高效液相色谱法检测水产品中的孔雀石绿和结晶紫

第29卷 第1期 广东海洋大学学报 V ol.29 No.12009年2月 Journal of Guangdong Ocean University Feb. 2009收稿日期：2008-10-10基金项目：广东省重大科技兴海项目（B200701A06）第一作者：吴仕辉（1980－），女，硕士，研究实习员，从事水产品质量安全研究。

E-mail ：wshxjw@高效液相色谱法检测水产品中的孔雀石绿和结晶紫吴仕辉，朱新平，郑光明，陈昆慈，戴晓欣，潘德博（中国水产科学研究院珠江水产研究所，广东 广州，510380)摘 要：样品中的孔雀石绿、结晶紫经试剂盒提取，浓缩后用经固相萃取柱净化、硼氢化钾还原、反向色谱柱分离，使用荧光检测器检测，孔雀石绿、结晶紫的加标回收率在76.1 %～92.5 %之间，相对标准偏差1.9 %～5.8 %，检出限均为0.5 µg/kg 。

结果表明：该方法检测孔雀石绿（MG ）、结晶紫（GV ）处理简单，灵敏度高，节省时间，可用于大量样品的快速分析。

关键词：水产品；孔雀石绿；结晶紫；检测；高效液相色谱法（HPLC ）中图分类号：S948 文献标志码：A 文章编号：1673-9159(2009)01-0054-04Determination of Malachite Green and Gentian Violet Residues in Fishery Products by High Performance Liquid Chromatography(HPLC)with Fluorescence DetectorWU Shi-hui, ZHU Xin-ping, ZHENG Guang-ming, CHEN Kun-ci, DAI Xiao-xin, PAN De-bo (Pearl River Fishery Research Institute , Chinese Academic of Fishery Science , Guangzhou , 510380 Chin a )Abstract: M alachite green and gentian violet residues in fishery products were determined by high performance liquid chromatography method coupled with fl uorescence detector. Samples were extracted by pre-treatment kit for extraction of MG, LMG, GV, LGV and purified by solid-phase extraction cartridges. After concentrated, samples were deoxidized by potassium borohydride. The MG and GV were detected with FLD detector after C18 column separation. The recoveries for fortified fish tissue were 76.1 %～92.5 %, The relative standard deviation(RSD) values for repeatability were 1.9 %～5.8 %．The detection limit for MG and CV was 0.5 µg/kg, respectively.Key words: fisher product ；malachite green ；gentian violet ; detection ; HPLC孔雀石绿、结晶紫属于三苯甲烷类染料，这两种化合物对鱼类的水霉病、寄生虫病等有很好的疗效，长期以来许多国家曾将其作为水产养殖业的杀菌剂。

它们在鱼体内可分别代谢为无色孔雀石绿和无色结晶紫，由于其母体化合物和代谢物均具有潜在的致癌、致畸、致突变等副作用，20世纪90年代以来许多国家都将其列为水产养殖的禁用药物。

但是由于其抗菌效果好、价格便宜，不少业户仍在违规使用，因此孔雀石绿残留监控就显得格外重要。

目前孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的检测方法主要有高效液相色谱法[1-3]和液质联用法[4-5]。

我国于2006年发布有关的水产行业标准（SN/T1768- 2006）[6]及国家标准（GB/T20361-2006）[7]。

行业标准SN/T1768-2006前处理简单，但是满足不了检测限0.5 µg/kg 的要求。

其他方法的前处理均需多次萃取，多次离心，操作烦琐，前处理时间长，有机溶剂用量大，实际检测工作中存在困难。

本文综合各个方法标准中快速和灵敏的优点，建立了同时检测孔雀石绿及代谢物无色孔雀石绿总量，结晶紫以及代谢物无色结晶紫总量的液相色谱方法。

1材料与方法1.1实验样品加州鲈，采自广东省广州市芳村好又多超市加州鲈活样品，取其肌肉，各自用均质机混均，每个样品各400 g，于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 试剂和溶液孔雀石绿标准品：纯度97.2 %；结晶紫标准品：纯度93.9 %；孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒，由中国检验检疫科学研究院北京陆桥商检新技术公司生产。

酸性氧化铝固相萃取柱（500 mg，3 mL），PRS固相萃取柱（500 mg，3 mL），乙腈为色谱纯，无水乙酸铵、冰乙酸、对-甲苯磺酸、乙酸钠、硼氢化钾均为分析纯，实验用水为去离子水。

孔雀石绿标准储备液：100 µg/mL孔雀石绿乙腈溶液;结晶紫标准储备液：100 µg/mL结晶紫乙腈溶液;孔雀石绿、结晶紫混合标准中间溶液：10 µg/mL;乙酸钠缓冲液：0.06 mol/L乙酸钠+0.005 mol/L 对甲苯磺酸，pH4.5;乙酸铵缓冲溶液：0.125 mol/L，pH 4.5;硼氢化钾溶液：0.07 mol/L，现配现用;洗脱液：乙酸乙酯∶甲醇∶氨水体积比10∶9∶1。

