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 盐
-半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 盐 亮氨酸脱氢酶 Bacillus sp. PEG/Dex
乙醇脱氢酶 Baker’s yeast PEG/ 盐
青霉素酰化酶 E. coli PEG/ 盐
双水相萃取法的重要研究方向
--亲和萃取（亲和分配 ） 使用具有生物特异性的配基（ligand）来提高分
解或溶解度小的物质分开。 降低压力，使SCF变为气态（密度降低），溶
解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。
●常用超临界液态CO2作为萃取剂，因为： 液体CO2无毒 临界温度（304.06K）接近常温 临界压力（7.38MPa）较低 操作安全
超临界CO2萃取技术在生物、食品等工业中的应用
CO2萃取部分产品
V=V0—S—12--—SS12—
V,V0 :分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积 S2,S1:需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度
★
⑵添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的
盐浓度又Байду номын сангаас高时。
按下式计算，得表中数据
W=
B(S2-S1) —1-—AS—2 ———
A,B——常数，与温度有关。
酶工程 第四章酶的分离纯化 第二节酶的提取
第二节 酶的提取
3.提取液的体积 提取液的用量增加，可提高提取率。但是过量的提取 液，使酶浓度降低，对进一步的分离纯化不利。故提取液 的用量一般为含酶原料体积的3～5倍。可一次提取，也可 分几次提取，若辅以缓侵搅拌，则可提高提取率。 4.添加保护剂 在酶提取过程中，为了提高酶的稳定性，防止酶变性 失活，可以加入适量的酶作用底物，或其辅酶，或加入某 些抗氧化剂等保护剂。
第二节 酶的提取
4.有机溶剂提取 有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多 的酶，不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液中，需用 有机溶剂提取。常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、 丙酮、丁醇等。其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强，提取 效果较好，已成功地用于琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、 胆碱酯酶等的提取。
第二节 酶的提取
一、酶提取的主要方法
根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不 同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸 溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。
第二节 酶的提取
1.盐溶液提取
大多数酶溶于水，而且在一定浓度的盐存在条件下， 酶的溶解度增加，这称之为盐溶现象，然而盐浓度不能太 高，否则溶解度反而降低，出现盐析现象。所以一般采用 稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.02～ 0.5mol/L的范围内。例如，用固体发酵生产的麸曲中的 α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mo1/L的氯 化钠溶液或0.02～0.05mol/L的磷酸缓冲液提取；酵母醇 脱氢酶用0.5～0.6mol／L的磷酸氢二钠溶液提取；6-磷酸 葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L的碳酸钠提取；枯草杆菌碱性磷 酸酶用0.1mol/L的氯化镁提取等。有少数酶，如霉菌产生 的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。
第三章 酶的提取与分离纯化
第三章酶的提取与分离纯化第三章酶的提取与分离纯化第三章酶的提取与分离纯化◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。
◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。
1.细胞破碎细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。
表1细胞破碎方法及其原理1.1 机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。
常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。
机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。
1.2物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。
物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。
(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。
常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。
(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（ cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。
1.3化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。
常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。
1.4酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。
酶的分离提纯方法
酶的分离提纯方法《酶的分离提纯秘籍大公开》嘿，朋友！今天我要给你唠唠酶的分离提纯方法，这可是我的独家秘籍哦！听好了哈，可别走神。
首先呢，咱得准备好材料和工具，这就好比战士上战场得有称手的兵器一样。
你得有含有酶的原料，就像咱要找宝藏，得先知道宝藏在哪个地方。
然后呢，就是破碎细胞这一步啦！这就像是给细胞来个“大拆迁”。
想象一下，细胞就像一个个小房子，酶就藏在里面，咱得把这些房子给拆了，才能把酶给弄出来。
可以用各种方法，比如超声波破碎啊、研磨啊之类的，反正就是要把细胞弄破，让酶能跑出来。
接下来就是提取啦！这就像在一堆废墟里找宝贝。
把破碎后的东西放在合适的溶液里，让酶溶解在里面。
这时候可得注意啦，别把其他乱七八糟的东西也给弄进去了。
提取完了，就得进行分离啦！这一步可重要了，就像把金子从沙子里挑出来一样。
可以用各种层析的方法，比如凝胶层析啊、离子交换层析啊。
这凝胶层析就像是过筛子，大的过不去，小的就留下来啦；离子交换层析呢，就像是酶和其他东西在抢座位，合适的酶就能抢到座位留下来。
再说说过滤这一步，这就像是给酶洗个澡，把那些杂质都给冲掉。
用合适的滤膜，让干净的酶通过，脏东西就被挡住啦。
浓缩也不能少哇！把酶的溶液变得更浓一些，就像把一碗水变成半碗更精华的水。
可以用超滤啊之类的方法。
哎呀，我跟你说，我之前有一次做这个的时候，差点把细胞给弄成浆糊了，哈哈！不过没关系，咱吃一堑长一智嘛。
在整个过程中，一定要注意保持低温哦，不然酶可能就“热死”啦，这酶可娇贵着呢！还有啊，溶液的酸碱度也要注意，别把酶给弄“难受”了。
嘿，朋友，你可听好啦，这酶的分离提纯方法可都告诉你了哈。
你就按照我说的一步一步来，肯定能成功。
等你成功了，可别忘了来感谢我哦！好啦，就说到这儿啦，赶紧去试试吧！。
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寒痛定泡腾颗 芍药苷、甘草次酸 SBE>WE>SBA
粒剂
、乌头总生物碱 E>WAE
四神茶剂
补骨脂素、五味子 SBE>SBAE>W
乙素吴茱萸碱
E>WAE
几种提取方法比较
麻杏石甘汤 麻黄碱、氢氰酸、甘 SBE>WE 草次酸、钙含量、浸 膏量
参附汤
人参二醇、人参三醇、SBE>WE 附子总生物碱、酯型 生物碱、总糖、干浸 膏
另一方面也影响提取制剂的澄清度。
❖ 传统的提取方法（如煎煮、有机溶剂浸出和醇处 理方法）提取温度高，提取率低，浪费乙醇，成 本高，不安全；
❖ 选用适当的酶，可通过酶反应较温和地将植物组 织分解，加速有效成分的释放提取；选用相应的 酶可将影响液体制剂的杂质如淀粉、蛋白质、果 胶等分解去除，也可促进某些极性极低的脂溶性 成分转化为糖苷类易溶于水的成分而有利于提取。
❖将提取液的酸碱度加以生理模仿，分别用 近似胃和肠道的酸碱水溶液煮煎2~3次。先 将药粉以一定pH值的酸水提取，再用一定 pH值的碱水提取，提取液分别滤过、浓缩、 制剂。
❖对提取液的最佳pH值和其他工艺参数的选 择用一种或几种有效成分结合主要压力作 用为指标，用正交试验法、比例分割法进 行优选。