1.3 仪器与色谱条件仪器：Agilent1200型高效液相色谱仪、均质机、离心机、振荡器、旋转蒸发器、固相萃取装置、氮吹仪。

色谱条件：色谱柱，Eclipse-C18 250 mm×4.6 mm，粒度5 µm；流动相，乙腈+乙酸铵缓冲液（pH 4.5）=80+20；流速 1.5 mL/min；柱温35 ℃；激发波长265 nm, 发射波长360 nm；进样量20 µL。

1.4 样品预处理提取：准确称取5.00 g已搅碎的样品于50 mL 离心管中，加入孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中提取剂1（20mL，由有机化学试剂组成的混合液体试剂）和提取剂2（由无机化学组成的混合粉末试剂），8 000 r/min的速度均质30 s，振荡2 min，4500 r/min离心5 min，取上清液10.0 mL于鸡心瓶中，45 ℃水浴旋转蒸发至近干，用2.5 mL 乙腈溶解残渣。

净化: 将PRS柱安装在固相萃取装置上，上端串联酸性氧化铝柱，用5 mL乙腈活化，转移提取液到柱上，再用2.5 mL乙腈洗涤瓶一次，过柱，重复操作一次，去掉酸性氧化铝柱，用5 mL乙腈清洗PRS柱，氮吹PRS柱至近干，在不抽真空的情况下，加入5 mL洗脱液洗脱，收集全部洗脱液，氮气吹至近干，加0.4 mL硼氢化钾溶液，还原，静置20 min，用乙腈定溶至1.0 mL，经聚四氟乙烯膜过滤后上机分析。

1.5 样品测定在临用前准确吸取一定量的混合标准中间溶液，加入0.4 mL硼氢化钾溶液，用乙腈准确稀释至2.0mL，配制适当浓度的混合标准工作液。

在上述色谱条件下，分别测定孔雀石绿、结晶紫混合标准工作溶液及样品提取溶液中的孔雀石绿、结晶紫，外标法定量。

1.6准确度和精密度实验以本底无孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫的加州鲈为样品，平行称取3份样品，按5 µg/kg、10 µg/kg、20 µg/kg三个加标浓度进行加标，按上述步骤进行前处理和色谱测定，分别测定各次的峰面积，计算样品中孔雀石绿、结晶紫的含量，计算回收率。

另取6个平行样品，采用添加法分别添加等量孔雀石绿、结晶紫混合标准溶液，按上述步骤进行前处理和色谱测定，分别测定各次的峰面积,计算样品中孔雀石绿、结晶紫的含量，计算相对标准偏差。

1.7 计算以标准工作液峰面积和浓度作工作曲线，根据样品提取液的峰面积，从工作曲线计算样品提取液中孔雀石绿、结晶紫的残留量，按式⑴计算样品中孔雀石绿、结晶紫残留量。

计算结果需扣除空白值。

mVCX2××=⑴式中：X—试样中的孔雀石绿、结晶紫的残留量，µg/kg；C—样品提取液中孔雀石绿、结晶紫的残留量，ng/mL；V—最终定容体积，mL；m—样品质量，g。

2结果2.1孔雀石绿、结晶紫标准色谱图本实验选定色谱条件下孔雀石绿、结晶紫的保留时间分别为为7.9 min、8.5 min左右，图1为标准溶液浓度为30 ng/ mL的标准色谱图。

2.2 标准曲线以HPLC测得的峰面积y为纵坐标，相应的浓度x为横坐标绘制标准曲线，其线性关系和相关系广 东 海 洋 大 学 学 报 第29卷56数见表1。

结果表明，孔雀石绿、结晶紫在1.0 ng/mL ～500 ng/mL 范围内线性良好，可以满足定量分析的需要。

表1 线性回归方程、相关系数、线性范围Tab.1 Regression equation 、coefficient and linear range2.3 回收率、精密度和灵敏度加州鲈空白肌肉组织样品中分别添加3个浓度水平的孔雀石绿、结晶紫标准溶液，进行回收率测定，回收率测定结果见表2，加标样品图谱见图2。

由表2可以看出，孔雀石绿、结晶紫加标浓度在5 µg/kg ～20 µg/kg 内，回收率为76.1 ％～92.5 ％。

六个平行样品测定结果的相对标准偏差（RSD ）分别为：孔雀石绿，5.6％；结晶紫，4.5％，重现性能满足要求。

以信噪比S/N=3计算，样品中孔雀石绿、结晶紫的检出限均为0.5 µg/kg 。

表2 样品加标回收率及RSD （n =3） Tab.2 Recoveries of spiked samples and RSDs 化合物 样品含量/(µg·kg -1)加标浓度 /(µg·kg -1)平均回收率/% RSD/%5 92.5 5.5孔雀石绿(MG)0 10 84.1 4.320 86.2 3.80 5 76.1 5.8结晶紫(GV) 10 80.7 2.320 88.3 1.9化合物线性回归方程相关系数 线性范围孔雀石绿MG y =0.7146x -3.5602 0.9998 1.0～500结晶紫GVy =0.9834x -3.7908 0.9996 1.0～500t /min响应值/L U6 5.5 5 4.5 41 23 4 56 78 93讨论3.1净化条件的选择样品经孔雀石绿快速前处理试剂盒提取后，如果不进一步净化，直接上机用荧光检测器检测，干扰严重。