❖对单位中药或复方制剂的研究，半仿生提 取法已经显示出较大的优势和广泛的应用 前景。
❖ 适于工业化大生产，国内外均有实际利用。
❖用酶技术提取中药材成分需要选择合适的 酶。
❖目前植物提取方面研究较多的是纤维素酶， 大部分的中药材的细胞壁是由纤维素构成。 植物的有效成分往往包裹在细胞壁内；纤 维素是由β-D-葡萄糖以1，4-β葡萄糖苷键 连接，用纤维素酶可以破坏β-D-葡萄糖键， 使植物细胞壁破坏，有利于对有效成分的 提取。
乙肝颗粒剂 黄芪甲苷、柴胡皂甙 SBE>SBAE C、虎杖苷、五味子 >WE>WAE 乙素、干浸膏
❖半仿生提取法一般只适合水溶性大的极性 有效成分的提取。
❖SBE法能体现中医临床用药的综合作用特 点，符合口服给药经肠胃道转运吸收的原 理。但目前仍采取高温煎煮法，长时间高 温会影响许多有效成分活性成分，降低药 效。
❖纤维素酶用于以纤维素为主的中药材的提 取，能有效提高有效成分收率。
❖但要拓展其应用领域，还需要进一步深入 探讨酶的浓度、底物的浓度、温度、酸碱 度、抑制剂和激动剂等对提取物有何影响。
❖ 酶技术在食品工业、饲料工业、精细化工等行业 应用越来越多，在天然植物提取中的应用也在不 断发展。
❖ 单一药材补骨脂、香菇、银杏叶、决明子、黄连、 穿心莲、葛根等有效成分提取和除去杂质。中药 复方“生脉饮”。黄柏提取小檗碱、穿山龙提取 薯蓣皂甙元、穿心莲提取穿心莲内酯之前用纤维 素酶预处理，可以有效提高目标成分的收率。
现代提取技术之七， 酶法提取，八，仿生提取技术
七、酶法提取工艺
❖ 酶（enzyme）是具有特殊催化活性的蛋白质。 ❖ 酶提取技术是近几年用于中药工业的一项生物工
程技术。 ❖ 中草药成分复杂，除有效成分外，还有蛋白质、
果胶、淀粉、植物纤维等非需要成分。 ❖ 这些成分一方面影响植物细胞中活性成分的浸出，
半仿生提取法的特点
❖ 1，提取过程符合中医配伍和临床用药的特点和口 服药物在胃肠道运转吸收的特点。
❖ 2，在具体工艺选择上，既考虑活性混合成分又以 单体成分作指标，这样不仅能充分发挥混合物的 综合作用，还能利用单体成分控制中药制剂的质 量。
❖ 3，有效成分损失少，成份低，生产周期短。
半仿生提取法的具体操作
八、仿生提取技术
❖仿生提取源于仿生学原理，是模拟口服药 经肠胃道环境运转原理而设计，目的是尽 可能地保留原药中的有效成分（包括在体 内有效的代谢物、水解物、螯合物或新的 化合物）。
❖打破了以往只提取单一有效成分的西医西 药模式，符合中医药传统哲学的整体观、 系统观，体现了中医药多种成分复合作用 的特点。
应用酶法提取技术注意事项
❖1，不同的药材选用不同的酶，根据药材性 质、提取的成分和要除去的杂质进行选择。
❖2，进行酶的专有活性研究以后是应提取过 程中的不同要求，要考虑应用的一组酶之间 的协同关系和使用酶的浓度、底物、抑制剂、 激动剂等。
❖3，药材的预处理如粉碎、球磨等。
❖4，媒介的设备与工艺参数，粉碎设备、反 应设备、后处理设备等。
❖整体作用大于各孤立部分 作用的总和
❖
-----贝培朗菲
方法
❖该法是以人工胃、人工肠为基础，依据正 交试验法或均匀设计法、比例分割法，优 选最佳条件（例如：pH值、温度、时间、 酶/底物浓度等），并加以搅拌设备（模拟 胃肠道蠕动）。
（一）半仿生提取技术及其应用
❖半仿生提取法（semi-bionic extraction method,简称SBF）是将整体药物研究法与 分子药物研究法相结合，从生物药剂学的角 度，模拟口服给药及药物经胃肠道转运的原 理，为经消化道给药的中药制剂设计的一种 新的提取工艺。
❖因提取条件不可能与人完全相同，所以称为 “半仿生提取”。
❖在工艺条件方面如选择适宜水域药材之比、 pH值、温度、时间等。
❖酶技术用于药材提取，反应温和，提取效 果较好，收率高，节约能耗，应用前景广 阔。
❖由于酶具有专一性和选择性的特点，故使 用时应考虑采用复合酶。
❖单一药材含有的成分相对较少，复合酶的 选择相对简单。但复方中药成分多而复杂， 选择较为困难。
❖四种方法比较：
❖SBE：半仿生提取法
❖SBAE：半仿生提取醇沉法
❖WE：水提取法
❖WAE：水提取法醇沉法
几种提取方法比较
复方制剂
指标成分
比较结果
芍甘止痛颗粒 芍药苷、甘草次酸 SBE>SBAE>W
剂
E>WAE
当归苦参丸 阿魏酸、苦参碱、 SBE>WE 苦参总碱、干浸膏
黄连解毒颗粒 小檗碱、黄芩苷、 SBE>SBAE>W
（二）仿生提取法及其应用
❖ 1，原理与方法
❖ 仿生提取法综合运用医学仿生（人工胃、人工肠） 与化学仿生（酶的应用）的原理，同时又将整体 药物研究（仿生提取法所得提取物更接近药物在 体内达到平衡后的有效成分群）与分子药物研究 法（以单一单体为指标）相结合，是将生物技术 手段应用到中药研究中的一种尝试，集中体现了 中医药基本理论的整体观、系统观。